Dispositivos microestructurados para microinyección optimizado y la proyección de imagen de larvas de pez cebra

El objetivo general de esta metodología es hacer que la microinyección de larvas de pez cebra sea más fácil y precisa. Este método ayuda a los investigadores que utilizan sistemas modelo de pez cebra a inmovilizar larvas de pez cebra en orientaciones específicas en grandes conjuntos. La técnica permite un acceso más fácil a tejidos específicos para la microinyección y la obtención de imágenes, y es muy eficaz cuando se requiere un gran número de larvas para aplicaciones como modelos de cáncer de infección o xenoinjerto.

Mis estrategias de fabricación en modelos de pez cebra son altamente complementarias. Uno es hecho por el hombre y simple. La otra es viva y compleja.

Ambos comparten la misma escala de tamaño. Ambos son transparentes. Y ambos permiten observaciones con una resolución de una sola célula.

Como se muestra aquí, se pueden combinar fácilmente y podrían tener aplicaciones en el estudio de prácticamente cualquier enfermedad importante. Después de preparar un bloque de PDMS en una placa de Petri cubierta por una película delgada de E-3, de acuerdo con el protocolo de texto, use una pipeta de transferencia para transferir el número requerido de embriones a la superficie del bloque de PDMS. Con un lazo para el cabello o una herramienta similar, empuje los embriones hacia las hendiduras de la microestructura, particularmente para las orientaciones dorsal y ventral.

Al cargar las larvas en las hendiduras, es importante tener suficiente agua cubriendo el bloque de PDMS para permitir una fácil manipulación. También es importante empujarlos dentro de las hendiduras para que permanezcan en su lugar durante la inyección. Para orientar el pez cebra en canales de microestructura previamente preparados de acuerdo con el protocolo de texto, use una pipeta de transferencia para extraer E-3 del bloque PDMS con patrón.

El nivel de E-3 debe caer por debajo del borde del bloque, pero aún debe estar presente en el embalse y los canales, y queda una capa delgada en el PDMS. Con una pipeta de transferencia, transfiera 10 embriones anestesiados al depósito, teniendo cuidado de no desbordar los bordes. Con un lazo para el cabello, manipule cada embrión en la cabeza del embudo, primero en la entrada del canal apropiado, asegurándose de que el embrión tenga la orientación adecuada cuando ingrese al canal.

Luego, use un lazo de cabello para deslizar cada embrión por el canal, hasta que alcance las microcaracterísticas de orientación en las paredes del canal que lo mantienen en su lugar. Después de la preparación de las agujas de microinyección y la solución de microinyección, utilice una punta de pipeta finamente cónica para cargar cinco microlitros de la solución en la aguja. Monte la aguja en un micromanipulador montado en un soporte magnético y conéctelo a un microinyector de bomba PICO.

Luego, use fórceps para romper la punta de una aguja en un ángulo de 45 grados pellizcando la punta cónica. Ajuste el tamaño del bolo de inyección a un nanolitro ajustando el tiempo de inyección en el controlador de la bomba PICO. Ajuste el ángulo de la aguja de microinyección en el controlador de micromanipulación, comenzando con 45 grados con la aguja paralela a la longitud del embrión.

Se puede utilizar un ángulo más pronunciado para minimizar el movimiento lateral del embrión durante la microinyección. Controlando la placa de Petri con la mano izquierda, y la necesidad de un micromanipulador con la derecha, acerque la aguja lo más posible al sitio previsto de la microinyección, como la vesícula ótica. Con el controlador de micromanipulación, inserte la aguja en el tejido objetivo y use el interruptor de pie de la bomba PICO para inyectar el volumen preestablecido.

Si el pañuelo se resiste a la penetración, golpee suavemente la perilla del controlador de micromanipulación. Para liberar los embriones, use una pipeta de transferencia para hacer fluir E-3 sobre la superficie de arriba a abajo, o girando el plato de manera que los embriones se liberen en el E-3 circundante. Transfiera los embriones a una placa de recuperación de E-3 sin MS-222.

Para examinar los embriones utilizando el dispositivo PDMS en los pocillos de una placa de seis pocillos, utilice una pipeta de 1.000 microlitros o una pipeta de transferencia de punta estrecha para cebar el dispositivo haciendo fluir E-3 a través del puerto. Use E-3 y MS-222 para llenar el pozo hasta que el dispositivo esté cubierto. A continuación, utilice una pipeta de transferencia para introducir cuatro embriones previamente inyectados en cada pocillo.

Con un lazo para el cabello o una herramienta similar, coloque los embriones en las entradas de los canales de imagen en la orientación deseada y empújelos parcialmente en el dispositivo. Esto ayudará a atraerlos al dispositivo de manera uniforme. Con una pipeta de 1.000 microlitros o una pipeta de transferencia, extraiga E-3 a través del dispositivo desde el puerto hasta que los embriones se introduzcan en los canales en la orientación correcta para la obtención de imágenes.

Transfiera la placa de pocillos a un microscopio fluorescente invertido. Para obtener imágenes de los embriones, ajuste el aumento seleccionando la lente adecuada, como 10x para obtener imágenes de la migración de neturaohil del pez cebra. Ajuste la intensidad de la fuente de luz y el tiempo de exposición para cada canal, de modo que cada señal sea clara, pero no saturada.

Por último, capture imágenes para cada canal fluorescente y transmitido. Utilizando el dispositivo de canal microestructurado para estabilizar embriones en la orientación lateral, se probó la capacidad de los neutrófilos para responder a los quimioatrayentes estándar fMLP y LTB4 microinyectados en las vesículas óticas, de dos días después de la fertilización de embriones de pez cebra. Para visualizar el reclutamiento de neutrófilos, se trazaron inyecciones con rodamina dextrano de alto peso molecular y se realizaron en embriones transgénicos con neutrófilos fluorescentes verdes.

Los embriones no inyectados y los embriones inyectados con rodamina sola se utilizaron como controles negativos. Después de la microinyección, los embriones se transfirieron al dispositivo de canal de imagen y se obtuvieron imágenes con un microscopio fluorescente EVOS a los 30 minutos y cinco horas después de la inyección. Como se esperaba, se reclutó un pequeño número de neutrófilos fluorescentes para la vesícula ótica inyectada simuladamente en el momento temprano, probablemente debido a un reclutamiento mediado dañado.

Curiosamente, se observó que el trazador de rodamina dextrano se acumulaba en los otolitos durante el experimento. Para ambos quimioatrayentes, los neutrófilos se reclutaron en mayor número, particularmente en respuesta a LTB4. Una vez dominada, esta técnica puede mejorar en gran medida la velocidad y la precisión de la microinyección de pez cebra.

El desarrollo de esta técnica fue impulsado por desafíos específicos en nuestro laboratorio. Hemos refinado este enfoque para adaptarlo a las necesidades de nuestros proyectos sobre infecciones fúngicas y xenoinjertos tumorales en modelos de pez cebra. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar matrices de superficie microestructuradas para la microinyección de pez cebra y para imágenes en vivo extendidas.