Name: Fabricación, pruebas y uso de microelectrodos selectivos de Ion potasio en rebanadas del tejido del cerebro adulto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-07T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Aprende a fabricar y calibrar microelectrodos selectivos de ion potasio para medir dinámicas de potasio en rebanadas de hipocampo adulto. Este método permite evaluar cuantitativamente la homeostasis de potasio en el sistema nervioso central.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

El laboratorio de Khakh fue apoyado por los NIH MH104069. El laboratorio de Mody fue apoyado por NIH NS030549. J.C.O. gracias la Grant(NS058280) de formación Microcircuitos neuronales NIH T32.

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con el Instituto Nacional de salud guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio y fueron aprobados por el Comité de investigación Animal del Canciller de la Universidad de California, Los Ángeles. Todos los ratones estaban alojados con disposición comida y agua ad libitum en un entorno de luz-oscuridad de 12 h. Todos los animales estaban sanos sin cambios de conducta evidentes, no participaron en los estudios anteriores y fueron sacrificados durante el ciclo de luz. Se recolectaron datos de experimentos de ratones adultos (6-8 semanas para todos los experimentos).
1. preparación de microelectrodos selectivos K+
<ol><li>Silanización del vidrio de borosilicate<ol>
<li>Retire suficiente Capillares de vidrio de embalaje y coloque en un tubo cónico de 50 mL. Llene el tubo cónico hacia arriba con electrodos de 1 M HCl. lavado con agitación suave ácido clorhídrico durante la noche o por un mínimo de 6 horas.</li>
		<li>Enjuague los tubos capilares con etanol al 70% y séquelo completamente a 100-120 ° C durante 6-8 horas. Almacene lavados capilares en envases con desecante sulfato de calcio anhidro para hasta 4 semanas antes de su uso posterior.</li>
		<li>Antes de silanización, tire los capilares a una punta fina usando un extractor de microelectrodos. Los microelectrodos que utilizamos son aproximadamente 2-5 micras de diámetro. Manipule siempre lavados capilares con guantes, como los aceites de la piel pueden interferir con silanización.</li>
		<li>Colocar microelectrodos en un recipiente de vidrio para que los electrodos se elevan de la parte inferior para evitar la rotura de la punta. Fijar los microelectrodos al contenedor usando cinta de autoclave o similar cinta adhesiva.</li>
		<li>Retire aproximadamente 0,5 mL de solución de silanización de Diclorodimetilsilano 5% (DDS) de su envase usando el método de sustitución del nitrógeno (ver figura 2). Llenar un globo con gas nitrógeno y coloque una jeringa o tubo y aguja en el globo. Inserte la aguja en el recipiente DDS mientras elaboración de DDS en una jeringa separada a través de una aguja más larga.</li>
		<li>Aplique la solución de silanización gota a gota a las puntas de las pipetas y cubrir inmediatamente. Coloque el recipiente con los microelectrodos con solución de silanización en un horno de laboratorio (170-180 ° C) precalentado durante 10-12 horas o a 200-220 ° C durante 30 minutos</li>
		<li>Después de la incubación, apague el horno y luego retire la placa del horno. Tenga cuidado al retirar la placa de la incubadora, ya que es muy caliente. Coloque la placa en un banco a temperatura ambiente durante 10-15 minutos para permitir que el vidrio se enfríe.</li>
		<li>Quite los microelectrodos de la placa (usando una hoja de afeitar u hoja de bisturí para cortar la cinta) y colocarlos en un recipiente hermético relleno desecante. Silanizada microelectrodos mantenidas libres de humedad se pueden utilizar hasta 1 semana después de silanización.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cebado de los electrodos<ol>
<li>Preparar una solución madre de K+ ionóforo cóctel: valinomycin w/v de 5%, 93% v/v 1, 2-dimetil-3-nitrobenceno, potasio 2% w/v tetrakis(4-chlorophenyl) borato11. Esta solución tiene un color amarillo débil. Mantener en un recipiente hermético, opaco a temperatura ambiente. Si se almacena correctamente esta solución puede durar muchos meses.</li>
		<li>Preparar una solución stock de 10 mM HEPES tamponado con 300 mM de NaCl a pH 7.4. Fijar el electrodo en una abrazadera y rellene con el NaCl tamponada usando una punta de microfil 28G conectada a una jeringa. Observar que la solución salina ha llegado al final de la punta del microelectrodo. Confirmar que el microelectrodo está libre de grandes burbujas que podrían interferir con el flujo de corriente.</li>
		<li>Romper la punta del electrodo a aproximadamente 10-20 μm de ancho, usando el lado Romo de un bisturí o una cuchilla de afeitar.</li>
		<li>Usando una micropipeta, aplique una pequeña gota (~0.1 μl) del ionóforo K+ cerca de la punta del microelectrodo. Si el electrodo ha sido correctamente silanizada que será absorbida en la gota en la punta rota. Llenar el electrodo 1-2 mm con el ionóforo K+ y quitar exceso con papel de seda.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. calibración de microelectrodos selectivos K+
<ol><li>Preparación de soluciones de calibración<ol>
<li>Preparar soluciones de diferentes concentraciones de KCl en igual osmolaridad del líquido cerebroespinal artificial (ACSF) sustituyendo la NaCl con KCl. Usamos 0.1, 1, 4,5, 10 y 100 mM K+ ACSF, para la calibración de los electrodos. Las recetas de estas soluciones de calibración se enumeran en la tabla 1.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td rowspan="2">Producto químico</td>
			<td>MW</td>
			<td rowspan="2">final mM</td>
			<td rowspan="2">0,1 mM [K +]</td>
			<td rowspan="2">1 mM [K +]</td>
			<td rowspan="2">4.5 mM [K +]</td>
			<td rowspan="2">10 mM [K +]</td>
			<td rowspan="2">100 mM [K +]</td>
		</tr>
<tr>
<td>(g / mol)</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
			<td>58.44</td>
			<td>varía</td>
			<td>1,51 g</td>
			<td>1.50 g</td>
			<td>1,44 g</td>
			<td>1,4 g</td>
			<td>0,345 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
			<td>Stock de 1 M</td>
			<td>varía</td>
			<td>20 μl</td>
			<td>200 μL</td>
			<td>900 μl</td>
			<td>2 ml</td>
			<td>20 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>Stock de 1 M</td>
			<td>2</td>
			<td colspan="5">400 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2
</td>
			<td>Stock de 1 M</td>
			<td>1</td>
			<td colspan="5">200 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaH2PO4
</td>
			<td>119.98</td>
			<td>1.2</td>
			<td colspan="5">0,29 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO3
</td>
			<td>84.01</td>
			<td>26</td>
			<td colspan="5">g 0,437</td>
		</tr>
<tr>
<td>D-glucosa</td>
			<td>180.16</td>
			<td>10</td>
			<td colspan="5">0,360 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Agua</td>
			<td colspan="7">c.s.p. 200 ml</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1. Soluciones de calibración de potasio
<ol start="2"><li>Calibración del microelectrodo<ol>
