Utilización de ultrasonido guiado implantación celular dirigida de tejido para el establecimiento de xenoinjertos de tumores metastásicos biológicamente relevantes
25 de mayo de 2018
Aquí, presentamos un protocolo utilizar inyección guiada por ultrasonido de las células de (ES) el sarcoma de Ewing y neuroblastoma (NB) (estableció líneas celulares y células tumorales derivados del paciente) en sitios biológicamente relevantes para crear modelos preclínicos fiables para el cáncer investigación.
El objetivo de este método es establecer xenoinjertos ortotópicos de cáncer biológicamente relevantes para estudios preclínicos. Las células de neuroblastoma derivadas del paciente se inyectan en la glándula suprarrenal murina guiadas por ultrasonido sin cirugía abierta ni recuperación prolongada. Este método puede ayudar a responder preguntas críticas en la biología del cáncer y en la investigación traslacional, como los estudios de la evolución tumoral, las respuestas terapéuticas en el microambiente nativo y las metástasis.
Este conocimiento mejoraría en gran medida la fiabilidad de los estudios preclínicos y facilitaría el descubrimiento de fármacos. La principal ventaja de esta técnica es que es derivada del paciente, dirigida por tejidos, eficiente y confiable en la producción de un modelo ortotópico xenografiado para la investigación de terapias contra el cáncer. Sahiti Chukkapalli, técnico sénior y nuestro director de laboratorio, demostrarán los pasos críticos del procedimiento, junto con Tina Thomas, investigadora de nuestro laboratorio.
Genere una única suspensión de células cancerosas derivada del paciente a partir de tejido tumoral mediante un kit de disociación tumoral. Comience transfiriendo aproximadamente medio gramo de tejido tumoral a una placa de cultivo celular de 100 milímetros que contenga cinco mililitros de tampón RPMI suplementado con enzimas. Luego, use tijeras y pinzas de tejido para picar el tumor en pedazos pequeños de dos a cuatro milímetros.
Pipetear la mezcla tumoral en un tubo disociador y cerrar el tubo. Invierta el tubo, conéctelo al manguito de un disociador de tejido y disocie el tejido utilizando el programa adecuado. Después de disociarse, incubar la suspensión de células tumorales en una rejilla giratoria a 37 grados centígrados durante una hora.
Triturar la suspensión celular cada 15 minutos durante la incubación. Después de la incubación, transfiera la suspensión celular a un nuevo tubo cónico de 50 mililitros y agregue 10 mililitros de RPMI. A continuación, centrifuga la suspensión celular a 314 g durante cinco minutos.
Después de la centrifugación, retire el sobrenadante y suspenda el pellet en cinco mililitros de RPMI. Pase la suspensión celular a través de un colador celular de 40 micras y recoja la solución colada en un tubo nuevo de 50 mililitros. Después de lavar el colador con cinco mililitros de medio RPMI, centrifugar la suspensión de celdas a 314 g durante cinco minutos para recolectar un pellet.
Cuente las células con un hemocitómetro. A continuación, suspenda el pellet en RPMI para obtener una concentración final de cuatro veces 10 a las cinco células por 10 microlitros de volumen. Transfiera cinco microlitros de esta suspensión celular por inyección a un tubo nuevo, y el mismo volumen de matriz de membrana basal para hacer 10 microlitros de solución celular para cada inyección y colóquela en hielo.
Transfiera el ratón a la plataforma de imágenes con el lado abdominal hacia abajo. Coloque y asegure el cono de la nariz para mantener la anestesia con isoflurano. Comience el procedimiento de implantación utilizando una loción depilatoria y una afeitadora para depilar la espalda y el flanco de un ratón NSG inmunodeficiente de seis a ocho semanas de edad debidamente anestesiado.
Aplique ungüento óptico sobre los ojos del animal para evitar que se sequen. Luego, pegue el mouse en su lugar para evitar cualquier movimiento involuntario. A continuación, utilice la visualización ecográfica para identificar el hígado murino, la vena cava, el bazo, el riñón izquierdo y la glándula suprarrenal izquierda adyacente.
