Name: Utilización de ultrasonido guiado implantación celular dirigida de tejido para el establecimiento de xenoinjertos de tumores metastásicos biológicamente relevantes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Aprende a establecer xenoinjertos ortotópicos de neuroblastoma mediante inyección guiada por ultrasonido en la glándula adrenal murina. Este método no invasivo utiliza células derivadas de pacientes para crear modelos preclínicos fiables que mejoran los estudios de evolución tumoral y respuestas terapéuticas.

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Este trabajo recibió apoyo de la Robert Wood Johnson Foundation/Amos Facultad desarrollo programa, Taubman Instituto de investigación médica y la sección de cirugía pediátrica, la Universidad de Michigan. Los autores desean agradecer a Kimber Converso-Baran y Dr. Marcus Jarboe la asistencia con los procedimientos de inyección de ultrasonido y la plataforma de proyección de imagen. Damos las gracias por su ayuda con los gráficos de la figura Paul Trombley. También agradecemos al Departamento de Radiología de la Universidad de Michigan para el uso del centro de imagen Molecular y el núcleo de la proyección de imagen del Tumor, que son apoyados en parte por integral cáncer Centro NIH, otorgar CA046592 P30. La Universidad de Michigan fisiología Phenotyping núcleo que es apoyado en parte por donaciones de fondos de los NIH (OD016502) y el Centro Cardiovascular de Frankel. Autenticación de línea celular se realizó en las instalaciones de IDEXX RADIL Bioresearch, Columbia, MO. Agradecemos a Tammy Stoll, Dr. Rajen Mody y el programa de Oncología Tumor sólido de Mott. Nuestros pacientes y sus familias son reconocidas con gratitud por su inspiración, valor y apoyo continuo de nuestra investigación.

