Name: Registro electrofisiológico de Drosophila Tricoide Sensilla en Respuesta a Odorantes de Baja Volatilidad (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Aprende a registrar electrofisiológicamente sensilios tricoides de Drosophila en respuesta a odorantes de baja volatilidad. Este método permite estudiar neuronas olfativas y feromonas cuticulares de cadena larga.

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Agradecemos a Ye Zhang por la ayuda con los trazos de muestra y Tin Ki Tsang por la ayuda con las fotos. Este trabajo fue apoyado por un Premio de carrera temprana de la fundación de Ray Thomas Edwards y una concesión de NIH (R01DC015519) a las concesiones de C.-YS y de NIH (R01DC009597 y R01DK092640) a JWW

1. Preparación del hardware para la grabación de at4 <ol><li> Utilice un instrumento de extracción de pipeta para preparar electrodos con tubos de vidrio de aluminosilicato (OD 1,0 mm, ID 0,64 mm). Blunt la punta del electrodo de referencia ligeramente con un par de pinzas finas para facilitar la inserción en el clypeus de la mosca ( es decir, una placa redondeada en la parte delantera de la cabeza de la mosca, por encima de las partes bucales). NOTA: En este estudio se utilizaron varones WT de 7 días de edad (Berlín). Utilice solución salina AHL 14 como el electrolito para ambos electrodos. </li><li> Preparar 1 L de AHL mediante la mezcla de 900 ml de agua destilada con 6,312 g de NaCl, 0,373 g de KCl, 0,337 g de NaHCO 3, 0,1120 g de NaH 2 PO 4, 1,892 g de trehalosa ּ 2 H 2 O, 3,423 g de sacarosa, 1,192 g de HEPES y 8,2 ml de MgCl _ { 2} 1M. Utilizando agua destilada, llevar el volumen total hasta 1 L. Llevar el pH a 7,4 usando NaOH 1 N y esterilizar la solución con unSistema de filtro accionado por vacío. Para almacenamiento a largo plazo, mantenga las alícuotas de AHL a 4 ° C. NOTA: Las entregas consistentes de ácido palmitoleico dependen de la uniformidad entre los cartuchos. Es crítico que cada cartucho esté ensamblado de una manera reproducible. </li><li> Utilizando una cuchilla de afeitar, retire 0,9 cm de la punta de una punta de pipeta de 200 μl para crear la primera sección del cartucho, que mide 4,1 cm; Consulte las dimensiones detalladas en la Figura 1A . Utilice otra punta de pipeta de 200 μl y quite 1,7 cm y 1,5 cm de la punta y la base, respectivamente, para crear la segunda sección del cartucho, midiendo 1,8 cm ( Figura 1A ). Utilice una regla para asegurar la reproducibilidad. </li><li> Utilice un perforador de ⅛ &quot;para cortar los discos del papel de filtro. </li><li> Utilice fórceps para colocar un disco de papel de filtro en la punta de la segunda sección del cartucho. Confirme visualmente que hay una abertura en la punta del cartucho a través de la cual puede pasar el aire. </li><li> Conecte las secciones de cartucho primero y segundo juntos, como se muestra en la Figura 1A . Ángulo de la segunda sección del cartucho hacia abajo para facilitar la orientación cuadrada en la preparación ( Figura 1B ). </li><li> Conecte el cartucho con el tubo de suministro de olor, que está montado en un micromanipulador. NOTA: Este diseño permite que el cartucho sea girado hacia afuera para facilitar el intercambio ( Figura 1C ). </li><li> Ajuste el flujo de aire humidificado constante a 2 L / min en un controlador de masa y el flujo de odorante a 500 mL / min en otro controlador de masa. </li><li> Usando el software (vea la Tabla de Materiales ), programe el procedimiento para administrar un soplo de olor de 500 ms. </li></ol> 2. Preparación de Soluciones Odorantes de Ácido Palmitoleico para Entrega NOTA: Or47b ORNs responder tanto a cis - y ácido -palmitoleic trans. Como el ácido palmitoleico es inestable en RT, las existencias se almacenan a -20 ° C y se utilizan dentro de un mes tras la apertura. El etanol es el disolvente de elección para el ácido palmitoleico. <ol><li> Utilice un mezclador de vórtice para mezclar bien 10 μl de ácido cis- o trans- palmitoleico o diluciones con 90 μl de etanol al 100% para diluciones en serie de diez veces en microtubos de 1,7 ml. Preparar diluciones frescas de ácido palmitoleico diariamente antes de los experimentos y usarlos en un día. NOTA: Para los odorantes que no son solubles en etanol, se recomienda un vial de vidrio para preparar diluciones de olor con otros tipos de disolventes orgánicos. </li><li> Utilizando una micropipeta