Name: Ingeniería de tejidos de un humano 3D In vitro Sistema de Prueba de Tumores (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-06T08:56:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Aprende a construir un sistema de prueba tumoral 3D con células primarias humanas sobre un andamio biológico descelularizado. Este método simula condiciones in vivo para estudiar progresión y metástasis.

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Los autores desean dar las gracias a Jan Hansmann (Fraunhofer IGB, Stuttgart) por su apoyo técnico para desarrollar biorreactores y la incubadora biorreactor.

1. Descelularización de la BioVaSc <ol><li> Enjuague el sistema vascular del segmento yeyunal porcina a través de un acceso arterial canulado y la luz intestinal con PBS -. Repita hasta que esté completamente limpio. </li><li> Preparar un tanque de vidrio 200 mm de diámetro con 4 adaptadores y conectarlos a través de tubos de silicona a la bomba peristáltica (Ismatec). La presión de la unidad de control se puede controlar a través de un sensor de presión que está conectado a una cúpula estéril desechable (véase la Figura 1). </li><li> Llenar las botellas de yacimientos con descelularización (DZ) solución y comprobar el sistema de tubos de posibles burbujas de aire. </li><li> Conecte la luz intestinal con las ataduras de cables a los conectores de vidrio para el flujo luminal. La bomba de solución 500 ml DZ en el acceso arterial rojo (Figura 1B) del sistema vascular. Interrumpir el proceso de bombeo cada 15 minutos, poco a presionar manualmente la totalidad de la luz intestinal. </li><li> Durante el decellularizatien el proceso, la presión de la solución tampón debe estar entre 80 a 100 mm de Hg, el modelo de la presión natural de la sangre. </li><li> Lave el BioVaSc con PBS - hasta que quede libre de restos de células (&quot;completamente blanco&quot;). </li><li> Llene el BioVaSc completamente con solución DZ e incubar se sumerge en una solución de DZ durante la noche a 4 ° C en la mecedora coctelera. </li><li> Repita el paso 1.6. </li><li> Coloque el BioVaSc en solución de DNasa y se incuba durante la noche a 4 ° C en la mecedora coctelera. </li><li> Retire la solución de DNasa y enjuague con tampón de lavado. </li><li> γ-esterilización con 25 kGy </li></ol> 2. Los diferentes tipos de células 2.1 Aislamiento de células primarias humanas dérmica microvasculares endoteliales (MVECs) y fibroblastos <ol><li> Cortar la biopsia de piel (preferentemente preputium) en tiras de 2-3 mm de ancho, con bisturí y enjuagarlos 3x con PBS - solución. </li><li> Cubra el tejido con una solución de dispasa y se incuba durante 16 - 18 horas a 4 ° C. </li><li> Epidermis Separe dermis con 2 pinzas y transferir tanto por separado en placas de Petri llenas de PBS +. </li><li> Dermis Enjuague tiras 1x con Versene. </li><li> Añadir 10 ml de solución de tripsina / EDTA a las tiras de la dermis e incubar en la incubadora durante 40 min. </li><li> Detenga la reacción enzimática inmediatamente con 1% FCS. </li><li> Traslado tiras de la piel a una placa de Petri llena de VascuLife y arañar cada tira con el bisturí 8x cada lado, añadiendo un poco de presión. </li><li> Transferir la suspensión celular producido a través de un filtro de células a un tubo de centrífuga y enjuague 3x colador celular con VascuLife. </li><li> Centrifugar el tubo a 1200 xg durante 5 min y resuspender el sedimento celular con VascuLife. </li><li> Para aislar los fibroblastos, dermis chop tiras en pedacitos utilizando el bisturí. </li><li> Añadir 10 ml de solución de colagenasa para la dermis piezas. </li><li> Incubar durante 45 min en la incubadora, centrifugar y retire con cuidado dosobrenadante. </li><li> Lavar 1x pellets con DMEM + 10% de FCS +% PenStrep, se centrífuga y se retire con cuidado el sobrenadante. </li><li> Resuspender el precipitado en el medio de cultivo y transferirla a un matraz de cultivo T75 para permitir que las células crezcan fuera del tejido. </li></ol> Línea 2.2 Tumor de células S462 La línea de células tumorales S462 (amablemente proporcionado por el Dr. Nikola Holtkamp, ​​Universidad Charité de Medicina de Berlín) se generó a partir de una vaina nerviosa periférica del tumor maligno de un paciente con el síndrome hereditario de predisposición tumoral neurofibromatosis tipo 1 9. S462 se cultivan en DMEM suplementado con 10% de FCS. Medium tiene que ser cambiado cada 2-3 días. Una vez a la semana las células tienen que ser dividido. 3. Tumor del sistema de prueba: Static Condiciones de cultivo En comparación con cultura dinámica En los sistemas de biorreactores <ol><li> Cortar el tubular SIS-Muc abrir por un lado y fijarlo entre dos anillos de metal (coronas de células, 10 mm de diámetro, la auto constructed). Cubra el SIS-Muc en medio de cultivo celular durante la noche. </li><li> Se siembran las células aisladas en el número de células definidas (ver a continuación) en uno o ambos lados de la SIS (mono-o co-cultivo de configuración). <ol><li> Semilla de 8000 células / cm 2 de MVECs primarios en un volumen total de 100 l sobre la superficie basolateral de la SIS (ex serosa). 