Todo el trabajo se hizo acuerdo con la Junta de revisión institucional de la Universidad de Michigan (HUM 00052430) y se ajusta a los procedimientos aprobados por el Comité de la Universidad sobre el uso y cuidado de animales (UCUCA). La unidad de laboratorio del Animal medicina (ULAM) supervisó el cuidado de los animales.
Todo el trabajo se realizó con la aprobación de la Junta de revisión institucional de la Universidad de Michigan (HUM 00052430) y cumple con todas las normas de Comité de investigación humana ética. Las células humanas se consideran ser un material de riesgo biológico, así que siga todas las precauciones y prácticas de bioseguridad apropiados requeridos por la institución. NSG ratones son seriamente immunocompromised y susceptible a la enfermedad causada por bacterias que se encuentran comúnmente en el ambiente. Utilice siempre una técnica aséptica estricta durante la preparación de materiales para la implantación y realización de las inyecciones.
1. cultivo celular
<ol><li>Crecimiento humano NB célula líneas establecidas (SH-SY5Y, SK-N-BE2 y IMR32) en medio esencial mínimo, suplementado con suero bovino fetal 10%, glutamina 2 mM, 100 unidades/mL de penicilina y 100 de μg/mL estreptomicina. Suplemento IMR32 células más con 1 mM piruvato y 0.075% de NaHCO3. Mantener todas las células a 37 ° C, 5% CO2 y confluencia de 70-80%.
</li>
	<li>Crecimiento humano ES la célula líneas (TC32, A673, CLA-25 y A4573) en Medio RPMI suplementado con suero bovino fetal 10% y 6 mM L-glutamina. Mantener todas las células a 37 ° C, 5% CO2 en confluencia de 70-80%.
</li>
	<li>Enviar todas las líneas celulares para la autenticación. Nota: Autenticación de celular se realiza en una instalación exterior, consulte agradecimientos.</li>
</ol>2. preparación de las células del Tumor primario derivados del paciente
<ol><li>Con paciente consentimiento y asentimiento, cosecha descarta tejido de tumor humano NB de pacientes sometidos a resección quirúrgica para control local y el transporte al laboratorio en solución de almacenamiento de información de tejido para la preservación. Nota: Todas las muestras de paciente-identificadas y manejadas conforme a las directrices de la Junta de revisión institucional.</li>
	<li>Generar una suspensión de células de cáncer derivados de paciente único (UMNBL001, UMNBL002) de tejido del tumor usando un kit de disociación del tumor. Transferir aproximadamente 0,5 g de tumor a una placa de cultivo de células de 100 mm que contiene 5 mL de tampón de RPMI, 200 μL de enzima H, 100 μl de enzima R y 25 μl de enzima A del kit de disociación del tumor humano.</li>
	<li>Pique el tumor en trozos pequeños (2-4 mm cada uno) usando tijeras y pinzas de tejido. Estos fragmentos se mezclan con las soluciones en el paso 2.2.</li>
	<li>Pipetear la mezcla del tumor en un tubo de disociador y cierre el tubo. Invertir el tubo y colocar en la manga de la Disociador de tejido. Ejecute el programa h_tumor_01.</li>
	<li>Incubar la suspensión de células de tumor obtenida anteriormente a 37 ° C por 1 h en un rack giratorio con trituración intermitente cada 15 minutos.</li>
	<li>Transferir la suspensión de células a un nuevo tubo cónico de 50 mL y añadir 10 mL de RPMI. Centrifugue la suspensión de células a 314 x g durante 5 minutos.</li>
	<li>Quite el sobrenadante y suspender el sedimento en 5 mL de RPMI. Pasar esta solución a través de un tamiz de 40 μm celular y recoger la solución filtrada en un tubo cónico de 50 mL fresco. Lavar este filtro una vez con 5 mL de Medio RPMI y centrifugar la mezcla a 314 x g durante 5 minutos recoger un diábolo.</li>
	<li>Medir la densidad celular con un hemacitómetro15. Suspender el sedimento obtenido desde arriba en RPMI para obtener una concentración final de 4 × 105 células/10 μl. Tomar 5 μl de esta suspensión celular y 5 μl de matrigel hacer 10 μl de la solución celular para cada inyección. Nota: Cantidad de RPMI utilizado depende de la medida de la densidad celular. Por ejemplo, si la densidad de la célula medida del precipitado obtenido es 4 x 105 células, suspender el sedimento en 10 μl de RPMI.</li>
</ol>3. luciferase el marcaje de las células cancerosas
<ol><li>Tomar 10 mL de medio de transducción con 5 mL de viral sobrenadante EF1a-Luc2-IRES-mCherry y 5 mL de medio de células madre. Añadir 7,5 μl de polibreno 1 x.</li>
	<li>Mezclar 5 × 106 células de cáncer en medio de la transducción y la placa en la placa de fijación ultra baja de 100 mm. Incubar a 37 ° C y 5% CO2 durante la noche. Nota: Como se utilizan las placas de fijación baja, las células no se adhieren a la placa.</li>
	<li>Después de 24 h, traer la placa de 100 mm que contiene células bajo campana de cultivo de tejidos y transferir la mezcla a un tubo cónico de 15 mL. Centrifugue la suspensión de células a 314 x g durante 5 min obtener el precipitado de células. Lavar el precipitado de células una vez con 1 mL de 1 x de tampón fosfato salino (PBS) y suspender el precipitado de células en 1 mL de HBSS conteniendo 1% de suero bovino fetal (FBS).<ol>