P10, aplicar 5 μl de soluciones de ácido cis- palmitoléico de las diluciones deseadas al papel de filtro en cada cartucho correspondiente. NOTA: La dosis más alta (10 -1 ) contiene 450 μg del compuesto. Para las soluciones de ácido trans -palmitoleico, aplique 4,5 μL en lugar de modo que la dosis más alta (10 -1 ) también contenga 450 μg de tÉl compuesto. </li><li> Para evaporar completamente el disolvente, coloque los cartuchos de ácido palmitoleico en un desecador de vacío durante 1 h a RT y 7,59 mmHg de presión. NOTA: Los cartuchos se pueden utilizar hasta 4 h en RT. </li></ol> 3. Preparación de Drosophila para acceso listo a la Sensilla at4 para grabaciones electrofisiológicas in vivo NOTA: Las moscas WT (Berlín) se crian en medio estándar de harina de maíz a 25 ° C en un ciclo 12:12 luz-oscuridad. Tras la eclosión, las moscas se separan por sexo en grupos de diez, por lo que se alojan en grupo hasta los 7 días de edad. Or47b ORNs tanto en moscas masculinas como femeninas responden al ácido palmitoleico. Por simplicidad, sólo las moscas macho se examinan en el estudio actual. <ol><li> Montar una diapositiva de mosca-prep: en una diapositiva de cristal, coloque un cubreobjetos de vidrio (18 x 18 mm 2 ) sobre una pequeña cantidad de arcilla de modelado, formando un ángulo de ~ 3 ° con el portaobjetos de vidrio. Coloque la cinta de doble cara en el interior eDge de la cubreobjetos y en el área de la corredera inmediatamente debajo. Reemplace con cinta nueva por cada día de grabación ( Figura 2A ). </li><li> Utilice un aspirador de mosca 15 para recoger la mosca de interés en el tubo y luego coloque una punta de pipeta de 200 μL sobre el extremo del tubo. Simultáneamente deslice el tubo hacia adelante mientras sopla aire en el tubo para empujar la mosca hasta el extremo de la punta de la pipeta. Utilice una cuchilla de afeitar para cortar justo debajo del cuerpo de la mosca y 2 longitudes de las cabezas por encima de la mosca. </li><li> Tamp la parte inferior de la punta de la pipeta con la arcilla de modelado, empujando la mosca hacia arriba hasta tanto las antenas y el clypeus están expuestos ( Figura 2B ). Para evitar la muerte de la mosca, agregue sólo suficiente arcilla para exponer las antenas y aristae, ya que esto evita que el abdomen de la mosca de ser aplastado. Además, agregue la arcilla lentamente y suavemente para prevenir cualquier constricción repentina. Confirme que la mosca está viva revisando la antenaO movimiento de probóscide. </li><li> Use fórceps para maniobrar la punta de la pipeta que aloja la mosca. Oriente la cabeza de modo que el clypeus esté mirando a la derecha del observador. Ajustar la preparación a lo largo de la cubreobjetos con una pinza fina hasta que el lado lateral de la antena se apoye contra la superficie tapada de la cubreobjetos ( Figura 2B ). </li><li> Coloque una barra de sujeción en el arista para asegurar la antena a la cinta de doble cara para evitar el movimiento ( Figura 2B ). NOTA: La varilla de sujeción se extrae de un capilar de vidrio de borosilicato con un extractor de pipeta y se mantiene en posición con arcilla de modelado ( Figura 2A ). </li><li> Coloque la preparación en el escenario de la plataforma ( Figura 2C ). Utilizando el microscopio, confirme que los tricoides son visibles a lo largo del borde distal-lateral del tercer segmento de la antena. NOTA: Idealmente, la sensilla debe ser claramente silueta contra el fondo, lo que simplifica su<html> Identificación y facilita el registro ( Figura 3 ). En esta preparación, la mayoría de los accesibles tricino sensilla son del tipo at4. </li><li> Mantenga la preparación bajo flujo de aire humidificado constante (2 L / min) suministrado a través de un tubo de suministro de aire separado a una distancia de aproximadamente 2 cm de la preparación ( Figura 4 ), como se ha descrito anteriormente 2 , 15 . </li></ol> 4. Registro de At4 Sensillum Actividad de Or47b ORNs en los tricoides at4 en respuesta al ácido palmitoleico <ol><li> Inserte el electrodo de referencia en el clypeus ( Figura 3A ). Para evitar daños en los tejidos, asegúrese de que el electrodo se inserta justo debajo de la superficie, donde puede ponerse en contacto con la hemolinfa bajo la cutícula, con un movimiento rápido y suave. </li><li> Baje el electrodo de grabación lentamente hasta que entre en el mismo plano de visión que el objetivo