<li>La burbuja de todas las soluciones con 95% O25% CO2 para al menos 20 minutos antes de comenzar el experimento. Comenzar inunda el baño con 4,5 mM [K+] ACSF a razón de 3 mL por minuto. Coloque el electrodo selectivo de K+ en sostenedor de electrodos conectado a lo headstage de electrodo en el manipulador. Este headstage está conectado a un amplificador adecuado. Inserte la punta del electrodo en la solución del baño.</li>
		<li>Asegúrese de que el electrodo de tierra de Ag/AgCl se baña en la misma solución y que el flujo es constante. Aplicar soluciones de calibración de manera gradual y registrar los cambios de potencial en mV a través de la punta del electrodo. Espere a que el potencial en la punta del electrodo alcanzar un valor estable antes de pasar a la siguiente solución</li>
		<li>Medir el cambio de voltaje de estado estable en respuesta a la aplicación de las soluciones de calibración a la punta del electrodo. Confirmar que la pendiente de la respuesta del electrodo es por lo menos 52 y no mayor de 58 mV por cambio de registro en [K+].</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. preparación de rebanadas cerebrales hipocampo agudas
<ol><li>Preparación de soluciones de corte<ol>
<li>Preparar sacarosa 500 mL corte solución compuesto de: sacarosa de 194 mM, 30 mM NaCl, KCl, 10 mM D-glucosa, 1 mM MgCl2de 4.5 mM, 1,2 mM NaH2PO4y 26 mM NaHCO3, 290-300 mOsm, saturado con 95% O2 y 5% CO2.</li>
		<li>Preparar 1-2 litros de solución de grabación (ACSF) compuesto por: 124 mM NaCl 4,5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 10 mM D-glucose, 2 mM CaCl2, 1,2 mM NaH2PO4y 26 mM NaHCO3; pH 7.3-7.4 (después de burbujeo), 290-300 mOsm, saturado con 95% O2 y 5% CO2. Llenar un vaso de precipitados que contiene una cámara de soporte de rebanada de cerebro con solución de grabación y mantener a 32-34 ° C. Llene la cámara vibratome con granizado de agua de hielo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de rebanada aguda<ol>
<li>Anestesiar profundamente un ratón colocándolo en una campana de cristal precargado con isoflurano 2-3 mL. Compruebe para reflejo de pellizco del dedo del pie y si no responde, rápidamente decapitar con un par de tijeras afiladas o guillotina como su protocolo animal requiere.</li>
		<li>Haga una incisión de 2-3 cm con tijeras de la porción caudal del cráneo para cortar el cuero cabelludo a lo largo de la línea media. Mientras retrae manualmente el cuero cabelludo, hacer las incisiones horizontales dos de 1 cm de la botella doble de agujero a lo largo de los lados del cráneo. Entonces, con tijeras finas, corte una incisión la longitud del cráneo, a lo largo de la línea media de la parte posterior del cráneo a la nariz.</li>
		<li>Con unas pinzas finas insertadas cerca de la línea media, retraiga el cráneo Incisa en dos porciones. Extraer el cerebro del ratón del cráneo y utilice una cuchilla para eliminar el cerebelo y los bulbos olfativos, que se encuentran respectivamente en las porciones caudales y rostrales del cerebro. Estas pueden identificarse por las grandes fisuras, que los separan de la corteza.</li>
		<li>Monte el bloque de cerebro en la bandeja de vibratome con pegamento. Llene la bandeja de vibratome con solución de corte de helado.</li>
		<li>Cortar secciones de tejido en el plano coronal en 300 μm de grosor. Generalmente se pueden recoger 6 rebanadas hippocampal coronales.</li>
		<li>Después de cada sección, es inmediatamente transferir las rebanadas a la rebanada con vaso de calentado a 32-34° C. Mantener las secciones en esta temperatura durante 20 minutos antes de retirar el vaso que contiene las secciones y colóquelo a temperatura ambiente durante al menos 20-30 minutos antes de la grabación.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. medición de la dinámica de K eléctricamente evocados+ 
<ol><li>Configuración de la preparación de la rebanada<ol>
<li>Coloque con cuidado el trozo de cerebro en el baño con una pipeta Pasteur y manténgalo suavemente en su lugar con un platino arpa con cuerdas de nylon.</li>
		<li>Asegúrese de que las puntas del electrodo de estimulación bipolar son paralelas uno al otro y son de nivel con el plano de la rebanada. Lentamente, a lo largo de 6-7 segundos, introducir los electrodos en CA3 estrato radiatum aproximadamente 40-50 μm profundo para estimular collaterals de Schaffer. En las secciones coronales, CA3 pueden identificarse aproximadamente como la porción del lateral hipocampo apropiado a la capa de células del gránulo en la rodilla del hipocampo, con el estrato radiatum caer medial y ventral a la capa de células piramidales.</li>
		<li>Inserte con cuidado el K+-Electrodo selectivo en CA1 estrato radiatum aproximadamente 50 μm profundamente, bajando lentamente el electrodo durante aproximadamente 3-4 segundos. Permita que el potencial de estabilizar a través de los electrodos antes de aplicar estímulos para el sector: esto toma generalmente 5 a 10 minutos. Si el segmento muestra espontánea cambios en K extracelular+ entonces descartarán y repetición este proceso con un nuevo sector.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Medida evoca la liberación de K+<ol>
<li>Aplicar trenes de estímulo eléctrico (8 pulsos) presionando manualmente el gatillo en el estimulador durante la grabación digital de las respuestas. Aplicar la estimulación a 10 Hz y 1 ms de pulso ancho, desde amplitud de estímulo de 10 μA.</li>
		<li>Aplicar cada vez mayor amplitud de estimulación por un factor de 2 hasta que se detecta una amplitud máxima de respuesta K+ . Si no ves respuesta, mover la posición del electrodo K+ más cerca al sitio de estimulación en 100 μm en incrementos de</li>
		<li>Determinar la amplitud del estímulo que produce la respuesta máxima media. En nuestra experiencia, esto es entre 40-160 mA, dependiendo de la calidad de la preparación, edad del animal y la distancia entre electrodos de estimulación y el electrodo selectivo de K+ .</li>
		<li>En el mismo segmento, usando una amplitud de estímulo en un paso inferior a la amplitud que produce el medio respuesta máxima (por ejemplo, si 80 μA produce una respuesta de máximo de la mitad, usar 40 μA) aplicar trenes de estímulo de cada vez mayor número de pulsos. Inicialmente, hemos utilizado los trenes de pulsos de 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 y 128.</li>
		<li>Para confirmar que las señales K+ son mediadas por el disparo del potencial de acción de la bañera de collaterals de Schaffer eléctricamente estimulado, aplicar 0,5 μm TTX en ACSF durante 10 minutos y repetir el protocolo de estimulación. No las respuestas evocadas se deben observar.</li>
		<li>Después de terminar el experimento slice, confirmar el electrodo ha mantenido su respuesta por volver a calibrar el electrodo en las soluciones de calibración y garantizando la respuesta no se ha desviado en más del 10% de la calibración inicial</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>McDonough, A. A., Youn, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+homeostasis%3A+The+knowns%2C+the+unknowns%2C+and+the+health+benefits%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Bethesda+Md%22%5BJournal%5D)">Potassium homeostasis: The knowns, the unknowns, and the health benefits.</a> Physiol Bethesda Md. 32 (2), 100-111 (2017).</li>