3 horas más tarde llenar el pozo con medio para garantizar una cultura sumergida. </li><li> Permiten a las células endoteliales que se adhieran durante 3 días. Da la vuelta al sistema de cultivo estático en 180 ° y la transfiere a una placa de 12 pocillos. </li><li> Seed una mezcla de fibroblastos dérmicos primarios (8000 células / cm 2) y células tumorales (15.000 células / cm 2) dentro de un volumen total de 500 l en la superficie apical de la SIS (el lado de los antiguos lumen). </li><li> Permitir que las células se adhieran durante 3 horas y llenan el bien con medio (de cultivo sumergido, medio: 50% Vasculife + 50% de DMEM suplementado con 10% de FCS). </li><li> El sistema de prueba de tumor se cultivan en condiciones estáticas unat 37 ° C, 5% de CO 2 en la incubadora durante 14 días adicionales. Cambie el medio de cultivo cada 2-3 días. </li></ol></li><li> Para la cultura dinámica, fijar el SIS-Muc entre dos anillos de metal y semillas MVECs primarias como se describe en 3.2.1. Después de 3 días eliminar el SIS-Muc de los anillos de metal e insertar la membrana en el reactor de flujo (véanse las figuras 2C y 2D). Aplicar el fibroblastos dérmicos y células de tumor primario con una jeringa y la cánula sobre la matriz en el biorreactor, y permiten que las células se adhieran durante 3 horas antes de llenar el sistema de biorreactor con medio de cultivo. </li><li> En las siguientes condiciones de cultivo dinámicas días con flujo constante de medio (3,8 ml / min, 37 ° C, y 5% de CO 2) puede ser iniciado. La cultura dinámica se mantiene durante 14 días, se cambió el medio de cultivo después de 7 días. </li><li> La configuración de la prueba dinámica se cultiva en un incubador de auto-construido que proporciona un flujo de los medios de comunicación a través de una bomba y la temperatura necesaria y CO 2 </sub&gt; Contenido. </li></ol> 4. Métodos de caracterización para el Análisis 4.1 Fijación y de inclusión en parafina de la matriz de colágeno sembrada <ol><li> Para (inmuno-) caracterizaciones histológicas eliminar el medio de cultivo y fijar el tejido con paraformaldehído al 4% durante 2 horas. </li><li> Eliminar 4% de paraformaldehído y transferir el SIS de la pieza de metal a un casete de tejido incrustación. Riegue el tejido para retirar los restos de fijador y se deshidratan para la infiltración de parafina. </li><li> Antes de ser colocado en un bloque de parafina, corte el SIS en 2 - 3 rebanadas y colocarlas en un molde de metal base de parafina-rellenada de forma que las superficies cortadas se enfrentan a la baja. Añadir el casete de tejido en la parte superior del molde como un respaldo. </li><li> Cortar 5 micras rodajas y floten en un baño de agua a 40 ° C para enderezar, a continuación, montar las diapositivas en portaobjetos de vidrio adecuados. Diapositivas no recubiertos se utilizan para H &amp; E manchas, polylysine revestida de diapositivas para la tinción inmunohistoquímico para mejorar el apego.Deje que las rebanadas se sequen completamente. </li><li> Derrita la parafina, retírelo con xileno y se rehidratan rebanadas para después de la tinción. </li></ol> 4.2 La tinción <ol><li> Las rebanadas rehidratadas se pueden teñir con hematoxilina / eosina como tinción visión estandarizada. </li><li> Para la tinción immunhistological, fijo y cortes de tejido en parafina infiltrado deben someterse a una recuperación de antígenos para que los anticuerpos que reconocen y se unen a sus epítopos específicos. Por lo tanto, desparafinados y rehidratados diapositivas se colocan en una olla de vapor con tampón de citrato climatizada (pH 6,0) durante 20 min. </li><li> Diapositivas de transferencia a tampón de lavado (0,5 M tampón de TBS + 0,5% de Tween) y rodajas de círculo con un lápiz PAP para minimizar el volumen requerido para soluciones de tinción. </li><li> Colocar el portaobjetos en una cámara de humedad. Para asegurar una peroxidasa de rábano picante-mediada por la visualización específica de antígeno-anticuerpo de unión, la peroxidasa endógena debe estar saturada con peróxido de hidrógeno al 3%. </li><li> Antib Primariadiluciones ody se aplican a las rebanadas, se incubaron durante 1 hora a TA y se lavó cuidadosamente con tampón de lavado. </li><li> Para la detección de las consolidaciones de antígeno-anticuerpo específicos del Ultra Vision Quanto sistema de detección de HRP DAB (Thermo Scientific) se utiliza de acuerdo con el protocolo recomendado. </li><li> Los núcleos se contratiñeron con hematoxilina durante 1 min. </li><li> Los portaobjetos se montaron con un medio acuoso, se secaron, y utilizando imágenes de un microscopio inverso. </li></ol>

