Descelularización y recelularización metodología de venas safenas humanas

Este método explica un procedimiento detallado para la ingeniería de tejidos de venas safenas. También demostramos la preparación de configuraciones de descelularización y biorreactor para la recelularización utilizando aparatos simples. La principal ventaja de esta técnica es que se requiere una simple muestra de sangre para la recelularización, eliminando así la dolorosa recolección de médula ósea y los largos procedimientos de cultivo celular.

Para la perfusión y el lavado de Triton-X 100, prepare la configuración de descelularización uno. En una cámara de dos litros, pegue con cinta adhesiva las tres piezas del tubo A.Pegue un tubo a la pared donde el borde toca la parte inferior de la cámara para la entrada del detergente. Pega los otros dos tubos a la pared opuesta con una distancia de cinco a 10 centímetros entre ellos, dependiendo de la longitud de la vena.

Al menos cinco centímetros de estos tubos también deben estar pegados con cinta adhesiva al suelo de la cámara. Conecte el tubo de entrada del detergente al tubo B usando los conectores de señuelo macho y hembra. A continuación, conecte el tubo B al tubo F y el tubo F al tubo C. Conecte el tubo C a la entrada de la vena.

Ahora, coloque el tubo F en el casete de la bomba peristáltica. Tome otro tubo C y conecte un extremo a la salida de la vena. Coloque el otro extremo en un frasco de vidrio equipado con una salida de manguera inferior y colocado a 45 centímetros por encima de la cámara, y péguelo con cinta adhesiva para asegurarlo.

Esto sirve como salida de detergente. Luego, empuje un extremo del tubo G en la salida de la manguera del frasco de vidrio y coloque el otro extremo en la cámara venosa. A continuación, prepare la configuración de descelularización dos para la perfusión de TnBP como se detalla en el protocolo de texto.

También prepare la configuración de descelularización tres para la perfusión del ADN como se detalla en el texto, y colóquela a 37 grados Celsius. Para preparar el biorreactor de recelularización, inserte el tubo H en un puerto de una tapa de cuatro puertos para que sirva como salida de la veta. En el segundo puerto, inserte el tubo I para que sirva como entrada de medios.

Y en el tercer puerto, inserte el tubo J para la entrada de la vena. A continuación, inserte el otro extremo del tubo H en el cuarto puerto para que sirva como salida de medios. Conecte los conectores reductores a los extremos internos de los tubos H y J. Doble el otro extremo del tubo J en forma de U y átelo con una sutura.

Ahora, coloca un tubo de 60 mililitros con una base plana en un vaso de 250 mililitros. A continuación, conecte un extremo del tubo K a la entrada de la vena y conecte el otro extremo al tubo E. Conecte el tubo E a un segundo tubo K y luego a la entrada del medio. A continuación, coloque la configuración de tapas preparada en el tubo presente en la botella.

Por último, esterilizar el biorreactor mediante autoclave. Realice dos ciclos de congelación y descongelación en una vena safena humana como se detalla en el protocolo de texto antes de cortar una biopsia de dos milímetros de longitud con unas tijeras. Fije la biopsia en formaldehído durante 24 a 48 horas a temperatura ambiente.

Ata cada extremo de la vena a las púas de un conector de señuelo macho y hembra con una sutura. Conecte la vena a la configuración de descelularización uno y llene la cámara con un litro de solución dos. Ahora, perfunde durante 15 minutos a 35 mililitros por minuto y vacía el contenido de la configuración.

A continuación, añadir un litro de solución cuatro y perfundir durante cuatro horas a 35 mililitros por minuto. Vacíe el contenido, agregue 500 mililitros de solución dos, perfunda durante cinco minutos y vuelva a vaciar el contenido. Desconecte la vena de la configuración de perfusión uno y conéctela a la configuración de perfusión dos.

A continuación, agregue un litro de solución cinco, encienda el agitador y perfunda durante cuatro horas a 35 mililitros por minuto. Desconecte la vena de la configuración de perfusión dos y lave el exterior de la vena dos veces con 20 mililitros de agua ultrapura. Luego use una jeringa para lavar el interior de la vena dos veces con 20 mililitros de agua ultrapura durante cinco a 10 minutos.

Después de la perfusión con la configuración de perfusión tres como se describe en el protocolo de texto, conecte la vena a la configuración de perfusión uno. Llene un litro de solución dos y perfunda durante la noche a 35 mililitros por minuto. Repita el proceso de perfusión cuatro veces para la eliminación completa del material nuclear.