<li>Hille, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHille%2C+B+%22Ion+channels+of+excitable+membranes%22">Ion channels of excitable membranes</a>. , Sinauer. Sunderland, MA. 507(2001).</li>
<li>Kofuji, P., Ceelen, P., Zahs, K. R., Surbeck, L. W., Lester, H. A., Newman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+inactivation+of+an+inwardly+rectifying+potassium+channel+%28Kir4.1+subunit%29+in+mice%3A+Phenotypic+impact+in+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic inactivation of an inwardly rectifying potassium channel (Kir4.1 subunit) in mice: Phenotypic impact in retina.</a> J Neurosci. 20 (15), 5733-5740 (2000).</li>
<li>Sibille, J., Dao Duc, K., Holcman, D., Rouach, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuroglial+potassium+cycle+during+neurotransmission%3A+role+of+Kir4.1+channels%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">The neuroglial potassium cycle during neurotransmission: role of Kir4.1 channels.</a> PLoS Comput Biol. 11 (3), e1004137(2015).</li>
<li>Tong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+Kir4.1+ion+channel+deficits+contribute+to+neuronal+dysfunction+in+Huntington%27s+disease+model+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocyte Kir4.1 ion channel deficits contribute to neuronal dysfunction in Huntington's disease model mice.</a> Nat Neurosci. 17 (5), 694-703 (2014).</li>
<li>Datta, D., Sarkar, K., Mukherjee, S., Meshik, X., Stroscio, M. A., Dutta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graphene+oxide+and+DNA+aptamer+based+sub-nanomolar+potassium+detecting+optical+nanosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Graphene oxide and DNA aptamer based sub-nanomolar potassium detecting optical nanosensor.</a> Nanotechnology. 28 (32), 325502(2017).</li>
<li>Bandara, H. M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palladium-Mediated+Synthesis+of+a+Near-Infrared+Fluorescent+K%2B+Sensor%5BTitle%5D)+AND+%22+J+Org+Chem%22%5BJournal%5D)">Palladium-Mediated Synthesis of a Near-Infrared Fluorescent K+ Sensor.</a> J Org Chem. 82 (15), 8199-8205 (2017).</li>
<li>Depauw, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+selective+potassium+sensor+for+the+detection+of+potassium+in+living+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Weinh+Bergstr+Ger%22%5BJournal%5D)">A highly selective potassium sensor for the detection of potassium in living tissues.</a> Chem Weinh Bergstr Ger. 22 (42), 14902-14911 (2016).</li>
<li>Machado, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofouling-Resistant+Impedimetric+Sensor+for+Array+High-Resolution+Extracellular+Potassium+Monitoring+in+the+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors%22%5BJournal%5D)">Biofouling-Resistant Impedimetric Sensor for Array High-Resolution Extracellular Potassium Monitoring in the Brain.</a> Biosensors. 6 (4), (2016).</li>
<li>Rose, M. C., Henkens, R. W. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0304416574902049">Stability of sodium and potassium complexes of valinomycin.</a> Biochim Biophys Acta BBA - Gen Subj. 372 (2), 426-435 (1974).</li>
<li>Ammann, D., Chao, P., Simon, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Valinomycin-based+K%2B+selective+microelectrodes+with+low+electrical+membrane+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Valinomycin-based K+ selective microelectrodes with low electrical membrane resistance.</a> Neurosci Lett. 74 (2), 221-226 (1987).</li>
<li>Amzica, F., Steriade, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+and+glial+membrane+potentials+during+sleep+and+paroxysmal+oscillations+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal and glial membrane potentials during sleep and paroxysmal oscillations in the neocortex.</a> J Neurosci. 20 (17), 6648-6665 (2000).</li>
<li>Amzica, F., Steriade, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+significance+of+K-complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Sleep+Med+Rev%22%5BJournal%5D)">The functional significance of K-complexes.</a> Sleep Med Rev. 6 (2), 139-149 (2002).</li>
<li>MacVicar, B. A., Feighan, D., Brown, A., Ransom, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+optical+signals+in+the+rat+optic+nerve%3A+role+for+K%28%2B%29+uptake+via+NKCC1+and+swelling+of+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Intrinsic optical signals in the rat optic nerve: role for K(+) uptake via NKCC1 and swelling of astrocytes.</a> Glia. 37 (2), 114-123 (2002).</li>
<li>Chever, O., Djukic, B., McCarthy, K. D., Amzica, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implication+of+Kir4.1+channel+in+excess+potassium+clearance%3A+an+in+vivo+study+on+anesthetized+glial-conditional+Kir4.1+knock-out+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Implication of Kir4.1 channel in excess potassium clearance: an in vivo study on anesthetized glial-conditional Kir4.1 knock-out mice.</a> J Neurosci. 30 (47), 15769-15777 (2010).</li>
<li>Hall, D. G. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jp9603039">Ion-selective membrane electrodes: A general limiting treatment of interference effects.</a> J Phys Chem. 100 (17), 7230-7236 (1996).</li>
<li>Haack, N., Durry, S., Kafitz, K. W., Chesler, M., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-barreled+and+Concentric+Microelectrodes+for+Measurement+of+Extracellular+Ion+Signals+in+Brain+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue.</a> J Vis Exp. (103), e53058(2015).</li>
<li>Larsen, B. R., MacAulay, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kir4.1-mediated+spatial+buffering+of+K%28%2B%29%3A+Experimental+challenges+in+determination+of+its+temporal+and+quantitative+contribution+to+K%28%2B%29+clearance+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Channels+Austin+Tex%22%5BJournal%5D)">Kir4.1-mediated spatial buffering of K(+): Experimental challenges in determination of its temporal and quantitative contribution to K(+) clearance in the brain.</a> Channels Austin Tex. 8 (6), 544-550 (2014).</li>
<li>Mei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+recording+of+circadian+rhythms+in+brains+of+freely+moving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo recording of circadian rhythms in brains of freely moving mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, 4276-4281 (2018).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El método que Describimos aquí nos ha permitido evaluar la dinámica de K+ en respuesta a la estimulación eléctrica de collaterals de Schaffer en rebanadas hippocampal agudas de ratones adultos. Nuestro método de preparación K+ de microelectrodos selectivos de ion es similar al anteriormente descrito procedimientos12,13,14,15. Sin embargo, este método tiene ventajas sobre c...