Cargue una jeringa Hamilton refrigerada, equipada con una aguja de pequeño calibre, con 10 microlitros de solución celular. Luego, bajo la guía de ultrasonido, insertó suavemente un catéter frío de calibre 22 a través de la piel y el músculo de la espalda, directamente en la glándula suprarrenal izquierda para proporcionar un canal para la inyección celular. Retire la aguja y deje el catéter en su lugar.
La visualización de la glándula suprarrenal a lo largo de la inserción del catéter, junto con la aguja y su trayectoria, es imprescindible para garantizar una lesión mínima en las estructuras y órganos circundantes y una menor morbilidad murina. Luego, guíe la jeringa a través del catéter ubicado en el centro de la glándula suprarrenal. A medida que la jeringa se guía a través del catéter, es importante mantener la estabilidad del catéter y observar el avance de la aguja.
Tenga en cuenta que la aguja en sí se extiende aproximadamente dos milímetros más allá de la terminación del catéter, su posición se ve fácilmente en la ecografía. Inyecte las células en el tejido suprarrenal objetivo. Deje la aguja en su lugar durante uno o dos minutos para permitir que la matriz de la membrana basal se asiente.
Después de que la matriz de la membrana basal se haya fijado, retire lentamente la aguja, seguido de la extracción del catéter. Finalmente, coloque al ratón en una jaula de recuperación hasta que recupere la conciencia suficiente para mantener la decúbito esteral antes de regresar a la jaula de origen. La ecografía monitorea la progresión tumoral in vivo.
Esta imagen muestra una ecografía de la glándula suprarrenal, una semana después de la inyección. Aquí, las imágenes de luminiscencia de un ratón inyectado en neuroblastoma una semana después de la inyección, muestran lecturas que no son indicativas de injerto tumoral. Después de dos semanas, las imágenes de ultrasonido muestran el injerto tumoral y la progresión a un área de aproximadamente 40 milímetros cuadrados.
La bioluminiscencia a las dos semanas después de la inyección mostró un resplandor de 10 a la séptima, lo que sugiere que la absorción celular y el crecimiento tumoral se correlacionan con los hallazgos ecográficos. Las imágenes de ultrasonido ocho semanas después de la inyección mostraron un crecimiento continuo del tumor con una medición de área de más de 100 milímetros cuadrados. Una vez más, la bioluminiscencia confirmó los hallazgos de la ecografía con niveles de radiación aumentados de 10 a nueve.
La ecografía 3D del tumor mostró un volumen superior a los 100 milímetros cúbicos, la línea de base que nuestro laboratorio utiliza para el inicio de los ensayos terapéuticos preclínicos. El tumor extirpado midió macroscópicamente más de un centímetro de tamaño, correlacionándose con las mediciones ecográficas y las señales de luminiscencia. Este medio proporciona una demostración de cómo establecer con éxito xenografías ortotópicas suprarrenales con células de neuroblastoma derivadas de pacientes, utilizando la guía por ultrasonido.
Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en menos de 12 minutos por inyección si se realiza correctamente.
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Resumen
Este artículo presenta un protocolo para la inyección guiada por ultrasonido de células de neuroblastoma y sarcoma de Ewing en modelos murinos. Esta técnica tiene como objetivo establecer modelos preclínicos de cáncer confiables que reflejen el microambiente tumoral nativo.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Oncología
- Investigación preclínica
Antecedentes
- Las células tumorales derivadas de pacientes proporcionan un modelo más preciso para estudiar el cáncer.
- Los xenoinjertos ortotópicos son esenciales para comprender el comportamiento tumoral en un contexto nativo.
- La guía por ultrasonido permite una inyección precisa sin cirugía invasiva.
- Este método puede mejorar la fiabilidad de los estudios preclínicos.
Objetivo del estudio
- Crear modelos de cáncer biológicamente relevantes para la investigación.
- Investigar la evolución tumoral y las respuestas terapéuticas.
- Facilitar el descubrimiento de fármacos mediante modelos preclínicos mejorados.
Métodos Utilizados
- Inyección guiada por ultrasonido de células de neuroblastoma.
- Inyección en la glándula suprarrenal de ratón.
- Uso de células tumorales derivadas de pacientes.
- Técnica no invasiva para minimizar el tiempo de recuperación.