Después de la perfusión, vacíe la instalación, llene un litro de solución dos y perfunda durante 24 horas a 35 mililitros por minuto. Pasadas 24 horas, vacíe de nuevo la instalación y llénela con un litro de agua ultrapura. Perfundir durante otras 24 horas a 35 mililitros por minuto.

Finalmente, repita la perfusión usando las mismas condiciones pero con la solución siete. Después de verificar la descelularización como se describe en el protocolo de texto, esterilice la vena colocándola en un tubo de 50 mililitros que contenga 50 mililitros de solución ocho. Agitar a 80 rotaciones por minuto en una coctelera durante una hora a 37 grados centígrados.

Trabajando en una cabina de flujo laminar para mantener la esterilidad, ahora use pinzas estériles para transferir la vena estéril a un nuevo tubo de 50 mililitros que contiene 50 mililitros de solución estéril siete, que contiene 500 microlitros de anti anti. Agite la vena como antes durante 12 horas, cambiando la solución siete al menos dos veces en el medio. Con pinzas estériles, transfiera la vena a un nuevo tubo de 50 mililitros, agregue 50 mililitros de medio endotelial y agite durante 11 horas.

Ahora, conecte la vena atándola a la entrada y salida de la vena del biorreactor con sutura y pinzas estériles, y apriete la configuración de la tapa a la botella de 250 mililitros. Llene el biorreactor con el mismo medio endotelial. Añadir heparina a 50 unidades por mililitro y perfundir durante una hora a dos mililitros por minuto en la incubadora.

Recoja de 15 a 25 mililitros de sangre fresca del donante en tubos vacutainer recubiertos de heparina y dilúyala uno a uno con la solución de steen. Más tarde, agregue el factor de crecimiento endotelial vascular derivado de la glándula endocrina, el factor de crecimiento básico de fibroblasto y un sutil ácido salicílico. Después de vaciar el medio endotelial del biorreactor, agregue la sangre y perfunde durante 48 horas a dos mililitros por minuto en una incubadora de 37 grados centígrados con cinco por ciento de dióxido de carbono.

Aproximadamente 12 horas después, trabaje en la cabina de flujo laminar para extraer una gota de sangre del biorreactor y medir la glucosa con un dispositivo de monitoreo de glucosa en sangre. Si el nivel es inferior a tres milimoles por litro, agregue glucosa para que esté dentro del rango de siete a nueve milimoles por litro. Después de 48 horas de regreso en la incubadora, drene la sangre del biorreactor en la cabina de flujo laminar.

Agregue 30 mililitros de solución estéril siete, perfunda durante cinco minutos y drene la solución. Repita este proceso hasta que se pierda el color rojo sangre. Finalmente, agregue de 30 a 45 mililitros de medio endotelial y perfunda durante 96 horas en la incubadora a dos mililitros por minuto.

Desconecte la vena recelularizada del biorreactor en la cabina de flujo laminar, corte cinco milímetros de los bordes de la vena con unas tijeras y deséchela. Tome una biopsia como antes, colóquela en formaldehído y realice la verificación de la recelularización como se describe en el protocolo de texto. La morfología macroscópica de una vena normal tiene un color rojo brillante.

El color rojo se pierde en los ciclos de descelularización progresiva y, después de cinco ciclos de tratamiento, se ve pálido y blanco. La vena recelularizada por perfusión de sangre periférica y medio endotelial volvió a tener un color rojo brillante. Aquí se muestra una imagen representativa de tinción de hemotoxilina y eosina de una vena normal que muestra la presencia de muchos núcleos azules.

Sin embargo, no se observaron núcleos azules en la tinción con hemotoxilina y eosina de la vena descelularizada. En la vena recelularizada perfundida con sangre y medio endotelial, la tinción de hemotoxilina y eosina mostró la presencia de unión celular en el lumen. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar la descelularización de la vena safena mediante detergentes y la recelularización con sangre periférica y medio endotelial.

Esta técnica de descelularización mediante perfusión de Triton-X 100, TnBP y ADN bajo presión fue exitosa y reproducible en la eliminación de núcleos de venas safenas humanas. Aunque esta técnica tarda 20 días en completarse, el almacenamiento de la vena descelularizada como un producto posterior a la venta disminuirá el tiempo del procedimiento a ocho días. La recelularización de las venas utilizando la sangre periférica del receptor puede considerarse clínicamente relevante.

Los venas recelularizados con un protocolo similar se mostraron prometedores en el trasplante clínico al proporcionar un suministro de sangre funcional después de la operación. Con ligeras modificaciones, este protocolo se puede utilizar para cualquier tipo de vena, y como injerto personalizado en clínicas para todas las cirugías vasculares.