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</ol>

Los autores tienen nada que revelar.

<html> Cuando la comparación de sistemas de cultivo 2D y 3D en la investigación del tumor, los sistemas de 3D, a pesar de ser el enfoque más caro, han demostrado para imitar las condiciones en microambientes biológicos mejor. Se pudo demostrar que algunas células tumorales crecen mucho más lento en un cultivo 3D que en 2D una cultura común 12, que es de acuerdo a la situación en un tumor real. Bissell y colaboradores demostraron en su trabajo que el comportamiento de las células cancerígenas de mama refleja la situación in vivo, incluyendo la morfología celular y la señalización, con mayor precisión cuando una cultura 3D dentro de una matriz ofrece las interacciones célula-ECM. Además, hicieron hincapié en la importancia del medio ambiente extracelular en 3D mediante la demostración de que los cambios en las interacciones ambientales llevaron a la reversión de las células malignas a un fenotipo normal. Además, y más importante aún, estos resultados también podrían ser confirmados en modelos animales in vivo 10,11. ontenido &quot;&gt; La comparación directa de los experimentos in vivo en animales y en modelos in vitro de tejidos revela las ventajas y desventajas de ambos sistemas. Una de las ventajas de los modelos in vitro es el permiso de un tiempo real, mucho mejor o imágenes fijas mediante microscopía. Una limitación es que que imitan las condiciones estáticas o de corto plazo, mientras que los sistemas in vivo con frecuencia progresan. La actual falta de vascularización y el transporte normal de las moléculas pequeñas, sede de la respuesta inmune, y otras interacciones célula-célula son otras desventajas de los modelos in vitro 12. Por lo tanto, en 3D sistemas in vitro como se presenta en este estudio ofrecen una adición prometedora a los experimentos con animales. Proporcionan una mejor comparabilidad con el organismo humano y por lo tanto minimizar las malas interpretaciones experimentales. Biomimetic en sistemas de modelos in vivo será por tanto ser más relevante para estudiar la forma depende de cáncer y metástasis en condiciones microambientales que regulan tumorigenesis 11. Nuestro estudio muestra que el entorno en 3D proporcionado por el SIS-Muc conduce a una formación más similar a un tumor de tejido de células, que no se observa en el cultivo de células 2D común (véase la Figura 3A). Por otra parte, el uso de células primarios derivados de biopsias de tumores es un paso muy importante hacia la medicina personalizada, una disciplina que tiene como objetivo identificar el mejor tratamiento en función de las necesidades individuales del paciente. La incorporación de las células tumorales específicos para cada paciente primarias aisladas de material de biopsia permitirá en las pruebas in vitro de estrategias terapéuticas. Tales sistemas de prueba hará posible investigar diferentes fármacos y combinaciones de los mismos en un tiempo-y cribado de alto rendimiento de ahorro de costes. Además, la integración de las células estromales asociadas a tumores como se muestra en este estudio es importante para el enfoque personalizado, ya que la progresión del tumor influencias del microentorno de un tumor 13 y podría resultar como suitable diana terapéutica. Alternativamente a un enfoque personalizado, nuestro modelo de tumor puede ser modificado para servir como un sistema de prueba de tumor generalizada por la incorporación de líneas celulares tumorigénicas establecidas. Se trata de una adaptación prometedora para fines de investigación básica. Por tanto las pruebas de drogas se acerca se requiere la presencia de una estructura vascular para probar la distribución y absorción de las sustancias terapéuticas. La matriz-SIS Muc permite la siembra basolateral con MVEC primaria para los estudios de barrera de absorción, la resiembra de las estructuras vasculares conservados de la BioVaSc mejorará aún más el estudio de la administración de fármacos. Con el fin de crear modelos de tejido, una matriz biodegradable 3D se puede utilizar como marco para un co-cultivo de diferentes tipos de células 14. El uso de tales matrices en 3D es a menudo limitada por la ausencia de una vascularización funcional. Este problema puede ser resuelto por el uso de la BioVaSc, que ofrece conservado str vaso sanguíneouctures, que puede ser resembrado con células endoteliales. Además, la BioVaSc proporciona componentes extracelulares, que aseguran la adherencia de las células y facilitar la diferenciación del tejido. También permite a la función específica de tejido de largo plazo de los tejidos bioartificiales 3D 7,8,15. El requisito previo para la ingeniería de sustitutos vasculares funcionales es la imitación de fisiológica humana y las condiciones biomecánicas. Por lo tanto, los sistemas de biorreactores, que pueden poner en práctica estos requisitos in vitro, son de gran interés para la creación de modelos de tumores biológicos. La combinación de la BioVaSc, la tecnología de biorreactor y el co-cultivo de diferentes tipos de células es un método muy prometedor para generar tejidos tumorales vascularizadas, lo que permitirá el estudio de los mecanismos pertinentes para la progresión del cáncer, como la angiogénesis y la metástasis. Vemos este tipo de modelos de tumores como un enfoque prometedor para complementar los estudios en animales al proporcionar un equivalentea la fisiología del tumor humano.