sensillum (= &quot;Xfig&quot;&gt; Figura 3B). Grabe bajo un objetivo de 50X. NOTA: La cutícula tricoidal resistente requiere insertar el electrodo de registro en la base sensilar, cuya área más amplia proporciona un objetivo mayor que reduce la probabilidad de que el electrodo se desvíe ( figura 3B , inserto). </li><li> Antes de aplicar estímulos de olor a un sensor, observe los siguientes criterios de selección: Cualquier tricero que no cumpla con estos estándares debe ser rechazado y otro sensillum elegido en su lugar. <ol><li> Observe una alta relación señal-ruido (vea la Figura 3C para un ejemplo). </li><li> Observar identificables picos de 4A y 4C neuronas ( Figura 3C ]. NOTA: Es de destacar que la amplitud pico at4B parece muy similar a at4A 10 y no se puede identificar fácilmente sin estimulación olor. </li><li> Obsérvese que la tasa de disparo basal de las neuronas at4A esAlrededor o por debajo de 20 Hz. NOTA: Este criterio es específico para at4A porque la tasa de disparo basal para la neurona es mayor que la de los ORN básicos 2 . Un disparo basal mucho más alto indica que las neuronas pueden haber sido dañadas durante la inserción del electrodo. </li></ol></li><li> Conecte el cartucho al tubo de suministro de olor. Comience con el control de disolventes y después los odorantes, desde concentraciones bajas a altas. Utilice el micromanipulador para maniobrar el cartucho hacia la preparación mientras que apunta el cartucho directamente en la cabeza de la preparación. Confirme visualmente que el cartucho está apuntando directamente a la antena ( Figura 4 ) desde unos pocos milímetros de distancia. NOTA: El objetivo es orientar la apertura del cartucho directamente en la antena y colocarla cerca del tejido objetivo. </li><li> Asegúrese de que el cartucho de olor se separa del electrodo de registro a su derecha de 1 - 2 mm y de la mosca preP deslizarse por debajo de aproximadamente 1 mm. NOTA: En la configuración descrita aquí, el cartucho de olor está estrechamente rodeado por el electrodo de registro, el electrodo de referencia y la corredera de preparación de mosca ( Figura 4 ). NOTA: Preste atención a la distancia entre el cartucho y los electrodos de grabación / referencia. Se recomienda una distancia de alrededor de 4 mm 1 . El contacto involuntario puede terminar la señal y romper la punta del electrodo de grabación, dañando la neurona actual y complicando otras grabaciones. NOTA: Considere la distancia que separa el cartucho y la diapositiva de preparación de la mosca. Tocar el cubreobjetos también puede desalojar el electrodo de grabación para interrumpir la grabación. </li><li> Pulse &quot;Grabar&quot; en el software de adquisición de datos para iniciar la grabación. NOTA: Para cada grabación de 10 s, se suministra un solo impulso de olor de 500 ms directamente a la antena, como se describe en el paso 1.9. </li><li> Después de la aplicación odorante,Cuidadosamente retraer el cartucho antes de reemplazarlo con un cartucho de la siguiente concentración más alta. Continúe hasta que se obtenga el rango de dosificación completo. NOTA: Se recomienda que solo se registre un Or47b ORN de cada mosca para evitar posibles efectos de adaptación. </li><li> Enjuague bien el electrodo de registro con agua destilada después de terminar la grabación para el día. </li><li> Analizar y trazar los datos utilizando software de análisis offline disponible comercialmente. </li></ol>

<ol><li>Lin, H. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal+modulation+of+pheromone+detection+enhances+male+courtship+success%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Hormonal modulation of pheromone detection enhances male courtship success.</a> Neuron. 90 (6), 1272-1285 (2016).</li>
<li>Hallem, E. A., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coding+of+odors+by+a+receptor+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Coding of odors by a receptor repertoire.</a> Cell. 125 (1), 143-160 (2006).</li>
<li>Silbering, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+function+and+integrated+wiring+of+the+evolutionarily+distinct+Drosophila+olfactory+subsystems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Complementary function and integrated wiring of the evolutionarily distinct Drosophila olfactory subsystems.</a> J Neurosci. 31 (38), 13357-13375 (2011).</li>