<li>Ordenar celdas de luciferasa basados en señal GFP-positivas en celular activado por fluorescencia clasificación análisis (FACS). Placa las células ordenadas en cultivo de tejidos de 100 mm tratada plato y mantienen en confluencia de 70-80%, 37 ° C y 5% CO2 hasta que la necesite.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Confirmar la señal de la luciferasa con kit de ensayo de luciferasa. Placa 10 x 104 clasificado células por pocillo en una illuminometer compatible 96 bien placa e incuban las células durante la noche a 37 ° C y 5% CO2. Después de 24 h, poner la placa de la pozo 96 a temperatura ambiente y añadir Reactivo estable-Glo a los medios cultivados en los pozos en relación 1:1. Permitir que las células lyse durante 5 minutos y leer en espectrofotómetro de la luminescencia.</li>
	<li>Traer el plato de 100 mm bajo una campana de cultivo de tejidos. Desechar el medio sobrenadante. Lavar las células una vez con 2 mL de PBS 1 x.</li>
	<li>Añadir 2 mL de tripsina 0.25% y vuelva el plato de 100 mm a la incubadora durante 2-3 minutos. Después de 2-3 min, busque células desalojadas bajo microscopio y añadir 8 mL de RPMI para desactivar la tripsina.</li>
	<li>Recoger la suspensión de células en un tubo cónico de 15 mL y centrifugar a 314 x g durante 5 min obtener un pellet. Deseche el sobrenadante. Lavar el precipitado de células con 1 mL de PBS 1 x, suspender el sedimento en 5 mL de RPMI y determinar la densidad celular con un hemacitómetro15. Yhe restante solución celular 314 x g durante 5 min obtener un pellet de centrífuga.</li>
	<li>Suspender el sedimento en RPMI para obtener una concentración de 4 x 105 células/10 μl. Tomar 5 μl de la suspensión celular y 5 μl de matrigel hacer 10 μl de la solución celular para cada inyección.</li>
</ol>4. ultrasonido dirigida a la glándula suprarrenal (NB) o implantación de Sub Renal cápsula (ES)
Nota: Todos los procedimientos de ultrasonido se realizan con una alta resolución en vivo sistema de imagen. Para los procedimientos descritos, se utilizó el transductor, que tiene una frecuencia de centro de 40 MHz y un ancho de banda de 22-55 MHz.
<ol><li>Utilizar ratones NSG inmune deficiencia de 6-8 semanas de edad para todos los procedimientos de inyección.</li>
	<li>Enfriar el matrigel y esterilizadas jeringas Hamilton con una aguja de 27G (1.25"), y catéteres de 22G (0,9 mm de diámetro externo, longitud de 25 mm) durante la noche a 4 ° C.</li>
	<li>Coloque la solución celular preparada en el paso 3 en el hielo.</li>
	<li>Anestesiar los ratones en una cámara de inducción con isoflurano 2% del O2 a 2 L/min. Nota: La anestesia adecuada se determina con la falta de movimiento activo y el mantenimiento de la respiración espontánea.</li>
	<li>Una vez anestesiados, depilarse la espalda y el flanco de los animales con loción de retiro del pelo (como Pamela) y una máquina de afeitar.</li>
	<li>Traslado del animal a la plataforma de proyección de imagen con el lado abdominal, donde la nariz del animal se coloca en una ojiva y asegurada al inhalar isoflurano.</li>
	<li>Colocar ungüento óptico en ojos del animal para prevenir la resequedad. El ratón en el lugar para evitar cualquier movimiento involuntario de la cinta.</li>
	<li>Identificar hígado murino, la vena cava, bazo, riñón izquierdo y la glándula suprarrenal izquierda adyacente mediante visualización ecográfica.</li>
	<li>Utilizar guantes estériles, mascarilla y gorro para protección personal y mantenimiento de condiciones estériles. Bajo dirección del ultrasonido, suavemente inserte un catéter 22G a través de la piel y músculo de nuevo directamente en la glándula suprarrenal izquierda para proporcionar un canal para la inyección celular. Retire la aguja y deja el catéter en su lugar.</li>
	<li>Carga una jeringa Hamilton refrigerada equipado con una aguja de pequeño calibre con 10 μl de solución de la célula, entonces guía la jeringa stereotactically a través del catéter colocado en el centro de la glándula suprarrenal.</li>
	<li>Inyectar las células específicas del tejido suprarrenal. Deje la aguja en su lugar por 1-2 min permitir el matrigel establecer. Lentamente retire la aguja, seguida de la remoción del catéter.</li>
	<li>Coloque el ratón en su jaula y asegúrese de que el ratón recupera la conciencia suficiente para mantener el recumbency esternal. Nota: debido al carácter mínimamente invasivo de esta técnica, dolor post procedimiento es mínima, pero siendo monitoreados sobre una base diaria con controles de salud de ratones. "debe seguirse con una frase:"si inesperados signos de dolor o angustia se identifican durante el curso de un experimento, consultar con la unidad de apoyo veterinario institucional para obtener información sobre la analgesia u otro tipo de atención médica. 
</li>
</ol>