Nuevos productos farmacéuticos deben ser validadas en lo que respecta a su calidad, seguridad y eficacia antes de la autorización de comercialización. Hasta la fecha, los experimentos con animales son el método estándar para las pruebas de drogas y validación. Sin embargo, debido a las diferencias específicas de las especies, los experimentos con animales a menudo no ampliamente evaluar el efecto de los compuestos en los seres humanos 1. Por esta razón, es importante para generar modelos de tejidos humanos que se pueden utilizar para ensayos in vitro de nuevos medicamentos y sustancias. Uno de los ejes de nuestro grupo es la creación de modelos de ensayo in vitro in con nuestro andamio biológico vascularizado (BioVaSc) 2,3. El BioVaSc se puede utilizar como un sistema de matriz 3D estática o dinámica. Para la cultura estática, el segmento yeyunal porcino descelularizado (Small intestinal submucosa SIS-Muc) se coloca en un inserto de metal para la resiembra de la célula. Diversas células, como el cáncer y las células endoteliales se pueden cultivar en el andamio. <pclase = &quot;jove_content&quot;&gt; Para el cultivo dinámico, la BioVaSc está unido a un sistema de biorreactor de flujo que se aplica a lo largo de la vasculatura o en toda la superficie del andamio. Biorreactores actuales aplicar estímulos biológicos, mecánicos, eléctricos o que actúan sobre la diferenciación o proliferación de las células 4. Para biorreactores en el campo de la ingeniería de tejidos, el concepto básico es para simular las condiciones en el cuerpo humano. En el que, las células se les proporciona un entorno natural en el que pueden interactuar entre sí y con su matriz extracelular circundante. Para la producción de sistemas in vitro o trasplantes de prueba en, la capacidad para imitar el entorno natural de las células con una estructura de soporte adecuada y un sistema biorreactor es crítico 5. Por lo tanto, los dispositivos más complejos y técnicamente exigentes deben desarrollarse con el fin de cumplir con estas tareas 6. Además, es posible utilizar nuestro andamiaje para el establdantes de un modelo vascularizado debido a las estructuras tubulares conservados, que incluyen la arteria de alimentación, vena, y la cama capilar de conexión. Todas las células de porcino necesitan ser eliminado por descelularización química, mecánica y enzimática, y la gamma-esterilizada andamio. Las estructuras vasculares tubulares restaurados posteriormente pueden volver a sembrarse con células endoteliales microvasculares humanas utilizando un biorreactor de perfusión de recirculación 7, que imita los parámetros biomecánicos y / o bioquímicas tales como el pH, la temperatura, la presión, el suministro de nutrientes y eliminación de desechos 6. El re-endotelización de las estructuras tubulares crea un humano equivalente de vasos sanguíneos dentro de la 3,7 andamio de colágeno. En el siguiente paso, la superficie de los antiguos lumen (mucosa) se puede sembrar con células humanas primarias para establecer co-cultivos 3,7,8. En este estudio un sistema de prueba de tumor 3D está configurado por el co-cultivo de una línea celular tumoral con vía primariacélulas ROMAL en condiciones estáticas y dinámicas en el SIS-Muc.