Las concentraciones de iones de potasio están estrictamente reguladas en el cerebro, y sus fluctuaciones ejercen una poderosa influencia sobre el potencial de membrana en reposo de todas las células. A la luz de estos aportes críticos, un objetivo importante de la biología es determinar los mecanismos celulares y biofísicos que se utilizan para regular estrechamente la concentración de K+ en el espacio extracelular en diferentes órganos del cuerpo1 , 2. un requisito importante en estos estudios es la capacidad de medir con precisión las concentraciones de K+ . Aunque muchos componentes que contribuyen a la homeostasis del potasio en el cerebro en Estados sanos y enfermos se han identificado3,4,5, más progreso ha sido más lento debido a la naturaleza especializada de preparación de microelectrodos selectivos de iones para la medición de potasio. Sensores de microelectrodo representan el estándar de oro para la medición de K+ concentraciones en vitro, en rebanadas de tejido y en vivo.
Nuevos enfoques para K+ control están bajo desarrollo de sensores ópticos, sin embargo estos no detectan una concentraciones biológicamente relevante rango de K+ o han no sido completamente validados en los sistemas biológicos, aunque los resultados iniciales parece prometedor6,7,8. En comparación con sensores ópticos, microelectrodos son fundamentalmente limitadas a una medición puntual de iones, aunque arreglos de electrodos podrían mejorar la resolución espacial9. Este artículo se centra en los sensores de microelectrodo sola-barreled para el monitoreo de la dinámica de K+ .
En este trabajo, nos informe los procedimientos detallados paso a paso para hacer K+ microelectrodos selectivos, usar un ionóforo valinomycin basado en potasio que permite altamente selectiva (104 veces K+ a selectividad Na+ ) K+ movimiento sobre membranas10. Un polipéptido natural, valinomycin actúa como un poro permeable de K+ y facilita el flujo de K+ hacia abajo de su gradiente electroquímico. También describimos cómo calibrar los electrodos, cómo almacenar y utilizarlos y, finalmente, cómo implementar para medir la dinámica de concentración de K+ en rebanadas agudo cerebro hipocampo de ratones adultos. El uso de tales electrodos junto con ratones modificados genéticamente que carecen de canales iónicos específicos de propuestas para regular la dinámica de K+ extracelular debe revelar los mecanismos celulares utilizados por el sistema nervioso para el control de la concentración ambiental de K + en el medio extracelular.