<ol><li>Sanmamed, M. F., Chester, C., Melero, I., Kohrt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+optimal+murine+models+to+investigate+immune+checkpoint+blockers+and+their+combination+with+other+immunotherapies%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Defining the optimal murine models to investigate immune checkpoint blockers and their combination with other immunotherapies.</a> Ann Oncol. 27 (7), 1190-1198 (2016).</li>
<li>Fidler, I. J., Hart, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+diversity+in+metastatic+neoplasms%3A+origins+and+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Biological diversity in metastatic neoplasms: origins and implications.</a> Science. 217 (4564), 998-1003 (1982).</li>
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<li>Van Noord, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-directed+Implantation+Using+Ultrasound+Visualization+for+Development+of+Biologically+Relevant+Metastatic+Tumor+Xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo%22%5BJournal%5D)">Tissue-directed Implantation Using Ultrasound Visualization for Development of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts.</a> In Vivo. 31 (5), 779-791 (2017).</li>
<li>Vormoor, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Preclinical+Orthotopic+Xenograft+Model+of+Ewing+Sarcoma+and+Other+Human+Malignant+Bone+Disease+Using+Advanced+In+Vivo+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Development of a Preclinical Orthotopic Xenograft Model of Ewing Sarcoma and Other Human Malignant Bone Disease Using Advanced In Vivo Imaging.</a> PLoS ONE. 9 (1), e85128(2014).</li>
<li>Hakky, T. S., Gonzalvo, A. A., Lockhart, J. L., Rodriguez, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Ewing+sarcoma+of+the+kidney%3A+a+symptomatic+presentation+and+review+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Ther+Adv+Urol%22%5BJournal%5D)">Primary Ewing sarcoma of the kidney: a symptomatic presentation and review of the literature.</a> Ther Adv Urol. 5 (3), 153-159 (2013).</li>
<li>Cheng, H., Clarkson, P. W., Gao, D., Pacheco, M., Wang, Y., Nielsen, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+Antibodies+Targeting+CSF1+Impede+Macrophage+Recruitment+in+a+Xenograft+Model+of+Tenosynovial+Giant+Cell+Tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Sarcoma%22%5BJournal%5D)">Therapeutic Antibodies Targeting CSF1 Impede Macrophage Recruitment in a Xenograft Model of Tenosynovial Giant Cell Tumor.</a> Sarcoma. 2010, 174528(2010).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Using a Hemacytometer to Count Cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology%22">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology</a>. , JoVE. Cambridge, MA. (2018).</li>
</ol>

Los autores no tienen ninguna revelación.

