Fabricación, pruebas y uso de microelectrodos selectivos de Ion potasio en rebanadas del tejido del cerebro adulto

El objetivo general de esta técnica es fabricar, calibrar y utilizar microelectrodos selectivos de iones de potasio monopolares. El uso de estos electrodos permite la evaluación cuantitativa de la dinámica de la concentración de iones de potasio evocados en cortes de cerebro de adultos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en fisiología, como la identificación de los mecanismos celulares y moleculares de la homeostasis de iones de potasio en el sistema nervioso central.

La principal ventaja de esta técnica es que, además de ser un método de fabricación fácil y directo, los sensores de microelectrodos representan el estándar de oro para la medición de la concentración de iones de potasio. Para preparar los capilares de vidrio de borosilicato para la silanización, colóquelos en un tubo cónico de 50 mililitros. Llene el tubo cónico con ácido clorhídrico de un molar e incube los capilares de vidrio en ácido clorhídrico con agitación suave durante la noche durante un mínimo de seis horas.

Después, enjuague brevemente los capilares con etanol al 70% y luego séquelos completamente a 100 a 120 grados centígrados durante seis a ocho horas. Almacene los capilares lavados en recipientes con desecante de sulfato de calcio anhidro hasta por cuatro semanas antes de su uso posterior. Antes de la silanización, tire de los capilares hasta una punta fina con un extractor de microelectrodos.

Luego, coloque los microelectrodos en un recipiente de vidrio con cinta adhesiva esterilizable en autoclave, de modo que los electrodos se eleven desde la parte inferior para evitar la rotura de la punta. A continuación, retire aproximadamente 0,5 mililitros de solución de silanización al 5%DDS de su recipiente utilizando el método de reemplazo de nitrógeno. Llene un globo con gas nitrógeno y conecte una jeringa o tubo y una aguja al globo.

A continuación, inserte la aguja en el recipiente de DDS mientras extrae el DDS en una jeringa separada a través de una aguja más larga. A continuación, aplique la solución de silanización gota a gota en las puntas de las pipetas y cubra inmediatamente el recipiente. Coloque el recipiente que contiene los microelectrodos con solución de silanización en un horno de laboratorio precalentado a 170 a 180 grados Celsius durante 10 a 12 horas o a 200 a 220 grados Celsius durante 30 minutos.

Después de la incubación, retire la placa del horno. Coloque el plato en un banco a temperatura ambiente durante 10 a 15 minutos para permitir que la cristalería se enfríe. Retire los microelectrodos de la placa y colóquelos en un recipiente hermético lleno de desecante.

Los microelectrodos silanizados que se mantienen libres de humedad se pueden utilizar hasta una semana después de la silanización. Para cebar los electrodos, prepare una solución madre de cóctel de ionóforos de potasio y manténgala en un recipiente hermético y opaco a temperatura ambiente. A continuación, prepare una solución madre de cloruro de sodio de 300 milimolares tamponado con HEPES 10 milimolares a pH 7,4.

Fije el electrodo en una abrazadera. Posteriormente, con un instrumento romo, rastrille la punta del electrodo hasta aproximadamente 10 a 20 micrómetros de ancho, luego rellene el electrodo con el cloruro de sodio tamponado con HEPES utilizando una punta MicroFil de calibre 28 conectada a una jeringa. Observe que la solución salina ha llegado al extremo de la punta del microelectrodo y asegúrese de que el microelectrodo esté libre de burbujas grandes que puedan interferir con el flujo de corriente.

Con una micropipeta, aplique una pequeña gota de ionóforo de potasio cerca de la punta del microelectrodo. Si el electrodo se ha silanizado correctamente, la gota será absorbida por la punta rota. Llene el electrodo hasta aproximadamente 1 milímetro con el ionóforo de potasio y retire el exceso con papel de seda.

Para calibrar los microelectrodos, burbujee todas las soluciones de calibración y corte las soluciones tampón con 95% de oxígeno/5% de dióxido de carbono durante al menos 20 minutos antes de comenzar el experimento. Comience a perfundir el baño con ACSF que contiene iones de potasio de 4,5 milimolares a una velocidad de tres mililitros por minuto. Coloque el electrodo selectivo de iones de potasio en el portaelectrodos conectado a la etapa principal del electrodo en el manipulador.

A continuación, inserte la punta del electrodo en la perfusión del baño. Asegúrese de que el electrodo de tierra de plata/cloruro de plata esté bañado en la misma solución y que el flujo sea constante. Aplique soluciones de calibración paso a paso y registre los cambios potenciales en milivoltios en la punta del electrodo.

Espere a que el potencial en la punta del electrodo alcance un valor estable antes de cambiar a la siguiente solución. Luego, mida el cambio de voltaje en estado estacionario en respuesta a la aplicación de las soluciones de calibración a la punta del electrodo. Confirme que la pendiente de la respuesta de voltaje del electrodo sea de al menos 52 y no mayor de 59 milivoltios por cambio de diez veces en la concentración de potasio.

