Ingeniería de tejidos de un humano 3D In vitro Sistema de Prueba de Tumores

El objetivo general de este procedimiento es construir un sistema de prueba de tumores en 3D con células primarias en un andamio biológico descelularizado. Esto se logra preparando primero el andamio mediante un proceso de descelularización en el que se bombea un segmento porcino con solución de descelularización. El segundo paso es aislar células humanas primarias de la biopsia de un paciente utilizando un protocolo de aislamiento estándar.

A continuación, configure el sistema de prueba de tumores cortando la submucosa tubular del intestino delgado por un lado, fijándola entre dos anillos metálicos y sembrando con células tumorales y células estromales asociadas en densidades celulares definidas. El paso final es cultivar la construcción cargada con células en una configuración adecuada en condiciones estáticas o dinámicas. En última instancia, la microscopía inmunohistoquímica se utiliza para evaluar las características del crecimiento tumoral.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como los sistemas de pruebas tumorales TT, es que con este método es posible crear modelos de tejido en 3D que simulan las condiciones in vivo de un tumor con mayor precisión que los modelos 2D comunes. La ventaja del cultivo dinámico es que se mantienen las características específicas de la célula. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología tumoral, como la forma en que las células cancerosas forman interacciones entre la célula y la matriz celular en un entorno 3D, lo que ayudará a dilucidar los procesos relacionados con el cáncer, como la progresión tumoral y la metástasis.

El andamio biológico vascularizado o biova que se utiliza en este sistema de prueba de tumores se deriva de un segmento de jaal porcino. Enjuagar el sistema vascular del segmento porcino y la luz intestinal con PBS a través de un acceso arterial canulado. Repita hasta que esté completamente limpio.

Prepare un tanque de vidrio de 200 milímetros de diámetro con cuatro adaptadores y conéctelos a través de tubos de silicona a la bomba peristáltica. La unidad de control de presión se puede monitorear a través de un sensor de presión que está conectado a una cúpula desechable estéril. Llene las botellas del depósito con solución de descelularización o DZ.

Revise el sistema de tubos para ver si hay posibles burbujas de aire. Conecte el lumen intestinal con bridas a los conectores de vidrio para el flujo luminal. Bombee 500 mililitros de solución DZ en el acceso arterial rojo del sistema vascular.

Interrumpa el proceso de bombeo cada 15 minutos brevemente para expulsar manualmente todo el lumen intestinal. Es importante controlar la presión de la solución tampón durante el proceso de descelularización. La presión debe estar entre 80 y 100 milímetros de mercurio siguiendo el modelo de la presión arterial natural.

Lave la biova con PBS hasta que esté libre de restos celulares y la estructura vascular sea completamente de color blanco. Comience este procedimiento cortando la biopsia de piel en tiras de dos a tres milímetros de ancho con un bisturí y enjuagándolas tres veces con una solución de PBS. Después de incubar el tejido con la solución de disbe, use dos pinzas para separar la epidermis de la dermis.

Transfiera ambos por separado a placas de Petri llenas de PBS para aislar las células endoteliales microvasculares dérmicas primarias o MV eecs enjuague las tiras de dermis Una vez con ene, agregue 10 mililitros en solución de EDTA a las tiras de dermis e incube a 37 grados centígrados durante 40 minutos. Detenga la reacción enzimática con 1%FCS y transfiera las tiras de piel a una placa de Petri llena de vida vascu. Raspa cada tira con el bisturí ocho veces en cada lado, agregando un poco de presión para producir una suspensión de celdas.

Posteriormente, centrifugar la suspensión celular y resus, suspender la célula pellet con vascu life. Para aislar fibroblastos. Primero, use un bisturí para cortar las tiras de dermis en trozos pequeños.

Transfiera las piezas de dermis a un tubo Falcon y agregue 10 mililitros de solución de colagenasa incubada a 37 grados centígrados durante 45 minutos. A continuación, centrifuga la solución y retira con cuidado el sobrenadante. Lave el pellet con DMEM más 10 % de FCS más 1 % de estreptococo en pluma.