Implantación guiada por ultrasonido de las células NB y ES es un método seguro y eficaz para establecer xenoinjertos murinos confiables para los estudios preclínicos en Biología del cáncer. Fundamental para el éxito de la guiada por ultrasonido implantación dirigida de tejido es la presencia y la disponibilidad de personal capacitado con experiencia en la localización anatómica del órgano de interés y en inyección estereotáctica de las células tumorales.
La disociación del tejido del tumor dem...

Modelos de xenoinjerto animales son herramientas esenciales para los estudios preclínicos de nuevas terapias contra el cáncer. Xenoinjertos murinos estándar se basan en la implantación subcutánea del flanco de las células, proporcionando un sitio eficaz y accesible para monitorear el crecimiento del tumor. La desventaja de los modelos subcutáneas es su falta de características biológicas tumorales, que pueden limitar su potencial para metastatizar1. Tales limitaciones se superan mediante el uso de xenoinjertos de orthotopic en cual tumor las células se engrafted en sitios de tejido propio, proporciona un microambiente relevante potencial metastático2. Modelos de xenoinjerto de orthotopic mantienen características biológicas originales y modelos fiables para preclínica drogas discovery3,4. Las células de cáncer utilizadas para la implantación de tejido dirigida son las líneas celulares establecidas o derivados del paciente las células de tumores de pacientes. Xenoinjertos establecidos a partir de líneas celulares de cáncer pueden presentar alta divergencia genética del tumor primario en comparación con pacientes xenoinjertos derivadas5. Ante esto, el establecimiento de xenoinjertos ortotópicos derivados del paciente se ha convertido en el estándar preferido para las pruebas de nuevas terapias en descubrimiento de fármacos de cáncer.
En el neuroblastoma (NB) de cáncer pediátrico, modelos de xenoinjerto de orthotopic recapitulan la biología del tumor primario y desarrollan metástasis a sitios típicos de NB extendido6,7. NB se desarrolla en la glándula suprarrenal o a lo largo de la cadena simpática paravertebral. Los métodos más comunes de implantación ortotópica requieren procedimientos quirúrgicos trans abdominal abiertos. Tales métodos son a menudo tediosos, tienen alta morbilidad animal y períodos de recuperación complejos. Ecografía de alta resolución se ha utilizado recientemente para implantación dirigida de tejido de las células del tumor en el desarrollo de varios modelos murinos de cáncer investigación8,9. La técnica es fiable, reproducible, eficaz y seguro para el establecimiento del tumor metastático pertinentes xenoinjertos10,11.
El establecimiento de xenoinjertos de cáncer pediátrico por la implantación de aguja y localización de órgano blanco guiada por ultrasonido de líneas celulares y células tumorales derivados del paciente es demostrada11. La técnica fue utilizada por nota dirigida a la glándula suprarrenal murina. Sarcoma de Ewing (ES) es predominantemente un cáncer óseo, visto comúnmente en los huesos largos como el fémur y los huesos pélvicos12. Informes de casos han demostrado que para determinar si el crecimiento de un cáncer óseo predominante es factible en el tejido renal, fue elegida una localización capsular sub renal ortotópico implantación13. Implantación de renal sub capsular de la célula de las células tumorales se ha utilizado como un modelo prometedor para el estudio de las metástasis espontáneas ES14.