<li>Min, S., Ai, M., Shin, S. A., Suh, G. S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dedicated+olfactory+neurons+mediating+attraction+behavior+to+ammonia+and+amines+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Dedicated olfactory neurons mediating attraction behavior to ammonia and amines in Drosophila.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 110, 1321-1329 (2013).</li>
<li>Kurtovic, A., Widmer, A., Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+class+of+olfactory+neurons+mediates+behavioural+responses+to+a+Drosophila+sex+pheromone%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single class of olfactory neurons mediates behavioural responses to a Drosophila sex pheromone.</a> Nature. 446 (7135), 542-546 (2007).</li>
<li>Van der Goes van Naters, W., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptors+and+neurons+for+fly+odors+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Receptors and neurons for fly odors in Drosophila.</a> Curr Biol. 17, 606-612 (2007).</li>
<li>Schlief, M. L., Wilson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+processing+and+behavior+downstream+from+highly+selective+receptor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Olfactory processing and behavior downstream from highly selective receptor neurons.</a> Nat Neurosci. 10 (5), 623-630 (2007).</li>
<li>Laughlin, J. D., Ha, T. S., Jones, D. N. M., Smith, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+Pheromone-sensitive+neurons+is+mediated+by+conformational+activation+of+pheromone-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Activation of Pheromone-sensitive neurons is mediated by conformational activation of pheromone-binding protein.</a> Cell. 133 (7), 1255-1265 (2008).</li>
<li>Gomez-Diaz, C., Reina, J. H., Cambillau, C., Benton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligands+for+pheromone-sensing+neurons+are+not+conformationally+activated+odorant+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Ligands for pheromone-sensing neurons are not conformationally activated odorant binding proteins.</a> PLoS Biol. 11 (4), e1001546(2013).</li>
<li>Dweck, H. K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pheromones+mediating+copulation+and+attraction+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+USA%22%5BJournal%5D)">Pheromones mediating copulation and attraction in Drosophila.</a> Proc Nat Acad USA. 112, 2829-2835 (2015).</li>
<li>Cappa, C. D., Lovejoy, E. R., Ravishankara, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaporation+rates+and+vapor+pressures+of+the+even-numbered+C8-C18monocarboxylic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+A%22%5BJournal%5D)">Evaporation rates and vapor pressures of the even-numbered C8-C18monocarboxylic acids.</a> J Phys Chem A. 112 (17), 3959-3964 (2008).</li>
<li>Kimura, K. -I., Sato, C., Yamamoto, K., Yamamoto, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+the+back+or+front%3A+the+courtship+position+is+a+matter+of+smell+and+sight+in+Drosophila+melanogaster+males%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">From the back or front: the courtship position is a matter of smell and sight in Drosophila melanogaster males.</a> J Neurogenet. 29 (1), 18-22 (2015).</li>
<li>Grosjean, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+olfactory+receptor+for+food-derived+odours+promotes+male+courtship+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila.</a> Nature. 478 (7368), 236-240 (2011).</li>
<li>Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+reveals+an+odor-evoked+map+of+activity+in+the+fly+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain.</a> Cell. 112 (2), 271-282 (2003).</li>
<li>Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+sensillum+recordings+in+the+insects+Drosophila+melanogaster+and+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae.</a> J Vis Exp. (36), e1-e5 (2010).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí, se describe un procedimiento por el cual las respuestas de Or47b ORNs a palmitoleic ácido puede ser fuertemente inducida y registrada. Se modificó un método convencional de entrega de olores a larga distancia 2 , 7 , 10 para solucionar el problema de suministro insuficiente de odorante de feromonas. Se abordó la cuestión de la baja volatilidad olorosa mediante la entrega del compuesto a través de cartuchos de olor, cuya a...