Resultados principales
- Establecimiento exitoso de xenoinjertos ortotópicos.
- Se demostró la eficiencia y fiabilidad del método.
- Proporcionó información sobre el comportamiento tumoral en un microentorno nativo.
- Facilitó estudios posteriores sobre las respuestas terapéuticas y la metástasis.
Conclusiones
- El método de inyección guiado por ultrasonido es eficaz para la investigación del cáncer.
- Los modelos derivados de pacientes mejoran la relevancia de los estudios preclínicos.
- Esta técnica puede ayudar significativamente en los esfuerzos de descubrimiento de fármacos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El establecimiento de xenoinjertos de tumores metastásicos biológicamente relevantes mediante la implantación celular dirigida por tejido y guiada por ultrasonido aborda una brecha crítica en los modelos preclínicos de oncología, al permitir una recapitulación precisa de los microentornos tumorales y del comportamiento metastásico. Este enfoque mínimamente invasivo mejora la confiabilidad predictiva en estudios de respuesta terapéutica y metástasis, apoyando decisiones de cartera ajustadas al riesgo en el descubrimiento de fármacos oncológicos. La reproductibilidad del método y su alineación traslacional lo posicionan como un activo estratégico para las líneas de I+D empresariales que buscan reducir el riesgo en activos oncológicos en etapas tempranas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas en un microentorno tumoral nativo.
- Apoya la validación funcional de dianas mediante la modelización de la diseminación metastásica y la evolución tumoral.
- Mejora la confianza predictiva en la selección de candidatos y la clasificación de carteras.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Facilita la preparación de modelos de xenoinjertos ortotópicos validados para pruebas de eficacia posteriores.
- Proporciona lecturas cuantitativas y reproducibles del crecimiento tumoral y metástasis mediante imágenes por ultrasonido y bioluminiscencia.
- Permite el establecimiento de modelos escalables y mínimamente invasivos para la evaluación de compuestos.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Alinea modelos preclínicos con la biología de la enfermedad humana mediante el uso de células derivadas de pacientes e implantación específica de tejidos.
- Apoya la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al permitir la evaluación longitudinal de la progresión tumoral y la respuesta terapéutica.
- Reduce el riesgo de traslación al modelar el comportamiento metastásico clínicamente relevante.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este método de xenoinjerto guiado por ultrasonido se integra en la continuidad del descubrimiento en oncología, desde la validación inicial del blanco hasta los estudios preclínicos de eficacia, permitiendo la generación de modelos robustos para la identificación de compuestos activos y la investigación traslacional.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la verificación de hipótesis y la reducción del riesgo mecanicista mediante la modelización del crecimiento tumoral en contextos de tejido nativo.
- Tamizaje: Proporciona modelos estandarizados y reproducibles con resultados cuantitativos de imágenes para el tamizaje de compuestos.
- Análisis: Ofrece mediciones longitudinales del tamaño tumoral y de bioluminiscencia para comparar condiciones terapéuticas.
- Investigación Translacional: Conecta las fases de descubrimiento y preclínica al permitir sistemas de modelos derivados de pacientes y relevantes para la enfermedad.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma adaptable a múltiples tipos de cáncer y fuentes celulares para una amplia utilidad en I+D.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en los modelos de oncología.
- Valor operativo: Estandariza y agiliza el establecimiento de modelos con mínima morbilidad animal y recuperación rápida.
- Valor estratégico: Mejora la calidad de las decisiones de avance o interrupción y la eficiencia del capital al aumentar la relevancia del modelo.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización y el avance ajustados al riesgo de los activos oncológicos basándose en datos alineados con la traslacionalidad.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en técnicas quirúrgicas en animales pequeños y en imágenes por ultrasonido.
- Necesita acceso a plataformas de imagen, kits de disociación celular y infraestructura para análisis de bioluminiscencia.
- Exige estandarización entre equipos para garantizar la reproducibilidad y la comparabilidad de los datos.
- Adaptable a diversos tipos de cáncer y a líneas celulares establecidas y derivadas de pacientes.
- Limitado por la necesidad de formación especializada y equipos de imagen para la implantación y el monitoreo precisos.
