Name: Explorar el potencial de la hoja de células madre mesenquimales en el desarrollo de Carcinoma Hepatocelular en Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Explore el desarrollo de un modelo de carcinoma hepatocelular in vivo utilizando tecnología de láminas celulares con células madre mesenquimales en ratas desnudas. Este método permite evaluar terapias anticancerígenas de forma fiable.

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Los autores desean dar las gracias al personal de la Cirugía Experimental y laboratorio Animal de la Facultad de medicina de la Universidad Rey Saud, por su cooperación y apoyo, especialmente Hussain Almukhayzim y Hisham Aloudah. Los autores también desean reconocer el equipo de medios de comunicación de Rey Saud bin Abdul-Aziz University para preparar el visual material especialmente Muath bin Ghannam y Abdulwahab Alsulami.

El protocolo sigue las pautas de cuidado de los animales de Comité de ética de la Universidad Rey Saud. Procedimientos quirúrgicos, anestésicos y otros medicamentos utilizados en animales son aprobados por el Comité de ética de la Universidad Rey Saud. Todo el trabajo experimental es realizado por personal adecuadamente capacitado.
1. célula hoja construcción
<ol><li>Cubrir los platos (platos de cultura sensible a la temperatura de 3.5 cm) de la cultura con puro suero bovino fetal (FBS) y asegúrese de cubrir toda la superficie del plato. Nota: Este paso es importante para la separación de la capa celular puesto que apoya el crecimiento de las células en una monocapa y evita la agregación celular.</li>
	<li>Incubar los platos por 24 h a 37 ° C en una atmósfera humidificada con 5% CO2 y 95% aire.</li>
	<li>Retire el exceso FBS de platos recubiertos y deje que los platos se sequen a temperatura ambiente (RT) durante al menos 1 h.</li>
	<li>Preparar las suspensiones de tres células: 1 x 106 HepG2 células, células 1 x 106 HepG2 con BMMSCs y células 1 x 106 HepG2 con UCMSCs (en una proporción de 4:1 para BMMSCs y UCMSCs).</li>
	<li>La suspensión de células apropiadas a cada plato etiquetado de la semilla.</li>
	<li>Suspender todas las células en medio de cultivo DMEM suplementado con 10% de SBF y el 1% de penicilina/estreptomicina.</li>
	<li>Incube las células a 37 ° C en una atmósfera humidificada con 5% CO2 y 95% aire.</li>
</ol>2. células hoja desprendimiento
<ol><li>En la confluencia de la célula del 100%, tomar los platos fuera de la incubadora de 37 ° C.</li>
	<li>Incubar el plato de hoja de células HepG2 durante 1 h a temperatura ambiente, mientras que la incubación la HepG2/BMMSC y platos de hoja de células HepG2/UCMSC 30-40 min a 20 ° C en una atmósfera humidificada con 5% CO2 y 95% aire. Nota: La hoja de la célula de sólo HepG2 es frágil; reducir la temperatura a 20 ° C causa daños a la estructura de la hoja.</li>
</ol>3. ejecución del procedimiento quirúrgico
Nota: Durante el tiempo de incubación para la separación de la hoja de la célula, inicia un proceso de animales.
<ol><li>
Instrucciones para la preparación de la zona de la cirugía
	<ol>
<li>Llevar a cabo todos los procedimientos quirúrgicos en un área estéril separada dentro del laboratorio, como una campana, gabinete de flujo laminar o una sala de cirugía aséptica. Asegúrese de que todas las superficies de la zona de la cirugía son no porosos, sellado, durable y sanitizable.</li>
		<li>Use equipo de protección adecuado, incluyendo peelings, guantes, mascarillas y cubre la cabeza y zapatos.</li>
		<li>Herramientas de uso quirúrgico que estan limpio y esterilizado (vía autoclave; vástago saturado a alta presión) al principio de la cirugía.</li>
		<li>Cambiar guantes entre ratas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación del animal para la cirugía
	<ol>
<li>Utilizar ratas desnudas de 8 a 12 semanas de edad.</li>
		<li>Crear anestesia inyectable para las ratas.<ol>
<li>Para preparar la solución de anestesia, ketamina-xilacina, mezclar 1 mL de solución salina fisiológica estéril (p. ej., cloruro de sodio 0.9%) en un frasco estéril de 10 mL de suero, 2 mL de ketamina y 1 mL de xilacina (a una concentración de 20 mg/mL) y agitar bien antes de uso.</li>
			<li>Para aplicar anestesia, inyectar 0,2 mL de la solución de ketamina-xilacina por 100 g de peso corporal de la rata por vía intraperitoneal. Nota: La dosis total de la solución es 100 mg/kg de ketamina y 10 mg/kg de xilacina.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Eliminar suciedad/restos visibles del sitio quirúrgico.</li>
		<li>Comprobar la profundidad de la anestesia por la prueba el reflejo de retirada pedal (pizca de almohadilla de pie en ambos pies). Nota: Si el pellizco de almohadilla de pie provoca una respuesta, repetir a dosis de 0,05 mL/100 g (aproximadamente cada 30 minutos), luego vuelva a verificar la profundidad anestésica.</li>
		<li>Desinfectar el área quirúrgica con un exfoliante de dos etapas de povidona-yodo/isopropanol.</li>
		<li>Cubrir la rata con un paño estéril para evitar la contaminación de la incisión.</li>
		<li>Las ratas se inyectan por vía subcutánea con buprenorfina (0.01 - 0.05 mg/kg)8 antes de hacer la incisión.</li>
		<li>Con un bisturí estéril, haga un 7 - a 10 cm entre la piel y los músculos subyacentes para exponer el hígado.<ol>
<li>Separar el músculo abdominal de la piel con el borde plano posterior de la cuchilla.</li>
			<li>Apuñalar con cuidado la linea alba con un bisturí y extender el corte con unas tijeras afiladas.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. trasplante de la hoja de la célula de
Nota: Trasplante de la célula de la hoja se realiza en el hígado.