<table><tbody><tr><td>Solución de colagenasa</td><td>SERVA</td><td>17454</td><td>(500 U/ml)</td></tr><tr><td>Solución de dispasa</td><td>Gibco</td><td>17105-041</td><td>(2.0 U/ml)</td></tr><tr><td>DMEM, PAA con alto contenido de glucosa</td><td></td><td>G0001,3010</td><td></td></tr><tr><td>DNasa</td><td>ROCHE</td><td>10104159001</td><td>200 mg disuelta en 500 ml PBS+ + 1% PenStrep</td></tr><tr><td>DZ solución</td><td>Roth</td><td>3484.2</td><td>34 g Sodio Desoxiquelado, en 1 L Agua ultrapura</td></tr><tr><td>FCS</td><td>LONZA</td><td>DE14-801F</td><td></td></tr><tr><td>IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP</td><td>DCS</td><td>PD000KIT</td><td></td></tr><tr><td>transductor de presión médico</td><td>MEMSCAP</td><td>SP844</td><td></td></tr><tr><td>ratón monoclonal antihumano Von Willebrand Factor</td><td>DAKO Cytomation</td><td>M0616</td><td>Clon F8/86 0.12 &mu; g/ml</td></tr> ratón <tr><td>monoclonal anti-humano p53</td><td>DAKO Cytomation</td><td>IS616</td><td>Clon DO-7</td>bomba</tr><tr><td>peristáltica</td> lista para usar <td>Ismatec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cúpula desechable estéril</td><td>MEMSCAP</td><td>844-28</td><td></td></tr><tr><td>Solución de tripsina / EDTA</td><td>PAA</td><td>L11-003</td><td>0,05%</td></tr><tr><td>VascuLife (VEGF-Mv)</td><td>Lifeline</td><td>LL-0003</td><td></td></tr><tr><td>Versene</td><td>Gibco</td><td>15040-033</td><td></td></tr></tbody></table>

ingeniería de tejidos de un humano 3d<em&gt; in vitro</em&gt; sistema de prueba de tumores

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

El cáncer es una de las principales causas de muerte en todo el mundo. Estrategias terapéuticas actuales se desarrollan principalmente en los sistemas de cultivo en 2D, que reflejen adecuadamente las condiciones fisiológicas in vivo. 3D matrices biológicas proporcionan células un ambiente en el cual las células pueden auto-organizarse, lo que permite el estudio de la organización del tejido y la diferenciación celular. Tales andamios se pueden sembrar con una mezcla de diferentes tipos de células para estudiar-interacciones célula-célula directos 3D. Para imitar la complejidad 3D de tumores de cáncer, nuestro grupo ha desarrollado un sistema de prueba 3D in vitro tumor. Nuestros modelos de sistemas de ensayo de tejido 3D la situación in vivo de tumores malignos de la vaina de los nervios periféricos (MPNSTs), que hemos establecido con nuestros descelularizado segmento yeyunal porcino andamio vascularizado biológico derivado (BioVaSc). En nuestro modelo, nos volvieron a sembrar una matriz BioVaSc modificado con fibroblastos primarios, células endoteliales microvasculares (MVECs) y la línea de células tumorales S462. Para la cultura estática, se retira la estructura vascular del BioVaSc y el andamio restante se corta en un lado (Intestino Delgado Submucosa SIS-Muc). La matriz resultante se fija entonces entre dos anillos de metal (coronas de células). Otra opción es la cultura el sembrado de células SIS-Muc en un sistema de biorreactor de flujo que expone las células a la tensión de cizallamiento. Aquí, el biorreactor está conectado a una bomba peristáltica en un incubador de auto-construido. Un equipo que regula el oxígeno arterial y el suministro de nutrientes a través de parámetros como la presión arterial, la temperatura y el caudal. Esta configuración permite una cultura dinámica, ya sea con pulsátil presión regulada o flujo constante. En este estudio, se podría establecer con éxito tanto un sistema de cultivo 3D estática y dinámica para MPNSTs. La capacidad de modelar los tumores de cáncer en un entorno 3D más natural permitirá el descubrimiento, prueba y validación defuturos fármacos en un modelo similar a la humana.