Después de la centrifugación, retire con cuidado el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet en el medio de cultivo y transfiéralo a un matraz de cultivo T 75 para permitir que las células crezcan fuera del tejido, se incuben en condiciones estáticas. Para configurar primero el sistema de prueba de tumores, corte la submucosa tubular del intestino delgado o muca SIS, ábrala por un lado y fíjela entre dos anillos metálicos. Estas coronas de celdas autoconstruidas tienen un diámetro de 10 milímetros.

Cubra el SIS mu en medio de cultivo celular durante la noche del día siguiente, siembre el MVE CS primario en la superficie basal posterior del SIS, el CI anterior. Incubar a 37 grados Celsius, 5% de dióxido de carbono durante tres horas. Tres horas más tarde, llene el pocillo con medio para asegurar el cultivo sumergido y devuélvalo a la incubadora. Deje que las células endoteliales se adhieran durante tres días después de tres días.

Voltee el sistema de cultivo estático 180 grados y transfiéralo a una placa de 12 pocillos. A continuación, observe una mezcla de fibroblastos dérmicos primarios y células tumorales en la superficie apical del SIS. El lado del lumen anterior.

Deje que las células se adhieran durante tres horas. Llene el pocillo con medio para sumergir el cultivo de cultivo, el sistema de prueba de tumores en condiciones estáticas a 37 grados Celsius, 5% de dióxido de carbono durante 14 días adicionales, cambiando el medio de cultivo cada dos o tres días para el cultivo dinámico. Fije el SIS mu entre dos anillos metálicos y siembre los eecs de MV primarios como se demostró anteriormente.

Después de tres días, retire el SIS mu de los anillos metálicos e inserte la membrana en el reactor de flujo con una jeringa y una cánula. Aplique los fibroblastos dérmicos primarios y las células tumorales en la matriz en el biorreactor. Deje que las células se adhieran durante tres horas antes de llenar el sistema de biorreactor con medio de cultivo al día siguiente, coloque el biorreactor en un sistema de incubadora de construcción propia y conéctelo a una bomba peristáltica.

Esta configuración permite el cultivo dinámico con flujo pulsátil regulado por presión o flujo constante. En este experimento, se utiliza un flujo medio constante de 3,8 mililitros por minuto. Mantener el cultivo dinámico durante 14 días, cambiando el medio de cultivo después de siete días.

Al finalizar los experimentos, los tejidos se fijan, se parafinan, se incrustan y se tiñen, y luego se obtienen imágenes con un microscopio inverso. Aquí se muestran los resultados representativos. El panel A ofrece una visión general de la línea celular tumoral S 4 62 cultivada estáticamente en monocultivo 2D teñida con hemattolina.

El cocultivo 3D se muestra en los paneles B, C y D. Esta imagen teñida con H y e muestra el cultivo triple de células tumorales S 4 62 y fibroblastos primarios en el lado apical de la MU SIS y MVEC. En la cara lateral basal, las flechas marcan las células endoteliales. Se pueden identificar diferentes tipos de células mediante la tinción de marcadores específicos del tipo de célula, como el factor de von Willebrand para marcar MVEC que se muestra en el panel C y P 53 que se muestra en el panel D. Las células P 53 positivas S 4 62 se pueden distinguir de los fibroblastos primarios P 53 negativos, y la distribución 3D de las células se puede analizar de la misma manera.

Se pueden identificar diferentes tipos de células en el panel de cultivo triple de cultivo dinámico: A es una imagen teñida con H y E donde las flechas marcan las células endoteliales. El panel B muestra la tinción inmunohistológica para el factor de von Willebrand, y el panel C muestra la tinción para P 53 después de este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como las pruebas de drogas, para responder preguntas adicionales, como cómo encontrar nuevas terapias contra el cáncer o el análisis de vías de señalización importantes en la tumorgénesis.

Además, las células primarias se pueden utilizar para definir el mejor tratamiento personalizado para cada paciente.