<html> Los ORNs de Drosophila responden a un gran número de odorantes, con longitudes de cadena de carbono ampliamente extendidas y una variedad de grupos funcionales, incluyendo ésteres, alcoholes, cetonas, lactonas, aldehídos, terpenos, ácidos orgánicos, aminas, compuestos de azufre, heterocíclicos y aromáticos 2 , 3 . Odorantes variados en sus características físico-químicas pueden tener volatilidades marcadamente diferentes, indicadas por la presión de vapor del compuesto. En particular, los odorantes biológicamente relevantes para Drosophila melanogaster difieren enormemente en su volatilidad. Por ejemplo, los ORN de Ir92a responden al amoníaco 4 , que es altamente volátil, con una presión de vapor de 6.432 mmHg a 20 ° C. Por el contrario, Or67d ORNs responden a una feromona masculina, acetato de cis- vinceno ( c VA) 5 , 6 , cuya presión de vapor es de 43 mmHg a 20 ° C. El estudio de la respuesta olfativa a los odorantes de baja volatilidad es particularmente difícil con los métodos convencionales de suministro de olores, en los que los odorizantes se suministran a través de una corriente de aire portadora a una distancia relativamente larga ( es decir, varios centímetros) A un determinado odorante de baja volatilidad puede variar en gran medida, dependiendo del diseño del sistema de suministro de olor.Por ejemplo, la respuesta informada de Or67d ORNs a una dosis alta de c VA oscila entre ~ 40 7 -&gt; 200 picos / s 6 . Además, la entrega ineficaz de c VA con métodos convencionales de entrega es probablemente atribuida a falsos resultados negativos, lo que lleva a la interpretación de que c VA por sí mismo no es suficiente para activar Or67d ORNs 8. Esta interpretación fue más tarde impugnada por otro estudio utilizando un Método de distribución de olores a corta distancia.Desarrollar un robusto sistema de suministro de olores para la presentación eficaz de olorantes de baja volatilidad. Recientemente, identificamos varios ácidos grasos cuticulares de cadena larga como ligandos para los ORN de Or47b. Se alojan en el tipo 4 Antennal Trichoid Sensillum (at4). Entre los odorantes de ácidos grasos de cadena larga, encontramos que el ácido palmitoleico funciona como una feromona afrodisíaca que promueve el cortejo masculino mediante la activación de Or47b ORNs 1 . Sin embargo, en otro estudio utilizando un método de suministro de olor convencional, se demostró que el laurato de metilo induce respuestas de los ORN de Or47b, mientras que el ácido palmitoleico no evoca respuesta cuando se presenta a partir de la misma distancia 10 . En comparación con c VA, los ácidos grasos de cadena larga son aún menos volátiles, con presiones de vapor inferiores a 0,001 mmHg a 25 ° C 11 . La volatilidad inherentemente baja de los odorantes de ácidos grasos de cadena larga, que impide la presentación eficiente a la antena víaConvencional de los sistemas de suministro de olores, probablemente representaron los resultados falsos negativos [ 10] . Esta incoherencia pone de manifiesto la insuficiencia de los sistemas convencionales de suministro de olores al presentar olorantes de baja volatilidad. Anteriormente se demostró que el suministro efectivo de olores cuticulares de mosca requiere una estrecha proximidad entre la fuente de olor y el tejido diana 6 . Por lo tanto, para caracterizar completamente los efectos de las feromonas biológicamente activas mientras mimetiza la distancia desde la cual son probablemente encontrados por las moscas de la fruta en la naturaleza 12 , 13 , acordamos que la distancia mínima debe ser de alta prioridad en nuestro procedimiento. Nuestro método tiene otras ventajas, incluyendo la compatibilidad con equipos y técnicas de electrofisiología estándar. Las configuraciones de equipos preexistentes requieren una modificación mínima para acomodar este protocolo, y la mayoría de los pasos de SSR requieren solo ajustes menores. EstaHace que nuestra técnica sea fácilmente accesible a los investigadores con experiencia en SSR. Además, nuestra técnica permite la presentación de odorantes de baja volatilidad con inicio y desplazamiento agudos, correlacionando el estímulo con la respuesta neuronal. Finalmente, la disposición del hardware facilita los intercambios rápidos entre los cartuchos de olor, acelerando la recopilación de datos sobre un rango de dosificación deseado. Empezaremos por revisar la preparación de los electrodos de referencia y de registro, la solución de hemolinfa tipo adulto (AHL), los cartuchos de suministro de odorantes y el olfatómetro correspondiente. A continuación se discute la preparación de las soluciones odorantes de ácido palmitoleico, seguido por la preparación de la mosca para su registro. Se procede a considerar los criterios para seleccionar un tricloide sensillum para registrar y examinar más de cerca el posicionamiento del cartucho odorante antes de presentar datos representativos adquiridos usando este método. Finalmente, concluimos explorando aplicaciones útiles de esta técnicaUe, algunos problemas encontrados y sus soluciones.