Como se muestra en la Figura 1B, es descelularizado el segmento yeyunal porcino (alrededor de 2 m de longitud y 20 mm de diámetro) con estructuras tubulares conservados de la red capilar. Después de química, enzimática y mecánica descelularización, se obtuvo un andamio de colágeno I / III, que puede ser utilizado para el cultivo celular en 3D. Se realizó una prueba de Feulgen para demostrar la pureza (no hay restos de ADN) de la matriz (no se muestran datos). Las Figuras 2A y 2B muestran la cultura estática del SIS-Muc asegurado por las coronas de células. Arreglamos el SIS-Muc en un biorreactor en el local diseñado (Figura 2C) para la cultura dinámica. Figura 2D ilustra el flujo dinámico simulado a través de la cámara del biorreactor. El biorreactor se coloca en un sistema de incubación de auto-construido y conectado con una bomba peristáltica. Esta configuración permite una cultura dinámica, ya sea con flujo pulsátil presión regulada o c<html> flujo onstante. La Figura 3 da una visión general de la línea de células cultivadas de forma estática S462 tumor en monocultivo 2D (Figura 3A) y en 3D co-cultivo (Figuras 3B-3D). Figura 3B muestra la triple cultivo de células tumorales S462 y fibroblastos primarios de la parte apical del SIS -Muc (ex equipo lumen interno) y MVEC en el lado basolateral (ex equipo serosa). La identificación de diferentes tipos de células es posible mediante la tinción de marcadores específicos de tipo celular, tales como el factor de von Willebrand para etiquetar MVEC (Figura 3C). Las células p53-S462 positivo se pueden distinguir de los fibroblastos primarios-p53 negativo (Figura 3D) y la distribución 3D de las células puede ser analizado. Figura 4 muestra tinciones equivalente a la Figura 3 de la cultura de triple dinámicamente cultivadas. <html> 0460/50460fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Descelularización puesta a punto. (A) biorreactor y la bomba de puesta a punto para la decellularizing BioVaSc, controlado por una PC. (B) Descelularizado BioVaSc en el tanque de vidrio. El lumen y la entrada arterial están conectados a los adaptadores. . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50460/50460fig2.jpg" /> Figura 2. Sobre la opinión de los cultivos distintos reglajes. (A) vista en sección CAD ​​de sistema de cultivo estático en placa de microtitulación, (B) insertos metálicos para la cultura estática, (C) de simulación de flujo medio (campo de velocidad [m / s]) para la cultura dinámica de la tapa superior del biorreactor de flujo , (d) biorreactor de flujo para la cultura dinámica conectada a la bomba peristáltica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50460/50460fig2large.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver más grande la figura</a> ent &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 3" fo:content-src="/files/ftp_upload/50460fig3highres.jpg" fo:content-width="5.5in" src="/files/ftp_upload/50460/50460fig3.jpg" /> Figura 3. Visión general de la caracterización inmunohistoquímico del tumor modelo 3D estática. (A) tinción con hematoxilina de la cultura mono 2D estáticamente cultivada de células S462 en un portaobjetos Permanox, (B) tinción con HE de la estáticamente cultivaron cultura de triple 3D, flechas marcan las células endoteliales, (C) tinción inmunohistoquímico para el factor de von Willebrand, (D ) tinción inmunohistoquímico de p53. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50460/50460fig3large.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver más grande la figura</a> <img alt="Figura 4" fo:content-src="/files/ftp_upload/50460fig4highres.jpg" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50460/50460fig4.jpg" /> <strong&gt; Figura 4. Visión general de la caracterización inmunohistoquímico del tumor modelo 3D dinámico. (A) H &amp; E tinción de la dinámica cultura culta triples 3D, flechas marcan las células endoteliales, (B) tinción inmunohistoquímico para el factor de von Willebrand, (C) tinción inmunohistoquímico de p53. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50460/50460fig4large.jpg" target="_blank">Haz click aquí para ver más grande la figura</a>

