Utilización de ultrasonido guiado implantación celular dirigida de tejido para el establecimiento de xenoinjertos de tumores metastásicos biológicamente relevantes

El objetivo de este método es establecer xenoinjertos ortotópicos de cáncer biológicamente relevantes para estudios preclínicos. Las células de neuroblastoma derivadas del paciente se inyectan en la glándula suprarrenal murina guiadas por ultrasonido sin cirugía abierta ni recuperación prolongada. Este método puede ayudar a responder preguntas críticas en la biología del cáncer y en la investigación traslacional, como los estudios de la evolución tumoral, las respuestas terapéuticas en el microambiente nativo y las metástasis.

Este conocimiento mejoraría en gran medida la fiabilidad de los estudios preclínicos y facilitaría el descubrimiento de fármacos. La principal ventaja de esta técnica es que es derivada del paciente, dirigida por tejidos, eficiente y confiable en la producción de un modelo ortotópico xenografiado para la investigación de terapias contra el cáncer. Sahiti Chukkapalli, técnico sénior y nuestro director de laboratorio, demostrarán los pasos críticos del procedimiento, junto con Tina Thomas, investigadora de nuestro laboratorio.

Genere una única suspensión de células cancerosas derivada del paciente a partir de tejido tumoral mediante un kit de disociación tumoral. Comience transfiriendo aproximadamente medio gramo de tejido tumoral a una placa de cultivo celular de 100 milímetros que contenga cinco mililitros de tampón RPMI suplementado con enzimas. Luego, use tijeras y pinzas de tejido para picar el tumor en pedazos pequeños de dos a cuatro milímetros.

Pipetear la mezcla tumoral en un tubo disociador y cerrar el tubo. Invierta el tubo, conéctelo al manguito de un disociador de tejido y disocie el tejido utilizando el programa adecuado. Después de disociarse, incubar la suspensión de células tumorales en una rejilla giratoria a 37 grados centígrados durante una hora.

Triturar la suspensión celular cada 15 minutos durante la incubación. Después de la incubación, transfiera la suspensión celular a un nuevo tubo cónico de 50 mililitros y agregue 10 mililitros de RPMI. A continuación, centrifuga la suspensión celular a 314 g durante cinco minutos.

Después de la centrifugación, retire el sobrenadante y suspenda el pellet en cinco mililitros de RPMI. Pase la suspensión celular a través de un colador celular de 40 micras y recoja la solución colada en un tubo nuevo de 50 mililitros. Después de lavar el colador con cinco mililitros de medio RPMI, centrifugar la suspensión de celdas a 314 g durante cinco minutos para recolectar un pellet.

Cuente las células con un hemocitómetro. A continuación, suspenda el pellet en RPMI para obtener una concentración final de cuatro veces 10 a las cinco células por 10 microlitros de volumen. Transfiera cinco microlitros de esta suspensión celular por inyección a un tubo nuevo, y el mismo volumen de matriz de membrana basal para hacer 10 microlitros de solución celular para cada inyección y colóquela en hielo.

Transfiera el ratón a la plataforma de imágenes con el lado abdominal hacia abajo. Coloque y asegure el cono de la nariz para mantener la anestesia con isoflurano. Comience el procedimiento de implantación utilizando una loción depilatoria y una afeitadora para depilar la espalda y el flanco de un ratón NSG inmunodeficiente de seis a ocho semanas de edad debidamente anestesiado.

Aplique ungüento óptico sobre los ojos del animal para evitar que se sequen. Luego, pegue el mouse en su lugar para evitar cualquier movimiento involuntario. A continuación, utilice la visualización ecográfica para identificar el hígado murino, la vena cava, el bazo, el riñón izquierdo y la glándula suprarrenal izquierda adyacente.

Cargue una jeringa Hamilton refrigerada, equipada con una aguja de pequeño calibre, con 10 microlitros de solución celular. Luego, bajo la guía de ultrasonido, insertó suavemente un catéter frío de calibre 22 a través de la piel y el músculo de la espalda, directamente en la glándula suprarrenal izquierda para proporcionar un canal para la inyección celular. Retire la aguja y deje el catéter en su lugar.

La visualización de la glándula suprarrenal a lo largo de la inserción del catéter, junto con la aguja y su trayectoria, es imprescindible para garantizar una lesión mínima en las estructuras y órganos circundantes y una menor morbilidad murina. Luego, guíe la jeringa a través del catéter ubicado en el centro de la glándula suprarrenal. A medida que la jeringa se guía a través del catéter, es importante mantener la estabilidad del catéter y observar el avance de la aguja.

Tenga en cuenta que la aguja en sí se extiende aproximadamente dos milímetros más allá de la terminación del catéter, su posición se ve fácilmente en la ecografía. Inyecte las células en el tejido suprarrenal objetivo. Deje la aguja en su lugar durante uno o dos minutos para permitir que la matriz de la membrana basal se asiente.

Después de que la matriz de la membrana basal se haya fijado, retire lentamente la aguja, seguido de la extracción del catéter. Finalmente, coloque al ratón en una jaula de recuperación hasta que recupere la conciencia suficiente para mantener la decúbito esteral antes de regresar a la jaula de origen. La ecografía monitorea la progresión tumoral in vivo.

Esta imagen muestra una ecografía de la glándula suprarrenal, una semana después de la inyección. Aquí, las imágenes de luminiscencia de un ratón inyectado en neuroblastoma una semana después de la inyección, muestran lecturas que no son indicativas de injerto tumoral. Después de dos semanas, las imágenes de ultrasonido muestran el injerto tumoral y la progresión a un área de aproximadamente 40 milímetros cuadrados.

La bioluminiscencia a las dos semanas después de la inyección mostró un resplandor de 10 a la séptima, lo que sugiere que la absorción celular y el crecimiento tumoral se correlacionan con los hallazgos ecográficos. Las imágenes de ultrasonido ocho semanas después de la inyección mostraron un crecimiento continuo del tumor con una medición de área de más de 100 milímetros cuadrados. Una vez más, la bioluminiscencia confirmó los hallazgos de la ecografía con niveles de radiación aumentados de 10 a nueve.

La ecografía 3D del tumor mostró un volumen superior a los 100 milímetros cúbicos, la línea de base que nuestro laboratorio utiliza para el inicio de los ensayos terapéuticos preclínicos. El tumor extirpado midió macroscópicamente más de un centímetro de tamaño, correlacionándose con las mediciones ecográficas y las señales de luminiscencia. Este medio proporciona una demostración de cómo establecer con éxito xenografías ortotópicas suprarrenales con células de neuroblastoma derivadas de pacientes, utilizando la guía por ultrasonido.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en menos de 12 minutos por inyección si se realiza correctamente.