<table><tbody><tr><td>Vibratome</td><td>DSK</td><td>Microslicer Zero 1</td><td></td></tr><tr><td>Ratón: C57BL/6NTac ratones endogámicos</td><td>Taconic</td><td>Stock#B6</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Olympus</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>Extractor de electrodos</td><td>Sutter</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Ag/AgCl pellet molido</td><td>WPI</td><td>EP2</td><td></td></tr><tr><td>pCLAMP10.3</td><td>Molecular Devices</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Punta personalizada de microfil 28G Instrumentos</td><td>de precisión mundial</td><td>CMF28G</td><td></td></tr><tr><td>Varilla de tungsteno</td><td>A-M Systems</td><td>716000</td><td></td></tr><tr><td>Electrodos estimulantes bipolares</td><td>FHC</td><td>MX21XEW(T01)</td><td></td></tr><tr><td>Aislador de estímulos</td><td>Instrumentos de precisión mundial</td><td>A365</td><td></td></tr><tr><td>Grass S88 Estimulador</td><td>Grass Instruments Company</td><td>S88</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de vidrio de borosilicato Instrumentos de</td><td>precisión mundial</td><td>1B150-4</td><td></td></tr><tr><td>Placa A a D</td><td>Digidata 1322A</td><td>Axon Instruments</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador de señal</td><td>Multiclamp 700A o 700B</td><td>Axon Instruments</td><td></td></tr><tr><td>Headstage</td><td>CV-7B Cat 1</td><td>Axon Instruments</td><td></td></tr><tr><td>Computadora de parche</td><td>Dell</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de Potasio</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de Sodio</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de Sodio Monobásico</td><td>Sigma</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>D-glucosa</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de Calcio</td><td>Sigma</td><td>21108</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>valinomicina</td><td>Sigma</td><td>V0627-10mg</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dimetil-3-nitrobenceno</td><td>Sigma</td><td>40870-25ml</td><td></td></tr><tr><td>Tetrakis de potasio (4-clorofenil)borato</td><td></td><td>Sigma 60591-100mg</td><td></td></tr><tr><td>5% dimetildiclorosilano en heptano</td><td>Sigma</td><td>85126-5ml</td><td></td></tr><tr><td>TTX</td><td>Cayman Empresa química</td><td>14964</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico</td><td>Sigma</td><td>H1758-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma</td><td>S9378-5kg</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador de pipetas</td><td>Sutter</td><td>MP-285 / ROE-200 / MPC-200</td><td></td></tr><tr><td>Lente objetivo</td><td>Olympus</td><td>PlanAPO 10xW</td><td></td></tr></tbody></table>