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Configuración de preparación & Materiales varios</fuerte></td>Instrumento extractor de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pipetas&nbsp;</td><td>Sutter Instruments Novato CA</td><td>P97</td><td>Extractor de pipetas</td></tr><tr><td>Capilares de vidrio de borosilicato</td><td>World Precision Instruments Sarasota FL USA</td><td>1B100F-4</td><td>para fabricar varillas de sujeción</td></tr><tr><td>Capilares de vidrio de aluminosilica&nbsp;</td><td>Sutter Instruments Novato CA USA</td><td>AF100-64-10</td><td>para fabricar electrodos</td></tr><tr><td>Superfrost Microscopio</td><td>Portaobjetos Fisher Scientific Pittsburgh PA USA</td><td>12-550-143</td><td>para estación de preparación de moscas</td></tr> Cinta permanente de <tr><td>doble cara</td><td>Scotch St. Paul MN USA</td><td>NA</td><td>para estación de preparación de moscas</td></tr><tr><td>Microscopio vertical</td><td>Olympus Shinjuku, Tokio, Japón</td><td>BX51</td><td>para la plataforma de grabación</td></tr><tr><td>Plastalina plastilina arcilla para modelar</td><td>Van Aken North Charleston SC EE. UU</td>. <td>B0019QZMQQ</td><td>para la estación de preparación y para estabilizar la varilla de sujeción</td></tr><tr><td>Unidad de filtro desechable estéril de flujo rápido con membrana SFCA, 0,45 mm</td><td>Nalgene Rochester NY USA</td><td>#156-4045</td><td>para esterilizar la solución</td></tr> <tr><td>AHLName</td><td>Company&nbsp; &nbsp; &nbsp; </td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</strong</td></tr><tr><td>>Materiales del cartucho</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; </fuerte></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 y micro; L punta de pipeta&nbsp;</td><td>VWR Radnor PA USA</td><td>53508-810</td><td>para hacer cartuchos de olor y preparación de moscas</td></tr><tr><td>Papel de filtro</td><td>Whatman Maidstone Kent UK</td><td>740-E</td><td>para hacer cartuchos de olor&nbsp;</td></tr><tr><td>Desecador de vacío&nbsp;</td><td>Cole-Parmer Vernon Hills IL USA</td><td>VX-06514-30</td><td>para vaporizar etanol solvente</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company&nbsp; &nbsp; &nbsp; </td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Odorant Materials</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; </ácido</td> cis-palmitoleico fuerte> <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Cayman Chemical Ann Arbor MI USA</td><td>#10009871 (CAS # 373-49-9)</td><td>Or47b odorante</td></tr> ácido <tr><td>trans-palmitoleico</td><td>Cayman Chemical Ann Arbor MI USA</td><td>#9001798 (CAS # 10030-73-6)</td><td>Or47b odorante</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Spectrum Chemical MFG.&nbsp; New Brunswick NJ USA</td><td>E1028-500MLGL</td><td>para diluir el ácido palmitoleico&nbsp;</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company&nbsp; &nbsp; &nbsp; </td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Materiales de configuración del equipo</strong</td><td>>&nbsp; &nbsp; &nbsp; </td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odorant Cartridge Micromanipulator</td><td>Siskiyou Grants Pass OR USA</td><td>MX130R</td><td>para posicionar el software Flow</td></tr><tr><td>Vision del olfatómetro&nbsp;</td><td>Alicat Tuscon AZ USA</td><td>FLOWVISIONSC</td><td>software para controlar el caudal</td></tr><tr><td>Controlador de masa</td><td>Alicat Tuscon AZ USA</td><td>MC-2SLPM-D</td><td>para controlar el caudal de aire humidificado</td></tr><tr><td>Controlador de masa</td><td>Alicat Tuscon AZ USA</td><td>MC-500SCCM-D</td><td>para controlar el caudal para la estimulación de olores</td></tr><tr><td>Clampex</td><td>Molecular Devices Sunnyvale CA USA</td><td>Ver. 10.4</td><td>software de adquisición de datos</td></tr><tr><td>Tubo de suministro de aire</td><td>Ace Glass Vineland NJ USA</td><td>8802-936&nbsp;</td><td>para suministrar aire humidificado</td></tr><tr><td>Lente de objetivo de 50X&nbsp;</td><td>Olympus Shinjuku, Tokio, Japón</td><td>LMPLFL50X</td><td>equipo de grabación</td></tr><tr><td>Clampfit 10</td><td>Molecular Devices Sunnyvale, CA, EE. UU</td><td>. Ver. 10.4</td><td>software para análisis de picos&nbsp;</td></tr><tr><td>Igor Pro 6</td><td>WaveMetrics Lake Oswego OR USA</td><td>Ver. 6.37</td><td>software para análisis de datos&nbsp;</td></tr><tr><td>Monitor de audio</td><td>ALA Scientific Instruments Farmingdale NY EE. UU</td><td>. NPIEXB-AUDIS-08B</td><td>Informes auditivos de picos individuales</td></tr><tr><td>Amplificador extracelular</td><td>ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA</td><td>NPIEXT-02F</td><td>para aumentar la amplitud de las señales eléctricas Controlador de</td></tr><tr><td>válvulas</td><td>Warner Instruments&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>VC-8</td><td>para controlar la apertura de la válvula para la estimulación de olores</td></tr><tr><td>Micromanipulador de electrodos de registro</td><td>Sutter Instruments Novato CA USA</td><td>MP-285</td><td>para posicionar el electrodo de registro Amplificador de</td></tr><tr><td>cabecera</td><td>ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA</td><td>EQ-16.0008</td><td>para aumentar la amplitud de las señales eléctricas</td></tr><tr><td>Osciloscopio</td><td>Tektronix Beaverton O EE. UU.</td><td>TDS2000C</td><td>Informe visual de picos individuales</td></tr></tbody></table>