<table><tbody><tr><td>Ratones</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NOD-SCID</td><td>Charles River</td><td>394</td><td></td></tr><tr><td>NSG</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>5557</td><td></td></tr><tr><td>Cell Line&nbsp; </fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>NB</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IMR-32</td><td>ATCC</td><td>CCL-127</td><td>Línea celular de neuroblastoma humano establecida</td></tr><tr><td>SH-SY5Y</td><td>ATCC</td><td>CRL-2266</td><td>Línea celular de neuroblastoma humano establecida</td></tr><tr><td>SK-N-Be2</td><td>ATCC</td><td>CRL-2271</td><td>Línea celular de neuroblastoma humano establecida</td></tr><tr><td><fuerte>ES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC32&nbsp;</td><td></td><td></td> COGcell.ORG <td>Estableció la línea celular de sarcoma de Ewing humano</td></tr><tr><td>A673</td><td>COGcell.ORG</td><td></td><td>Estableció la línea celular de sarcoma de Ewing humano</td></tr><tr><td>CHLA-25</td><td>COGcell.ORG</td><td></td><td>Estableció la línea celular de sarcoma de Ewing humano</td></tr><tr><td>A4573</td><td>COGcell.ORG</td><td></td><td>Estableció la línea celular de sarcoma de Ewing humano</td></tr><tr><td>Cell Line media </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD BioSciences</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Disociación</fuerte>Herramientas de</td> disección KentScientific INSMOUSEKIT Kit de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> disociación de tumores humanos&nbsp;<td></td></tr><tr><td></td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-095-929</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS disociador</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS Tubos C MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-334</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de células</td><td>Corning</td><td>431751</td><td></td></tr><tr><td><strongstrong>Luciferase Tagging</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lenti-GFP1</td><td>virus University de Michigan, Vector Core</td><td></td><td>Luciferase Virus</td></tr><tr><td>Steady Glo-Luciferasa Assay Kit</td><td>Promega</td><td>E2510<</td><td></td></tr><tr><td>strong>bioluminisence Imaging</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ivis Spectrum Imaging System</td><td>PerkinElmer</td><td>124262</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferin</td><td>Promega</td><td>E160X</td><td></td></tr><tr><td>Anestésico</fuerte> </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano inhalado&nbsp;</td><td>Piramal Critical Care Inc</td><td>66794-0017-25</td><td></td></tr><tr><td>Inyección guiada por ultrasonido</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vevo 2100 Imágenes de alta resolución Jeringas</td><td>Vevo</td><td>2100</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton (aguja de calibre 27)</td><td>Hamilton</td><td>80000</td><td></td></tr><tr><td>Angiocatéter de calibre 22</td><td></td> Ungüento óptico <td>BD Biosciences</td> 381423 <td></td></tr><tr><td></td><td>Principales productos farmacéuticos</td><td>301909</td><td></td></tr><tr><td>Nair</td><td>Church & Dwight Co</td><td></td><td>Agente depilatorio</td></tr><tr><td>Aquasonic 100 Gel de transmisión de ultrasonido</td><td>Parker</td><td></td><td>Gel de ultrasonido</td></tr> <tr><td><fuerte>Histología</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD99</td><td>DAKO</td><td>M3601</td><td>Anticuerpo primario</td></tr><tr><td>tirosina hidroxilasa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2928</td><td>Anticuerpo primario</td></tr><tr><td>HRP-Polímero</td> secundario<td>Biocare</td><td>BRR4056KG</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Miscelánea</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mL Pipetas</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-676-10J</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Pipetas</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-676-10H</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Tubos de microcentrífuga</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>P1000</td><td>pipeta Eppendorf</td><td></td><td></td>3120000062</tr><tr><td>pipeta P200</td><td>Eppendorf</td><td>3120000054</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta P1000</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-375E</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta P200</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-375D</td><td></td></tr><tr><td>Ayuda de pipeta portátil</td><td>Drummond</td><td>4-000-101</td><td></td></tr><tr><td>balanza de pesaje digital para animales&nbsp;</td><td>Pinzas KentScientific</td><td>SCL-1015</td><td></td></tr><tr><td>Fisher</td><td>Scientific</td><td>06-664-16</td><td></td></tr><tr><td>Placas de fijación baja de 6 pocillos</td><td>Corning</td><td>07-200-601</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Placas tratadas para cultivo de tejidos</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB012924</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr></tbody></table>

utilización de ultrasonido guiado implantación celular dirigida de tejido para el establecimiento de xenoinjertos de tumores metastásicos biológicamente relevantes

Utilization of Ultrasound Guided Tissue-directed Cellular Implantation for the Establishment of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts

Prueba preclínica de terapias contra el cáncer se basa en modelos de xenoinjerto pertinentes que imitan las tendencias innatas del cáncer. Ventajas de los modelos estándar del flanco subcutánea incluyen facilidad procesal y la capacidad de respuesta sin la proyección de imagen invasiva y monitor la progresión del tumor. Tales modelos son a menudo inconsistentes en ensayos clínicos traslacionales y han limitado características biológicamente relevantes con baja tendencia a producir metástasis, ya que hay una falta de un microambiente nativo. En comparación, han demostrado modelos de xenoinjerto ortotópico en los sitios de tumor nativo imitar el microambiente del tumor y replicar las características de la enfermedad importante como diseminación metastásica distante. Estos modelos requieren a menudo tediosos procedimientos quirúrgicos con periodos prolongados de tiempo y recuperación anestésicas. Para hacer frente a esto, los investigadores del cáncer han utilizado recientemente técnicas de inyección guiada por ultrasonido para establecer modelos de xenoinjerto de cáncer para los experimentos preclínicos, que permite la creación rápida y confiable de modelos murinos dirigida de tejido. Visualización ecográfica también proporciona un método no invasivo para la evaluación longitudinal del engraftment del tumor y crecimiento. Aquí, describimos el método de inyección guiada por ultrasonido de las células de cáncer, utilizando la glándula suprarrenal para NB y cápsula renal sub es. Este acercamiento como mínimo invasor supera implantación tedioso cirugía abierta de las células cancerosas en ubicaciones específicas de tejido para el crecimiento y metástasis y disminuye en períodos de recuperación mórbida. Se describe la utilización de las líneas celulares establecidas y líneas celulares derivadas paciente de orthotopic inyectable. Kits comerciales prefabricados están disponibles para disociación de tumor y luciferasa el marcaje de las células. Inyección de la suspensión celular utilizando la dirección de la imagen proporciona una plataforma mínimamente invasiva y reproducible para la creación de modelos preclínicos. Este método se utiliza para crear modelos preclínicos confiables para otros cánceres tales como vejiga, hígado y ejemplificando su potencial sin explotar para numerosos modelos de cáncer de páncreas.