fabricación, pruebas y uso de microelectrodos selectivos de ion potasio en rebanadas del tejido del cerebro adulto

Making, Testing, and Using Potassium Ion Selective Microelectrodes in Tissue Slices of Adult Brain

Los iones de potasio contribuyen significativamente al reclinación potencial de la membrana de las células y, por tanto, la concentración extracelular de K+ es un regulador crucial de la excitabilidad de la célula. Altera las concentraciones de efecto extracelular de K+ la excitabilidad celular y potencial de membrana reposo cambiando los equilibrios entre los Estados cerrados y abiertos inactivados para canales voltaje-dependientes del ion que subyacen a potencial de acción iniciación y conducción. Por lo tanto, es valiosa para medir directamente la dinámica extracelular de K+ en salud y los Estados enfermos. Aquí, describimos cómo realizar, calibrar y utilizar monopolar K+-microelectrodos selectivos. Les implantamos en rebanadas de cerebro hipocampo adulto para medir eléctricamente evocado dinámica de concentración de K+ . El uso juicioso de estos electrodos es una parte importante de las herramientas necesarias para evaluar los mecanismos celulares y biofísicos que controlan las concentraciones extracelulares de K+ en el sistema nervioso.

Para la medida selectiva del K extracelular+, preparamos microelectrodos selectivos recubiertas con una capa hidrofóbica a través de silanización de pipetas de vidrio de borosilicato limpio (figura 1A). Esta capa permite el ionóforo K+ que contiene valinomycin para descansar en la punta del electrodo y permitir solo K+ de flujo a través de una abertura estrecha en la punta del electrodo (figura 1B...

Iones del potasio contribuyen al reclinación potencial de la membrana de las células y la concentración extracelular de K+ es un regulador crucial de excitabilidad celular. Describimos cómo realizar, calibrar y utilizar monopolar K+-microelectrodos selectivos. Uso de tales electrodos permite la medición de la dinámica de concentración de K+ eléctricamente evocado en rebanadas de hipocampales adulto.

Fabricación, pruebas y uso de microelectrodos selectivos de Ion potasio en rebanadas del tejido del cerebro adulto

Potassium ions significantly contribute to the resting membrane potential of cells and, therefore, extracellular K+ concentration is a crucial regulator ...