Se describen los métodos para crear los tejidos tumorales 3D humanos como sistemas de prueba. Estas tecnologías se basan en un descelularizado Biológica vascularizado Andamios (BioVaSc), las células humanas primarias y una línea de células tumorales, que pueden ser cultivadas bajo condiciones estáticas, así como en condiciones dinámicas en un biorreactor de flujo.

Ingeniería de tejidos de un humano 3D<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema de Prueba de Tumores

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

El objetivo general de este procedimiento es construir un sistema de prueba de tumor tridimensional con células primarias sobre un andamio biológico descelularizado. Esto se logra primero preparando el andamio mediante un proceso de descelularización en el que un segmento alveolar porcino se perfunde con una solución descelularizante. El segundo paso consiste en aislar células humanas primarias de una biopsia del paciente utilizando un protocolo estándar de aislamiento.A continuación, prepare el sistema de prueba tumoral cortando longitudinalmente el submucosa intestinal delgado tubular por un lado, fijándolo entre dos anillos metálicos y sembrando células tumorales y células estromales asociadas con densidades celulares definidas. El paso final consiste en cultivar el constructo cargado con células en un montaje adecuado bajo condiciones estáticas o dinámicas. Finalmente, se utiliza microscopía inmunohistoquímica para evaluar las características del crecimiento tumoral.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como los sistemas de prueba de tumores TT, es que con este método es posible crear modelos de tejidos tridimensionales que simulan las condiciones in vivo de un tumor con mayor precisión que los modelos bidimensionales comunes. La ventaja del cultivo dinámico es que se mantienen las características específicas de las células. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología tumoral, como cómo las células cancerosas forman interacciones célula-célula y célula-matriz en un entorno tridimensional, lo que contribuirá a esclarecer procesos relacionados con el cáncer, tales como la progresión tumoral y la metástasis.El andamio vascularizado biológico o biova utilizado en este sistema de prueba tumoral se deriva de un segmento de íleon porcino. Enjuague el sistema vascular del segmento de íleon porcino y la luz intestinal con PBS mediante acceso arterial canulado. Repita hasta que esté completamente limpio.Prepare un tanque de vidrio de 200 milímetros de diámetro con cuatro adaptadores y conéctelos mediante tubos de silicona a la bomba peristáltica. La unidad de control de presión puede monitorearse mediante un sensor de presión conectado a una cúpula desechable estéril. Llene las botellas de reserva con solución de descelularización o solución DZ.Revise el sistema de tubos en busca de posibles burbujas de aire. Conecte la luz intestinal con bridas a los conectores de vidrio para el flujo luminal. Introduzca mediante bomba 500 mililitros de solución DZ en el acceso arterial rojo del sistema vascular.Interrumpa brevemente el proceso de bombeo cada 15 minutos para presionar manualmente todo el lumen intestinal. Es importante monitorear la presión de la solución tampón durante el proceso de descelularización. La presión debe estar entre 80 y 100 milímetros de mercurio, modelada según la presión arterial natural.Lave la biópsia con PBS hasta que esté libre de restos celulares y la estructura vascular sea completamente blanca. Comience este procedimiento cortando la biopsia de piel en tiras de dos a tres milímetros de ancho con un escalpelo y enjuagándolas tres veces con solución de PBS. Después de incubar el tejido con solución de disbe, use dos pinzas para separar la epidermis de la dermis.Transfiera ambos por separado a placas de Petri llenas con PBS para aislar células endoteliales microvasculares dérmicas primarias o MV eecs. Enjuague las tiras de dermis una vez con ene, agregue 10 mililitros de trips en solución de EDTA a las tiras de dermis e incube a 37 grados Celsius durante 40 minutos. Detenga la reacción enzimática con FCS al 1% y transfiera las tiras de piel a una placa de Petri llena con vascu life. Raspe cada tira ocho veces por cada lado con el bisturí, aplicando un poco de presión para obtener una suspensión celular.Posteriormente, centrifugar la suspensión celular y resuspender el botón celular con vascu life. Para aislar fibroblastos, primero utilice