Utilizando los procedimientos presentados, implantación guiada por ultrasonido de las células NB en la glándula suprarrenal se realizó en una sala de procedimientos dedicado equipada con una mesa quirúrgica climatizada. Cojines de brazo y pie fueron colocados para supervisar la actividad de corazón murino (figura 1A). El animal seguía siendo anestesiado con isoflurano con inhalación de cono de nariz. Utilizando una sonda de ecografía de alta resolución, el ri...

Aquí, presentamos un protocolo utilizar inyección guiada por ultrasonido de las células de (ES) el sarcoma de Ewing y neuroblastoma (NB) (estableció líneas celulares y células tumorales derivados del paciente) en sitios biológicamente relevantes para crear modelos preclínicos fiables para el cáncer investigación.

Utilización de ultrasonido guiado implantación celular dirigida de tejido para el establecimiento de xenoinjertos de tumores metastásicos biológicamente relevantes

Preclinical testing of anticancer therapies relies on relevant xenograft models that mimic the innate tendencies of cancer. Advantages of standard ...

El objetivo de este método es establecer xenoinjertos ortotópicos de cáncer biológicamente relevantes para estudios preclínicos. Las células de neuroblastoma derivadas del paciente se inyectan en la glándula suprarrenal murina guiadas por ultrasonido sin cirugía abierta ni recuperación prolongada. Este método puede ayudar a responder preguntas críticas en la biología del cáncer y en la investigación traslacional, como los estudios de la evolución tumoral, las respuestas terapéuticas en el microambiente nativo y las metástasis.Este conocimiento mejoraría en gran medida la fiabilidad de los estudios preclínicos y facilitaría el descubrimiento de fármacos. La principal ventaja de esta técnica es que es derivada del paciente, dirigida por tejidos, eficiente y confiable en la producción de un modelo ortotópico xenografiado para la investigación de terapias contra el cáncer. Sahiti Chukkapalli, técnico sénior y nuestro director de laboratorio, demostrarán los pasos críticos del procedimiento, junto con Tina Thomas, investigadora de nuestro laboratorio.Genere una única suspensión de células cancerosas derivada del paciente a partir de tejido tumoral mediante un kit de disociación tumoral. Comience transfiriendo aproximadamente medio gramo de tejido tumoral a una placa de cultivo celular de 100 milímetros que contenga cinco mililitros de tampón RPMI suplementado con enzimas. Luego, use tijeras y pinzas de tejido para picar el tumor en pedazos pequeños de dos a cuatro milímetros.Pipetear la mezcla tumoral en un tubo disociador y cerrar el tubo. Invierta el tubo, conéctelo al manguito de un disociador de tejido y disocie el tejido utilizando el programa adecuado. Después de disociarse, incubar la suspensión de células tumorales en una rejilla giratoria a 37 grados centígrados durante una hora.Triturar la suspensión celular cada 15 minutos durante la incubación. Después de la incubación, transfiera la suspensión celular a un nuevo tubo cónico de 50 mililitros y agregue 10 mililitros de RPMI. A continuación, centrifuga la suspensión celular a 314 g durante cinco minutos.Después de la centrifugación, retire el sobrenadante y suspenda el pellet en cinco mililitros de RPMI. Pase la suspensión celular a través de un colador celular de 40 micras y recoja la solución colada en un tubo nuevo de 50 mililitros. Después de lavar el colador con cinco mililitros de medio RPMI, centrifugar la suspensión de celdas a 314 g durante cinco minutos para recolectar un pellet.Cuente las células con un hemocitómetro. A continuación, suspenda el pellet en RPMI para obtener una concentración final de cuatro veces 10 a las cinco células por 10 microlitros de volumen. Transfiera cinco microlitros de esta suspensión celular por inyección a un tubo nuevo, y el mismo volumen de matriz de membrana basal para hacer 10 microlitros de solución celular para cada inyección y colóquela en hielo.Transfiera el ratón a la plataforma de imágenes con el lado abdominal hacia abajo. Coloque y asegure el cono de la nariz para mantener la anestesia con isoflurano. Comience el procedimiento de implantación utilizando una loción depilatoria y una afeitadora para depilar la espalda y el flanco de un ratón NSG inmunodeficiente de seis a ocho semanas de edad debidamente anestesiado.Aplique ungüento óptico sobre los ojos del animal para evitar que se sequen. Luego, pegue el mouse en su lugar para evitar cualquier movimiento involuntario. A continuación, utilice la visualización ecográfica para identificar el hígado murino, la vena cava, el bazo, el riñón izquierdo y la glándula suprarrenal izquierda adyacente.Cargue una jeringa Hamilton refrigerada, equipada con una aguja de pequeño calibre, con 10 microlitros de solución celular. Luego, bajo la guía de ultrasonido, insertó suavemente un catéter frío de calibre 22 a través de la piel y el músculo de la espalda, directamente en la glándula suprarrenal izquierda para proporcionar un canal para la inyección celular. Retire la aguja y deje el catéter en su lugar.La visualización de la glándula suprarrenal a lo largo de la inserción del catéter, junto con la aguja y su trayectoria, es imprescindible para garantizar una lesión mínima en las estructuras y órganos circundantes y una menor morbilidad murina. Luego, guíe la jeringa a través del catéter ubicado en el centro de la glándula suprarrenal. A medida que la jeringa se guía a través del catéter, es importante mantener la estabilidad del catéter y observar el avance de la aguja.Tenga en cuenta que la aguja en sí se extiende aproximadamente dos milímetros más allá de la terminación del catéter, su posición se ve fácilmente en la ecografía. Inyecte las células en el tejido suprarrenal objetivo. Deje la aguja en su lugar durante uno o dos minutos para permitir que la matriz de la membrana basal se asiente.Después de que la matriz de la membrana basal se haya fijado, retire lentamente la aguja, seguido de la extracción del catéter. Finalmente, coloque al ratón en una jaula de recuperación hasta que recupere la conciencia suficiente para mantener la decúbito esteral antes de regresar a la jaula de origen. La ecografía monitorea la progresión tumoral in vivo.Esta imagen muestra una ecografía de la glándula suprarrenal, una semana después de la inyección. Aquí, las imágenes de luminiscencia de un ratón inyectado en neuroblastoma una semana después de la inyección, muestran lecturas que no son indicativas de injerto tumoral. Después de dos semanas, las imágenes de ultrasonido muestran el injerto tumoral y la progresión a un área de aproximadamente 40 milímetros cuadrados.La bioluminiscencia a las dos semanas después de la inyección mostró un resplandor de 10 a la séptima, lo que sugiere que la absorción celular y el crecimiento tumoral se correlacionan con los hallazgos ecográficos. Las imágenes de ultrasonido ocho semanas después de la inyección mostraron un crecimiento continuo del tumor con una medición de área de más de 100 milímetros cuadrados. Una vez más, la bioluminiscencia confirmó los hallazgos de la ecografía con niveles de radiación aumentados de 10 a nueve.La ecografía 3D del tumor mostró un volumen superior a los 100 milímetros cúbicos, la línea de base que nuestro laboratorio utiliza para el inicio de los ensayos terapéuticos preclínicos. El tumor extirpado midió macroscópicamente más de un centímetro de tamaño, correlacionándose con las mediciones ecográficas y las señales de luminiscencia. Este medio proporciona una demostración de cómo establecer con éxito xenografías ortotópicas suprarrenales con células de neuroblastoma derivadas de pacientes, utilizando la guía por ultrasonido.Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en menos de 12 minutos por inyección si se realiza correctamente.

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Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

En este video, las células de melanoma derivadas de humanos se implantan subcutáneamente en la región del flanco de un ratón inmunodeprimido. El modelo PDX permite la investigación preclínica de células de melanoma que recapitulan mejor la heterogeneidad tumoral y la agresividad del melanoma observadas en condiciones in vivo.

Modelado de xenoinjertos derivados de pacientes: una técnica para generar modelos de ratón de melanoma

La técnica establecida para inocular ortotópico xenoinjertos de cáncer de vejiga invasivos primarios requiere laparotomía y la movilización de la vejiga. Este procedimiento inflige una morbilidad significativa en los ratones, es técnicamente difícil y consume mucho tiempo. Lo tanto, desarrolló una alta precisión, abordaje percutáneo utilizando la guía del ultrasonido.