El objetivo general de esta técnica es fabricar, calibrar y utilizar microelectrodos selectivos de iones de potasio monopolares. El uso de estos electrodos permite la evaluación cuantitativa de la dinámica de la concentración de iones de potasio evocados en cortes de cerebro de adultos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en fisiología, como la identificación de los mecanismos celulares y moleculares de la homeostasis de iones de potasio en el sistema nervioso central.La principal ventaja de esta técnica es que, además de ser un método de fabricación fácil y directo, los sensores de microelectrodos representan el estándar de oro para la medición de la concentración de iones de potasio. Para preparar los capilares de vidrio de borosilicato para la silanización, colóquelos en un tubo cónico de 50 mililitros. Llene el tubo cónico con ácido clorhídrico de un molar e incube los capilares de vidrio en ácido clorhídrico con agitación suave durante la noche durante un mínimo de seis horas.Después, enjuague brevemente los capilares con etanol al 70% y luego séquelos completamente a 100 a 120 grados centígrados durante seis a ocho horas. Almacene los capilares lavados en recipientes con desecante de sulfato de calcio anhidro hasta por cuatro semanas antes de su uso posterior. Antes de la silanización, tire de los capilares hasta una punta fina con un extractor de microelectrodos.Luego, coloque los microelectrodos en un recipiente de vidrio con cinta adhesiva esterilizable en autoclave, de modo que los electrodos se eleven desde la parte inferior para evitar la rotura de la punta. A continuación, retire aproximadamente 0,5 mililitros de solución de silanización al 5%DDS de su recipiente utilizando el método de reemplazo de nitrógeno. Llene un globo con gas nitrógeno y conecte una jeringa o tubo y una aguja al globo.A continuación, inserte la aguja en el recipiente de DDS mientras extrae el DDS en una jeringa separada a través de una aguja más larga. A continuación, aplique la solución de silanización gota a gota en las puntas de las pipetas y cubra inmediatamente el recipiente. Coloque el recipiente que contiene los microelectrodos con solución de silanización en un horno de laboratorio precalentado a 170 a 180 grados Celsius durante 10 a 12 horas o a 200 a 220 grados Celsius durante 30 minutos.Después de la incubación, retire la placa del horno. Coloque el plato en un banco a temperatura ambiente durante 10 a 15 minutos para permitir que la cristalería se enfríe. Retire los microelectrodos de la placa y colóquelos en un recipiente hermético lleno de desecante.Los microelectrodos silanizados que se mantienen libres de humedad se pueden utilizar hasta una semana después de la silanización. Para cebar los electrodos, prepare una solución madre de cóctel de ionóforos de potasio y manténgala en un recipiente hermético y opaco a temperatura ambiente. A continuación, prepare una solución madre de cloruro de sodio de 300 milimolares tamponado con HEPES 10 milimolares a pH 7,4.Fije el electrodo en una abrazadera. Posteriormente, con un instrumento romo, rastrille la punta del electrodo hasta aproximadamente 10 a 20 micrómetros de ancho, luego rellene el electrodo con el cloruro de sodio tamponado con HEPES utilizando una punta MicroFil de calibre 28 conectada a una jeringa. Observe que la solución salina ha llegado al extremo de la punta del microelectrodo y asegúrese de que el microelectrodo esté libre de burbujas grandes que puedan interferir con el flujo de corriente.Con una micropipeta, aplique una pequeña gota de ionóforo de potasio cerca de la punta del microelectrodo. Si el electrodo se ha silanizado correctamente, la gota será absorbida por la punta rota. Llene el electrodo hasta aproximadamente 1 milímetro con el ionóforo de potasio y retire el exceso con papel de seda.Para calibrar los microelectrodos, burbujee todas las soluciones de calibración y corte las soluciones tampón con 95% de oxígeno/5% de dióxido de carbono durante al menos 20 minutos antes de comenzar el experimento. Comience a perfundir el baño con ACSF que contiene iones de potasio de 4,5 milimolares a una velocidad de tres mililitros por minuto. Coloque el electrodo selectivo de iones de potasio en el portaelectrodos conectado a la etapa principal del electrodo en el manipulador.A continuación, inserte la punta del electrodo en la perfusión del baño. Asegúrese de que el electrodo de tierra de plata/cloruro de plata esté bañado en la misma solución y que el flujo sea constante. Aplique soluciones de calibración paso a paso y registre los cambios potenciales en milivoltios en la punta del electrodo.Espere a que el potencial en la punta del electrodo alcance un valor estable antes de cambiar a la siguiente solución. Luego, mida el cambio de voltaje en estado estacionario en respuesta a la aplicación de las soluciones de calibración a la punta del electrodo. Confirme que la pendiente de la respuesta de voltaje del electrodo sea de al menos 52 y no mayor de 59 milivoltios por cambio de diez veces en la concentración de potasio.Para preparar las rodajas del hipocampo, haz una incisión de dos a tres centímetros desde la porción caudal del cráneo para cortar el cuero cabelludo a lo largo de la línea media. Mientras retrae manualmente el cuero cabelludo, haga dos incisiones horizontales de un centímetro desde el foramen magnum a lo largo de los lados del cráneo. Luego, con unas tijeras finas, haga una incisión a lo largo de la línea media desde la parte posterior del cráneo hasta la nariz.A continuación, inserte pinzas finas cerca de la línea media y retraiga el cráneo inciso en dos porciones. Extraiga el cerebro de ratón del cráneo y use una cuchilla para eliminar el cerebelo, la corteza prefrontal y los bulbos olfativos, que se encuentran respectivamente en las porciones caudal y rostral del cerebro. A continuación, monta el bloque cerebral en la bandeja del vibrátomo con Super Glue.Llene la bandeja del vibratomo con una solución de corte helada. Después, corte secciones de tejido en la planicie coronal de 300 micrómetros de grosor. Por lo general, se pueden recolectar de cuatro a seis cortes coronales del hipocampo.Después de cortar cada sección, transfiera inmediatamente la loncha al vaso de precipitados que contiene las lonchas calentado a una temperatura de 32 a 34 grados centígrados. Mantenga las secciones a esta temperatura durante 20 minutos antes de transferir el vaso de precipitados con las secciones a temperatura ambiente durante al menos 20 a 30 minutos antes de grabar. Para medir la dinámica de los iones de potasio, coloque suavemente el trozo de cerebro en la bañera con una pipeta Pasteur y manténgalo suavemente en su lugar con un arpa de platino con cuerdas de nylon.Asegúrese de que las puntas del electrodo estimulante bipolar estén aproximadamente paralelas entre sí y estén niveladas con la plana de la rebanada. En el transcurso de cinco a siete segundos, inserte lentamente los electrodos en el estrato radiado CA3 de aproximadamente 40 a 50 micrómetros de profundidad para estimular las garantías Schaffer. Luego, inserte con cuidado el electrodo selectivo de iones de potasio en el estrato radiático CA1 a aproximadamente 50 micrómetros de profundidad bajando lentamente el electrodo durante aproximadamente tres a cuatro segundos.Permita que el potencial se estabilice a través del electrodo antes de aplicar estimulaciones a la rebanada, lo que generalmente toma de cinco a 10 minutos. Si la rebanada presenta cambios espontáneos excesivos en las concentraciones de iones de potasio extracelulares, deséchela y repita el proceso con una nueva rebanada. Para medir la liberación de iones de potasio evocados, aplique trenes de estimulación eléctrica a través del aislador de estímulo mientras registra digitalmente las respuestas.Aplique la estimulación a 10 hercios y un milisegundo por pulso a partir de una amplitud de estímulo de 10 microamperios. Aplique amplitudes de estimulación crecientes por un factor de dos hasta que se detecte una amplitud máxima de respuesta de potasio. Si no se observa ninguna respuesta, acerque la posición del electrodo selectivo de iones de potasio al sitio de estimulación en incrementos de 100 micrómetros.Para confirmar que los cambios en la concentración de iones de potasio están mediados por el potencial de acción de los colaterales Shaffer activados eléctricamente, aplique TTX de 0,5 micromolares en ACSF durante 10 minutos y repita el protocolo de estimulación. No se deben observar respuestas evocadas. Después de cebar los electrodos con la solución salina tamponada con HEPES y el ionóforo de potasio, se puede probar la respuesta rápida de los electrodos a los cambios escalonados en las concentraciones de iones de potasio del baño y la respuesta lineal a los cambios de iones de potasio del baño en el rango de calibración de 0,1 a 100 milimolares de una manera predicha por la ecuación de Nernst.El potencial de estado estacionario se puede trazar contra la concentración de iones de potasio del baño para determinar la pendiente de la línea, que debe ser de aproximadamente V 58,2 milivoltios y no menos de 52 milivoltios por cambio de diez veces en la concentración de iones de potasio. Se probó más a fondo la capacidad de respuesta de los electrodos selectivos de potasio y se observó la respuesta a un aumento de 5,5 milimolares en el potasio con constantes de tiempo de aumento y decaimiento de aproximadamente 85 milisegundos. Una vez que los electrodos estimulantes y selectivos de iones de potasio se han colocado en el tejido y el registro ha alcanzado una línea de base estable, se pueden aplicar pulsos de amplitud de corriente creciente.La forma de onda de esta actividad aparece como un rápido aumento de potasio con una tasa de decaimiento exponencial, que se elimina con la aplicación de TTX. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en aproximadamente tres o cuatro horas si se realiza con cuidado y precisión. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la punta del electrodo debe mantener la punta del electrodo lo más pequeña posible para permitir grabaciones precisas, pero lo suficientemente grande como para permitir un bajo nivel de ruido.

making-testing-using-potassium-ion-selective-microelectrodes-tissue

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Este es un protocolo para preparar y mantener una rebanada preparación neocortical en la cultura organotípicos con el propósito de realizar grabaciones eléctricas de las neuronas piramidales.