Para preparar las rodajas del hipocampo, haz una incisión de dos a tres centímetros desde la porción caudal del cráneo para cortar el cuero cabelludo a lo largo de la línea media. Mientras retrae manualmente el cuero cabelludo, haga dos incisiones horizontales de un centímetro desde el foramen magnum a lo largo de los lados del cráneo. Luego, con unas tijeras finas, haga una incisión a lo largo de la línea media desde la parte posterior del cráneo hasta la nariz.

A continuación, inserte pinzas finas cerca de la línea media y retraiga el cráneo inciso en dos porciones. Extraiga el cerebro de ratón del cráneo y use una cuchilla para eliminar el cerebelo, la corteza prefrontal y los bulbos olfativos, que se encuentran respectivamente en las porciones caudal y rostral del cerebro. A continuación, monta el bloque cerebral en la bandeja del vibrátomo con Super Glue.

Llene la bandeja del vibratomo con una solución de corte helada. Después, corte secciones de tejido en la planicie coronal de 300 micrómetros de grosor. Por lo general, se pueden recolectar de cuatro a seis cortes coronales del hipocampo.

Después de cortar cada sección, transfiera inmediatamente la loncha al vaso de precipitados que contiene las lonchas calentado a una temperatura de 32 a 34 grados centígrados. Mantenga las secciones a esta temperatura durante 20 minutos antes de transferir el vaso de precipitados con las secciones a temperatura ambiente durante al menos 20 a 30 minutos antes de grabar. Para medir la dinámica de los iones de potasio, coloque suavemente el trozo de cerebro en la bañera con una pipeta Pasteur y manténgalo suavemente en su lugar con un arpa de platino con cuerdas de nylon.

Asegúrese de que las puntas del electrodo estimulante bipolar estén aproximadamente paralelas entre sí y estén niveladas con la plana de la rebanada. En el transcurso de cinco a siete segundos, inserte lentamente los electrodos en el estrato radiado CA3 de aproximadamente 40 a 50 micrómetros de profundidad para estimular las garantías Schaffer. Luego, inserte con cuidado el electrodo selectivo de iones de potasio en el estrato radiático CA1 a aproximadamente 50 micrómetros de profundidad bajando lentamente el electrodo durante aproximadamente tres a cuatro segundos.

Permita que el potencial se estabilice a través del electrodo antes de aplicar estimulaciones a la rebanada, lo que generalmente toma de cinco a 10 minutos. Si la rebanada presenta cambios espontáneos excesivos en las concentraciones de iones de potasio extracelulares, deséchela y repita el proceso con una nueva rebanada. Para medir la liberación de iones de potasio evocados, aplique trenes de estimulación eléctrica a través del aislador de estímulo mientras registra digitalmente las respuestas.

Aplique la estimulación a 10 hercios y un milisegundo por pulso a partir de una amplitud de estímulo de 10 microamperios. Aplique amplitudes de estimulación crecientes por un factor de dos hasta que se detecte una amplitud máxima de respuesta de potasio. Si no se observa ninguna respuesta, acerque la posición del electrodo selectivo de iones de potasio al sitio de estimulación en incrementos de 100 micrómetros.

Para confirmar que los cambios en la concentración de iones de potasio están mediados por el potencial de acción de los colaterales Shaffer activados eléctricamente, aplique TTX de 0,5 micromolares en ACSF durante 10 minutos y repita el protocolo de estimulación. No se deben observar respuestas evocadas. Después de cebar los electrodos con la solución salina tamponada con HEPES y el ionóforo de potasio, se puede probar la respuesta rápida de los electrodos a los cambios escalonados en las concentraciones de iones de potasio del baño y la respuesta lineal a los cambios de iones de potasio del baño en el rango de calibración de 0,1 a 100 milimolares de una manera predicha por la ecuación de Nernst.

El potencial de estado estacionario se puede trazar contra la concentración de iones de potasio del baño para determinar la pendiente de la línea, que debe ser de aproximadamente V 58,2 milivoltios y no menos de 52 milivoltios por cambio de diez veces en la concentración de iones de potasio. Se probó más a fondo la capacidad de respuesta de los electrodos selectivos de potasio y se observó la respuesta a un aumento de 5,5 milimolares en el potasio con constantes de tiempo de aumento y decaimiento de aproximadamente 85 milisegundos. Una vez que los electrodos estimulantes y selectivos de iones de potasio se han colocado en el tejido y el registro ha alcanzado una línea de base estable, se pueden aplicar pulsos de amplitud de corriente creciente.

La forma de onda de esta actividad aparece como un rápido aumento de potasio con una tasa de decaimiento exponencial, que se elimina con la aplicación de TTX. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en aproximadamente tres o cuatro horas si se realiza con cuidado y precisión. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la punta del electrodo debe mantener la punta del electrodo lo más pequeña posible para permitir grabaciones precisas, pero lo suficientemente grande como para permitir un bajo nivel de ruido.