Registro electrofisiológico de Drosophila Tricoide Sensilla en Respuesta a Odorantes de Baja Volatilidad

El objetivo general de esta técnica es presentar odorantes de baja volatilidad de manera efectiva a las neuronas receptoras olfativas y Drosophila para su registro electrofisiológico. Esas neuronas están alojadas en la sensila tricoides y responden a feromonas cuticulares de cadena larga. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la comunicación de feromonas de insectos al proporcionar una técnica mejorada de entrega de olores.

La principal ventaja de esta técnica es que permite que odorantes que antes eran inaccesibles debido a su baja volatilidad, se presenten de manera efectiva durante el registro in vivo. En concreto, las feromonas se presentan desde distancias cercanas que simulan el rango entre los machos que cortejan y las hembras objetivo. La preparación del componente del cartucho de entrega de olores para las grabaciones AT4 comienza con la extracción de 0,9 centímetros del extremo estrecho de la punta de una pipeta de 200 microlitros.

Luego, de una segunda punta de pipeta, retire 1,7 centímetros del extremo estrecho y 1,5 centímetros del extremo ancho para hacer una longitud de 1,8 centímetros. A continuación, utilice unas pinzas para colocar un disco de papel de filtro de 1/8 de pulgada de diámetro en la punta de la sección de 1,8 centímetros. Deje una pequeña abertura a través de la cual pueda pasar el aire.

A continuación, fije las secciones de pipeta junto con la sección más pequeña inclinada hacia abajo para apuntar a la preparación. Ahora use un P10 para aplicar el odorante en la dilución deseada al papel de filtro. Luego, para evaporar el solvente, deje reposar los cartuchos cargados en un desecador al vacío durante una hora.

Primero, ensamble un tobogán de preparación para moscas. En un portaobjetos de vidrio, coloque un cubreobjetos de vidrio con plastilina, para crear un ángulo de aproximadamente tres grados entre el portaobjetos y el portaobjetos. A continuación, coloque la cinta adhesiva de doble cara en dos lugares, el borde interior del cubreobjetos y la corredera inmediatamente debajo del cubreobjetos.

Utilice siempre cinta adhesiva nueva. Ahora recoge la mosca de interés en un tubo aspirador. A continuación, coloque una punta de pipeta de 200 microlitros sobre el extremo del tubo y, al mismo tiempo, mueva el tubo mientras sopla, para empujar la mosca hacia el extremo de la punta de la pipeta.

Luego, usa una cuchilla de afeitar para cortar la punta justo debajo del cuerpo de la mosca. Ahora cargue con cuidado la arcilla para moldear en el extremo ancho de la punta para forzar la cabeza de la mosca en la abertura más pequeña. Una vez que ambas antenas estén expuestas, deje de empacar en arcilla.

Ahora use pinzas para colocar la preparación en el portaobjetos. Coloque el clípeo mirando horizontalmente con el lado lateral de la antena contra la superficie deslizante de la cubierta con cinta. A continuación, coloque la varilla de sujeción en el arista para asegurar la antena a la cinta.

A continuación, coloque la preparación en la plataforma de la plataforma. Confirmar que los tricoides son visibles a lo largo del borde lateral distal del tercer segmento de la antena. La sensilla debe estar claramente recortada contra el fondo.

Mantenga la preparación bajo un flujo de aire humidificado constante suministrado a través de un tubo separado a una distancia de aproximadamente dos centímetros. Para tomar grabaciones, inserte el electrodo de referencia en el clipeo con un movimiento rápido y suave. Colócalo justo debajo de la cutícula donde estará en contacto con la hemolinfa.

A continuación, baje lentamente el electrodo de registro hasta que entre en el mismo plano de visión que el sensor objetivo. A continuación, inserte el electrodo de registro en la base sensillar. Antes de continuar, asegúrese de que haya una alta relación señal-ruido, con picos identificables de las neuronas AT4-A y AT4-C.

Las neuronas AT4-A no deben dispararse a más de 20 hercios. Ahora conecte el cartucho al tubo de suministro de odorante. Comience con el control del solvente y avance hacia la concentración más alta de odorante.

En este caso, se conecta un cartucho de ácido palmitoleico. A continuación, utilice el micromanipulador para maniobrar el cartucho hacia la preparación mientras lo apunta a la cabeza. Coloque la punta del cartucho apuntando directamente a la antena desde una distancia de unos cuatro milímetros.

El cartucho también debe estar aproximadamente un milímetro por encima de la corredera. El posicionamiento preciso del cartucho con respecto a la preparación es el paso más crítico de este procedimiento. Las respuestas neuronales consistentes dependen de la posición reproducible del cartucho a lo largo de los ensayos.

El cartucho puede estar estrechamente bordeado por los electrodos y el portaobjetos. Lo ideal es que esté al menos a cuatro milímetros de cualquiera de los electrodos. Para la estimulación, configure el controlador de flujo de odorante en ráfagas de 500 milisegundos y use un caudal de 500 mililitros por minuto.

Por cada ráfaga de estímulo, registre la actividad eléctrica durante 10 segundos. Después de una aplicación de odorante, retraiga cuidadosamente el cartucho antes de reemplazarlo con un cartucho que contenga la siguiente concentración más alta. Después de tomar todas las grabaciones del día, enjuague bien el electrodo de grabación con agua destilada.

Utilizando los métodos descritos en moscas macho de Berlín de tipo salvaje de siete días de edad, se comparó la eficacia relativa del ácido palmitoleico trans y cis. El trans-palmitoleico fue un estimulante más fuerte de las neuronas receptoras olfativas Or47b. De cada mosca, solo se registró una sola neurona.

La distancia entre la apertura del cartucho de olor y la cabeza de la mosca tuvo una influencia significativa en las respuestas neuronales. A los cuatro milímetros había muchos más picos disparados en respuesta al ácido palmitoleico. A una distancia de 11 milímetros, apenas hubo respuestas observables por parte de las neuronas O47b.

La presentación a corta distancia del ácido palmitoleico fue muy importante para estudiar sus efectos como odorante. Esperamos que después de ver este video tenga una comprensión clara de cómo presentar ácido palmitoleico u otros odorantes de baja volatilidad en sus neuronas receptoras olfativas de Drosophila durante la grabación in vivo de un solo sensilum. Una vez que se domina esta técnica, se puede lograr el registro de una curva de dosificación completa de una sola mosca en unos 20 minutos.

Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del olfato de los insectos exploraran la neurofisiología y los mecanismos de transducción de señales para la detección de feromonas.