Mínimamente Invasiva Establecimiento de murino ortotópico xenoinjertos vejiga

Este protocolo describe la generación de modelos de xenoinjerto ortotópico derivados del paciente inculcando intravesicamente células carcinoma de células uroteliales de alto grado o inyectando intrarectalmente células cancerosas colorrectales en combinación diabética/grave no obesa ratones de inmunodeficiencia (NOD/SCID) para el crecimiento tumoral primario y metástasis espontáneas bajo la influencia de células estromales de ganglios linfáticos, lo que imita la progresión de las enfermedades...

Modelos de xenoinjerto ortotópico derivados del paciente para el carcinoma de células uroteliales humanas y el crecimiento tumoral del cáncer colorrectal y la metástasis espontánea

Los modelos de ratón de xenoinjerto de melanoma uveal de hígado humano ortotópico se crearon utilizando técnicas quirúrgicas de implantación ortotópica con técnicas de inyección de agujas y trozos tumorales derivados del paciente con líneas celulares de melanoma uveal humano cultivadas.

Generación de una plataforma de xenoinjerto de melanoma uveal humano ortotópico hepático en ratones inmunodeficientes

Describimos un protocolo para la implantación guiada por ultrasonido de líneas celulares de adenocarcinoma ductal pancreático derivados de la murino directamente en el sitio del tumor nativo. Este enfoque resultó en tumores pancreáticos detectables por la ecografía dentro de 2-4 semanas de la inyección, y redujo significativamente la proporción de la sesión de células tumorales en la pared peritoneal en comparación con la implantación ortotópica quirúrgica.

Ultrasonido-Guiado Implantación Ortotópica de Adenocarcinoma Ductal Pancreático Murino

Aquí presentamos un protocolo para probar la eficacia de las terapias dirigidas seleccionadas en base a la composición genómica de un tumor. El protocolo describe la identificación y validación de reordenamientos estructurales del ADN, injerto de tumores de los pacientes en ratones y pruebas de respuestas a los fármacos correspondientes.

Pruebas de terapias dirigidas en cáncer mediante análisis de alteración estructural del ADN y xenoinjertos derivados del paciente

Los modelos de metástasis óseas no desarrollan metástasis de manera uniforme o con una incidencia del 100%. La inyección directa de células tumorales intraóseas puede resultar en la embolización del pulmón. Presentamos nuestra técnica de modelado de tumores óseos primarios y metástasis óseas utilizando la implantación de injerto de tumor sólido en el hueso, lo que lleva a un injerto y crecimiento reproducibles.

Modelado de tumores óseos primarios y metástasis óseas con implantación de injerto de tumor sólido en hueso

Los modelos PDX de metástasis del sistema nervioso central representan las características fenotípicas y moleculares de la metástasis humana, lo que los convierte en excelentes modelos para estudios preclínicos. Aquí se describe cómo establecer modelos PDX y las rutas de inoculación que se utilizan mejor para estudios preclínicos.

El establecimiento y la utilización de modelos de xenoinjerto derivados del paciente de metástasis del sistema nervioso central

Presentamos un protocolo para generar un modelo de cáncer de páncreas ortotópico mínimamente invasivo mediante inyección guiada por ultrasonido de células de cáncer de páncreas humano y el posterior monitoreo del crecimiento tumoral in vivo por imagen ecográfica.

Generación de un xenoinjerto ortotópico de células de cáncer de páncreas mediante inyección guiada por ultrasonido

Este protocolo describe un método eficiente y no quirúrgico para la implantación ortotópica de xenoinjertos derivados de pacientes con cáncer de mama en ratones. La técnica consiste en la disociación enzimática del tumor seguida de una inyección directa en las almohadillas de grasa mamaria, lo que permite una implantación de alto rendimiento. La validación exhaustiva garantiza la fidelidad del modelo, lo que facilita estudios rigurosos en varios subtipos de cáncer de mama.

Disociación de alto rendimiento e implantación ortotópica de xenoinjertos derivados de pacientes con cáncer de mama

El objetivo de este protocolo es proporcionar a los investigadores una técnica altamente reproducible para las implantaciones intracraneales.

Implantación intracraneal estereotáctica de líneas celulares de xenoinjertos derivadas de pacientes con glioblastoma en ratones

Aprende a establecer xenoinjertos ortotópicos de neuroblastoma mediante inyección guiada por ultrasonido en la glándula adrenal murina. Este método no invasivo utiliza células derivadas de pacientes para crear modelos preclínicos fiables que mejoran los estudios de evolución tumoral y respuestas terapéuticas.

Utilización de ultrasonido guiado implantación celular dirigida de tejido para el establecimiento de xenoinjertos de tumores metastásicos biológicamente relevantes (Video) | JoVE Journal

Utilización de ultrasonido guiado implantación celular dirigida de tejido para el establecimiento de xenoinjertos de tumores metastásicos biológicamente relevantes

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