un escalpelo para cortar las tiras de dermis en pequeños fragmentos.Transfiera los fragmentos de dermis a un tubo Falcon y agregue 10 mililitros de solución de colagenasa incubada a 37 grados Celsius durante 45 minutos. A continuación, centrifugue la solución y retire cuidadosamente el sobrenadante. Lave el precipitado con DMEM más 10 %FCS más 1 %pen estrepto.Después de la centrifugación, retire cuidadosamente el sobrenadante, resuspenda el sedimento en medio de cultivo y transfiera a un frasco de cultivo T 75 para permitir que las células crezcan fuera del tejido; incube bajo condiciones estáticas. Para montar el sistema de prueba tumoral, primero corte la submucosa intestinal delgada tubular o SIS muc, ábrala por un lado y fíjela entre dos anillos metálicos. Estas coronas celulares autoconstruidas tienen un diámetro de 10 milímetros.Cubra el SIS mu con medio de cultivo celular durante la noche al día siguiente, siembre las MVE CS primarias sobre la superficie basal del SIS, la anterior CI. Incube a 37 grados Celsius, 5 % de dióxido de carbono durante tres horas. Tres horas después, complete el pocillo con medio para asegurar un cultivo sumergido y devuélvalo al incubador. Permita que las células endoteliales se adhieran durante tres días tras los tres días.Gire el sistema de cultivo estático 180 grados y transfiéralo a una placa de 12 pocillos. A continuación, observe una mezcla de fibroblastos dérmicos primarios y células tumorales en la superficie apical del SIS. El lado del antiguo lumen.Deje que las células se adhieran durante tres horas. Llene el pocillo con medio para sumergir la cultura, el sistema de prueba de tumor en condiciones estáticas a 37 grados Celsius, 5% de dióxido de carbono durante 14 días adicionales, cambiando el medio de cultivo cada dos o tres días para el cultivo dinámico. Fije el SIS mu entre dos anillos metálicos y siembre las MV eecs primarias como se demostró anteriormente.Después de tres días, retire la membrana SIS mu de los anillos metálicos e inserte la membrana en el reactor de flujo con una jeringa y una cánula. Aplique los fibroblastos dérmicos primarios y las células tumorales sobre la matriz en el biorreactor. Permita que las células se adhieran durante tres horas antes de llenar el sistema del biorreactor con medio de cultivo al día siguiente, coloque el biorreactor en un sistema de incubadora autoconstruido y conéctelo a una bomba peristáltica.Este montaje permite el cultivo dinámico con flujo pulsátil regulado por presión o flujo constante. En este experimento, se utiliza un flujo constante de medio de 3,8 mililitros por minuto. Mantenga el cultivo dinámico durante 14 días, cambiando el medio de cultivo tras siete días.Al finalizar los experimentos, los tejidos se fijan, se incluyen en parafina y se tiñen, y luego se imaginan utilizando un microscopio invertido. Aquí se muestran resultados representativos. El panel A muestra una visión general de la línea celular tumoral S 4 62 cultivada estáticamente en monocultivo 2D teñida con hematoxilina.El co-cultivo 3D se muestra en los paneles B, C y D. Esta imagen teñida con H y e muestra el cultivo triple de células tumorales S 4 62 y fibroblastos primarios en el lado apical del SIS MU y los MVEC. En el lado basal lateral, las flechas marcan las células endoteliales. Los diferentes tipos celulares pueden identificarse mediante tinción de marcadores específicos de cada tipo celular, como el factor de von Willebrand para etiquetar los MVEC mostrados en el panel C y P 53 mostrado en el panel D. Las células S 4 62 positivas para P 53 pueden distinguirse de los fibroblastos primarios negativos para P 53, y la distribución tridimensional de las células puede analizarse de la misma manera.Se pueden identificar diferentes tipos de células en el panel de cultivo triple con cultivo dinámico. El panel A es una imagen teñida con hematoxilina y eosina donde las flechas marcan las células endoteliales. El panel B muestra la tinción inmunohistológica para el factor de von Willebrand, y el panel C muestra la tinción para P53. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como pruebas con fármacos para responder preguntas adicionales, tales como cómo encontrar nuevas terapias contra el cáncer o el análisis de vías de señalización importantes en la tumorigénesis.Además, las células primarias pueden utilizarse para definir el mejor tratamiento personalizado para pacientes individuales.

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