registro electrofisiológico de<em&gt; drosophila</em&gt; tricoide sensilla en respuesta a odorantes de baja volatilidad

Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

Los insectos dependen de su sentido del olfato para guiar una amplia gama de comportamientos que son críticos para su supervivencia, tales como la búsqueda de alimentos, la evitación de depredadores, la oviposición y el apareamiento. Se han identificado innumerables sustancias químicas de diferentes volatilidades como olores naturales que activan las Neuronas de Receptor Olfativas de Insectos (ORN). Sin embargo, el estudio de las respuestas olfativas a los odorizantes de baja volatilidad se ha visto obstaculizado por la incapacidad de presentar eficazmente tales estímulos usando métodos convencionales de suministro de olor. En este sentido, describimos un procedimiento que permite la presentación eficaz de los odorantes de baja volatilidad para la grabación de Sensillum único (SSR) in vivo . Al minimizar la distancia entre la fuente de olor y el tejido diana, este método permite la aplicación de los odorantes biológicamente sobresalientes pero hasta ahora inaccesibles, incluyendo el ácido palmitoleico, una feromona de estimulación con un efecto demostrado sobre ORNs implicados en cortejo y apareamiento comportamiento 1.Nuestro procedimiento proporciona así una nueva vía para analizar una serie de odorantes de baja volatilidad para el estudio de olfato de insectos y la comunicación de feromonas.

Nuestra técnica se aplicó con éxito para determinar la eficacia relativa de los isómeros trans ( Figura 5A ) versus isómeros cis ( Figura 5B ) del ácido palmitoleico. Nuestros datos representativos demuestra que el ácido trans- palmitoléico es un ligando más eficaz para Or47b ORNs en comparación con la cis isoforma ( Figura 5C ]. Se registró una única neurona de c...

El objetivo general de este protocolo es demostrar cómo presentar olorosos de baja volatilidad para el registro de un solo sensor de Drosophila neuronas receptoras olfativas que responden a la cadena larga de feromonas cuticulares.

Registro electrofisiológico de<em&gt; Drosophila</em&gt; Tricoide Sensilla en Respuesta a Odorantes de Baja Volatilidad

Insects rely on their sense of smell to guide a wide range of behaviors that are critical for their survival, such as food-seeking, predator avoidance, ...

El objetivo general de esta técnica es presentar odorantes de baja volatilidad de manera efectiva a las neuronas receptoras olfativas y Drosophila para su registro electrofisiológico. Esas neuronas están alojadas en la sensila tricoides y responden a feromonas cuticulares de cadena larga. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la comunicación de feromonas de insectos al proporcionar una técnica mejorada de entrega de olores.La principal ventaja de esta técnica es que permite que odorantes que antes eran inaccesibles debido a su baja volatilidad, se presenten de manera efectiva durante el registro in vivo. En concreto, las feromonas se presentan desde distancias cercanas que simulan el rango entre los machos que cortejan y las hembras objetivo. La preparación del componente del cartucho de entrega de olores para las grabaciones AT4 comienza con la extracción de 0,9 centímetros del extremo estrecho de la punta de una pipeta de 200 microlitros.Luego, de una segunda punta de pipeta, retire 1,7 centímetros del extremo estrecho y 1,5 centímetros del extremo ancho para hacer una longitud de 1,8 centímetros. A continuación, utilice unas pinzas para colocar un disco de papel de filtro de 1/8 de pulgada de diámetro en la punta de la sección de 1,8 centímetros. Deje una pequeña abertura a través de la cual pueda pasar el aire.A continuación, fije las secciones de pipeta junto con la sección más pequeña inclinada hacia abajo para apuntar a la preparación. Ahora use un P10 para aplicar el odorante en la dilución deseada al papel de filtro. Luego, para evaporar el solvente, deje reposar los cartuchos cargados en un desecador al vacío durante una hora.Primero, ensamble un tobogán de preparación para moscas. En un portaobjetos de vidrio, coloque un cubreobjetos de vidrio con plastilina, para crear un ángulo de aproximadamente