Grabación de células enteras de una rebanada preparación organotípicos del neocórtex

Utilizamos la técnica de patch-clamp para medir GABA-activa de un solo canal corrientes (GABAA canales, los receptores GABA A) y las corrientes sinápticas y tónico que generan en las neuronas. La activación de los canales disminuye la excitabilidad neuronal en la salud y la...

GABA corrientes activadas de un solo canal y Tonic en rodajas de cerebro de rata

Las neuronas se caracterizan primera electrofisiológica. A continuación, el citoplasma de las neuronas registradas se aspira y se somete a la transcripción reversa-PCR y análisis para detectar la expresión de ARNm para enzimas síntesis de neurotransmisores, canales iónicos y receptores.

Perfiles de voltaje de expresión del ARNm de potasio en las neuronas Canal nigral con una sola celda de RT-PCR Técnicas

El video muestra la dinámica de concentración de iones de potasio evocados en la estimulación eléctrica de cortes de cerebro del hipocampo coronal de ratón. Se inserta un electrodo estimulador bipolar en el estrato radial de la región CA3 en el hipocampo, y se coloca un electrodo selectivo de iones de potasio en el estrato radial CA1. La estimulación eléctrica provoca un potencial de acción, lo que resulta en la liberación de iones de potasio. Finalmente, la falta de respuesta de iones de...

Medición de la dinámica de concentración de iones de potasio evocados en cortes del hipocampo coronal

Este video demuestra cómo caracterizar el espacio extracelular en un corte de cerebro mediante el uso de microelectrodos selectivos de iones e iontoforesis para medir y comparar señales eléctricas. Este proceso ayuda a determinar el volumen, la fracción y el grado de torsión del espacio.

Caracterización del espacio extracelular en un corte de cerebro utilizando microelectrodos selectivos de iones e iontoforesis

Hemos desarrollado un modelo de cortes de cerebro que se puede utilizar para examinar los mecanismos moleculares implicados en la lesión cerebral excitotoxicidad mediada. Esta técnica genera tejido cerebral madura viable y reduce el número de animales necesarios para la experimentación, mientras que mantiene los circuitos neuronales, las interacciones celulares y compartimentos postsinápticos parcialmente intacta.

Excitotóxica Estimulación del cerebro Microslices como<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo de Carrera

registros de patch-clamp y el llenado simultáneo de biocitona intracelular de neuronas sinápticamente acopladas en cortes agudos de cerebro permiten un análisis correlacionado de sus propiedades estructurales y funcionales. El objetivo de este protocolo es describir los pasos técnicos esenciales del registro electrofisiológico a partir de microcircuitos neuronales y su posterior análisis morfológico.

Electrofisiológico y Caracterización Morfológica de microcircuitos neuronales en el infarto agudo rodajas de cerebro Usando Emparejados patch-clamp grabaciones

Demostramos la fabricación, calibración y propiedades de dos tipos de microelectrodos selectivos de iones (de doble cañón y concéntricos) para la medición de concentraciones de iones en el tejido cerebral. A continuación, se utilizan en la preparación del corte del hipocampo del ratón para demostrar que la actividad excitatoria cambia las concentraciones extracelulares de potasio y sodio.

Los microelectrodos de dos cañones y concéntricos para la medición de extracelular Ion señales en el tejido cerebral

Este protocolo muestra la implementación de un optimizado N-metil-D-glucamine (NMDG) método de protección recuperación de preparación de corte de cerebro. Una formulación de medios de comunicación solo se utiliza para obtener confiablemente rebanadas de cerebro sano de animales de cualquier edad y para diversas aplicaciones experimentales.

Preparación de rebanadas cerebrales agudas mediante un optimizado N-metil-D-glucamine recuperación protección método

Microglia, las células inmunes residentes del cerebro, responde rápidamente con cambios morfológicos a modificaciones de su entorno. Este protocolo describe cómo usar microscopía de dos fotones para estudiar la atracción de procesos de microglial hacia serotonina o ATP en rebanadas de cerebro agudo de ratones.

Proyección de imagen de dos fotones de atracción Microglial procesos hacia ATP o serotonina en rebanadas de cerebro agudo

Se presenta un protocolo para preparar cultivos de rebanadas flotantes a partir del cerebro humano adulto. El protocolo es una variación del método de cultivo de rebanadas ampliamente utilizado utilizando inserciones de membrana. Es simple, rentable y recomendado para ejecutar ensayos a corto plazo destinados a desentrañar mecanismos de neurodegeneración detrás de las enfermedades cerebrales asociadas a la edad.

Cultivos de rebanadas flotantes a corto plazo del cerebro humano adulto

Aprende a fabricar y calibrar microelectrodos selectivos de ion potasio para medir dinámicas de potasio en rebanadas de hipocampo adulto. Este método permite evaluar cuantitativamente la homeostasis de potasio en el sistema nervioso central.

Fabricación, pruebas y uso de microelectrodos selectivos de Ion potasio en rebanadas del tejido del cerebro adulto

Explorar más videos