Preparación de desarrollar tejido olfatorio periférico para Molecular y el análisis de Immunohistochemical en Drosophila

El objetivo general de la estadificación y disección de los tejidos olfativos de la periferia en desarrollo de la pupila y la periferia adulta en especies de Drosophila es generar muestras para análisis moleculares y de desarrollo de los tejidos olfativos periféricos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del desarrollo y la evolución del sistema olfativo, como la expresión, la dinámica, los niveles y los patrones de genes específicos en los tejidos olfativos periféricos en desarrollo. A través de este método podemos obtener información sobre el desarrollo del sistema olfativo periférico en las especies de Drosophila.

También se puede aplicar a otros sistemas sensoriales, como el sistema periférico del gusto y el visual. Para un experimento de secuenciación de ARN, planee recolectar entre 100 y 200 discos de antenas o antenas para cuatro etapas diferentes de desarrollo. Para la inmunohistoquímica, planee diseccionar de 10 a 20 moscas.

Limpie todos los materiales involucrados en la disección con etanol al 70%. A continuación, limpie aún más los materiales con neutralizadores de RNasa. Y haga todas las soluciones con agua libre de nucleasas o tratada con DEPC.

Para recolectar pupas, monitoree las larvas en intervalos de 30 minutos. Y recolectar pupa en la etapa de preparación APF de hora cero. Las larvas estarán inmóviles y rodeadas por una caja de pupa muy clara, de color casi blanco.

En esta etapa, transfiera las larvas a una pequeña placa de Petri de dos pulgadas con un papel de filtro húmedo. Para las disecciones de la etapa APF de cero horas, proceda inmediatamente a recolectar el disco antenal prepupal. De lo contrario, cubra el plato con una película de parafina y permita que los animales se desarrollen a 25 grados centígrados, hasta que estén en la etapa de desarrollo de interés.

Para escenificar el desarrollo de la pupa de otras especies de Drosophila, recoja las larvas de prepupa de cero horas y clasifíquelas en un frasco nuevo. A continuación, registra el número de días desde la prepupa hasta la edad adulta. Y simplemente escale este tiempo a la línea de tiempo de melanogaster.

Para empezar, enfríe 150 microlitros de solución de aislamiento de ARN en un tubo de 1,5 milímetros sin ARNasa. A continuación, deposite varias gotas separadas de PBS en la almohadilla de disección. En cada gota de PBS, coloque una pupa para ser diseccionada.

Para las pupas de cero a dos horas, use fórceps para agarrar los ganchos bucales y tire de estas estructuras para arrancar y exponer los cerebros y los discos imaginarios. Durante las pupas de ocho horas, primero pela suavemente la caja de la pupa desde el cuarto más anterior de la pupa, para exponer la cabeza en desarrollo. A continuación, separe la cabeza de la articulación del cuello.

Los discos de las antenas están en la cabeza en esta etapa de desarrollo. Ahora transfiera los tejidos que contienen los discos antenales a otra gota de PBS. A continuación, identifique el disco antenal del ojo conectado al cerebro en los lóbulos ópticos.

Con pinzas, desconecte el disco de la antena del ojo y transfiéralo a una nueva gota. En las pupas de ocho horas, los discos oculares acúpan los discos antenales y ambos son anteriores al cerebro. En la siguiente gota, divida el ojo y los discos antenales con pinzas.

A continuación, con una punta de pipeta P20, recoja suavemente el tejido diseccionado con una cantidad mínima de líquido. Deposite el disco en el reactivo de la solución de aislamiento de ARN y continúe diseccionando los discos de antenas hasta que se recolecten al menos 100. A las 40 horas después de la formación de la pupa, la antena adulta ha tomado su forma final, pero sigue siendo transparente.

Se necesitan al menos 50 prepupas en esta etapa para la recolección de secuencias de ARN. Primero prepare 150 microlitros de solución de aislamiento de ARN refrigerada. En la almohadilla de disección, coloque una pupa en una gota de PBS.

A continuación, estabilice el cuerpo con un par de pinzas y retire suavemente la caja de la pupa desde el cuarto más anterior para exponer la cabeza. Luego, retire con cuidado la cabeza en la articulación del cuello. Ahora transfiera suavemente la cabeza a una gota limpia de PBS.

Allí, para quitar la membrana que rodea la cabeza, pipetee la cabeza hacia arriba y hacia abajo en el PBS. Con esta limpieza, la antena debería volverse visible. Ahora desconecte la antena de la membrana entre el segundo y el tercer segmento en la unión segmentaria.

El tercer segmento contiene los receptores olfativos antenales. A continuación, utilice una pipeta para transferir suavemente el tejido diseccionado a la solución de aislamiento de ARN, minimizando la cantidad de líquido transferido. Para la extracción de ARN, disecciona a los adultos mientras están anestesiados en una almohadilla de CO2.

Primero, trate la almohadilla de CO2 y las pinzas con inhibidores de la ARNasa. A continuación, anestesiar a los adultos y observar la almohadilla bajo un microscopio de disección. Con dos pares de pinzas, estabilice el cuerpo y tire o pellizque suavemente el tercer segmento antenal del segundo segmento antenal para recoger los tejidos.

Transfiera las antenas a un tubo de solución de aislamiento de ARN sumergiendo las pinzas en el líquido y soltándolas. La antena debe estar sumergida. Si la antena se atasca en la pared lateral, el ARN se degradará prematuramente.

Después de recolectar suficientes antenas, proceda con la extracción del ARN. O almacene el tubo de recolección a 80 grados centígrados indefinidamente. Si la antena está diseñada para inmunohistoquímica, realice esta disección en una almohadilla de disección con la mosca sumergida en PBS con o sin Triton.

El tejido olfativo en desarrollo disecado se puede utilizar para la extracción de ARN seguida de RT-PCR para evaluar la expresión génica. Por ejemplo, la expresión de los transcritos de los receptores de superficie y de los receptores olfativos puede estudiarse de esta manera. Alternativamente, los tejidos se pueden utilizar para la inmunohistoquímica para determinar el patrón de expresión y la localización subcelular de genes de interés.

Por ejemplo, las moscas transgénicas Rn-EGFP se pueden teñir con anticuerpos anti-GFP y anti-Laminina. El análisis muestra que a las 40 horas después de la formación de la pupa, el gen Or67d está activo en células específicas de la antena, impulsando la expresión de GFP bajo el sistema GAL4-UAS. Una vez dominadas, las disecciones se pueden realizar en una hora si se realizan correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener un tiempo y una selección programada, envejecida y disección adecuadamente programada, en función del marco de tiempo de desarrollo de la pupa para cada especie de Drosophila. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como qRT-PCR, inmunohistoquímica, así como otras técnicas de tinción in vivo y perfiles transcripcionales para responder preguntas adicionales sobre el patrón y los perfiles de transcripción a nivel de sistemas dentro de un tejido en desarrollo. Después de su desarrollo, esta técnica allanará el camino para que los investigadores en el campo de la evolución y el desarrollo de sistemas sensoriales exploren la dinámica transcripcional y el descubrimiento de nuevos genes en otros sistemas sensoriales en las especies de Drosophila.

No olvide que trabajar con pinzas afiladas, algunas soluciones de extracción de ARN y formaldehído puede ser extremadamente peligroso. Siempre se deben tomar precauciones como la práctica previa con disecciones, para desarrollar la motricidad fina, la alta atención y el uso de ropa de laboratorio adecuada mientras se realiza este procedimiento.