tres grados entre el portaobjetos y el portaobjetos. A continuación, coloque la cinta adhesiva de doble cara en dos lugares, el borde interior del cubreobjetos y la corredera inmediatamente debajo del cubreobjetos.Utilice siempre cinta adhesiva nueva. Ahora recoge la mosca de interés en un tubo aspirador. A continuación, coloque una punta de pipeta de 200 microlitros sobre el extremo del tubo y, al mismo tiempo, mueva el tubo mientras sopla, para empujar la mosca hacia el extremo de la punta de la pipeta.Luego, usa una cuchilla de afeitar para cortar la punta justo debajo del cuerpo de la mosca. Ahora cargue con cuidado la arcilla para moldear en el extremo ancho de la punta para forzar la cabeza de la mosca en la abertura más pequeña. Una vez que ambas antenas estén expuestas, deje de empacar en arcilla.Ahora use pinzas para colocar la preparación en el portaobjetos. Coloque el clípeo mirando horizontalmente con el lado lateral de la antena contra la superficie deslizante de la cubierta con cinta. A continuación, coloque la varilla de sujeción en el arista para asegurar la antena a la cinta.A continuación, coloque la preparación en la plataforma de la plataforma. Confirmar que los tricoides son visibles a lo largo del borde lateral distal del tercer segmento de la antena. La sensilla debe estar claramente recortada contra el fondo.Mantenga la preparación bajo un flujo de aire humidificado constante suministrado a través de un tubo separado a una distancia de aproximadamente dos centímetros. Para tomar grabaciones, inserte el electrodo de referencia en el clipeo con un movimiento rápido y suave. Colócalo justo debajo de la cutícula donde estará en contacto con la hemolinfa.A continuación, baje lentamente el electrodo de registro hasta que entre en el mismo plano de visión que el sensor objetivo. A continuación, inserte el electrodo de registro en la base sensillar. Antes de continuar, asegúrese de que haya una alta relación señal-ruido, con picos identificables de las neuronas AT4-A y AT4-C.Las neuronas AT4-A no deben dispararse a más de 20 hercios. Ahora conecte el cartucho al tubo de suministro de odorante. Comience con el control del solvente y avance hacia la concentración más alta de odorante.En este caso, se conecta un cartucho de ácido palmitoleico. A continuación, utilice el micromanipulador para maniobrar el cartucho hacia la preparación mientras lo apunta a la cabeza. Coloque la punta del cartucho apuntando directamente a la antena desde una distancia de unos cuatro milímetros.El cartucho también debe estar aproximadamente un milímetro por encima de la corredera. El posicionamiento preciso del cartucho con respecto a la preparación es el paso más crítico de este procedimiento. Las respuestas neuronales consistentes dependen de la posición reproducible del cartucho a lo largo de los ensayos.El cartucho puede estar estrechamente bordeado por los electrodos y el portaobjetos. Lo ideal es que esté al menos a cuatro milímetros de cualquiera de los electrodos. Para la estimulación, configure el controlador de flujo de odorante en ráfagas de 500 milisegundos y use un caudal de 500 mililitros por minuto.Por cada ráfaga de estímulo, registre la actividad eléctrica durante 10 segundos. Después de una aplicación de odorante, retraiga cuidadosamente el cartucho antes de reemplazarlo con un cartucho que contenga la siguiente concentración más alta. Después de tomar todas las grabaciones del día, enjuague bien el electrodo de grabación con agua destilada.Utilizando los métodos descritos en moscas macho de Berlín de tipo salvaje de siete días de edad, se comparó la eficacia relativa del ácido palmitoleico trans y cis. El trans-palmitoleico fue un estimulante más fuerte de las neuronas receptoras olfativas Or47b. De cada mosca, solo se registró una sola neurona.La distancia entre la apertura del cartucho de olor y la cabeza de la mosca tuvo una influencia significativa en las respuestas neuronales. A los cuatro milímetros había muchos más picos disparados en respuesta al ácido palmitoleico. A una distancia de 11 milímetros, apenas hubo respuestas observables por parte de las neuronas O47b.La presentación a corta distancia del ácido palmitoleico fue muy importante para estudiar sus efectos como odorante. Esperamos que después de ver este video tenga una comprensión clara de cómo presentar ácido palmitoleico u otros odorantes de baja volatilidad en sus neuronas receptoras olfativas de Drosophila durante la grabación in vivo de un solo sensilum. Una vez que se domina esta técnica, se puede lograr el registro de una curva de dosificación completa de una sola mosca en unos 20 minutos.Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del olfato de los insectos exploraran la neurofisiología y los mecanismos de transducción de señales para la detección de feromonas.

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