<ol><li>Recoger la capa celular de la placa de cultivo.<ol>
<li>Golpee suavemente el plato de la cultura en el Banco para separar la hoja de su superficie.</li>
		<li>Separar la capa celular de la superficie del platillo raspando el borde de la hoja en un medio círculo utilizando una pipeta estéril.</li>
		<li>Suavemente Retire el medio de todo la placa de cultivo.</li>
		<li>La hoja esté intacta sin ningún daño; de lo contrario, no puede ser utilizado (figura 1). Nota: Las hojas resultantes pueden ser detectadas directamente por el ojo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar una membrana estéril (papel de filtro) para la cosecha de la hoja de la célula del plato.<ol>
<li>En primer lugar, poner en remojo la membrana con solución salina normal. Luego, retire el exceso salino con una almohadilla de algodón estéril.</li>
		<li>Coloque la membrana húmeda sobre la hoja de la célula, evitando arrugas y burbujas de aire entre la membrana y la capa celular.</li>
		<li>Añadir algunas gotas de suero fisiológico sobre la membrana y la capa celular a recogerlas más fácil. Nota: Para no romper la hoja de la célula, no utilice solución salina fría y levantar la membrana y la capa celular con fórceps.</li>
		<li>Dejar la membrana durante unos segundos asegurar que la capa celular está colocada correctamente en la membrana y luego recogerlo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar el hígado para trasplante de la célula de la hoja.<ol>
<li>Asegúrese de que la superficie hepática está seca golpeando suavemente con una almohadilla de algodón estéril.</li>
		<li>Utilizando pinzas estériles, colocar la membrana con la hoja de la célula en un solo lóbulo del hígado de la rata.</li>
		<li>Añadir unas gotas de solución salina estéril y aplique una ligera presión a la membrana para separar la capa celular de él.</li>
		<li>Espere 5 minutos antes de retirar con cuidado la membrana. Nota: Esto se hace para asegurar que la hoja de la célula está conectada correctamente al hígado.</li>
		<li>Por último, cerrar los músculos y la piel incisiones con suturas de nylon 5-0.</li>
		<li>Desinfectar el área quirúrgica con povidona-yodo. Nota: La figura 2 muestra un diagrama del procedimiento de trasplante de la hoja del celular en el hígado de una rata desnuda.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. después de la cirugía atención
<ol><li>Inmediatamente después de la cirugía, la rata individualmente para evitar el canibalismo o la asfixia de la casa y supervisar regularmente (por lo menos cada 15 min) hasta que esté consciente y totalmente ambulante.</li>
	<li>Luego, evaluar las ratas diariamente durante 5-14 d, por lo menos 5 días postoperatoriamente, para asegurarse de que no hay complicaciones. Durante la evaluación diaria, asegúrese de lo siguiente.<ol>
<li>Se cierra la herida y las suturas están intactas, sin ser excesivamente apretada.</li>
		<li>No hay signos de infección en el sitio de la incisión, como calor, excesiva inflamación o purulenta la descarga.</li>
		<li>No hay signos asociados con el dolor, como menor consumo de alimentos y agua, pérdida de peso, deshidratación, piel acampar o respiración por la boca rápida y abierta. Para control de dolor moderado a intenso después de la cirugía, si inyectar las ratas por vía subcutánea con buprenorfina (0.01 - 0.05 mg/kg) cada 6-8 h9 para un mínimo de 48-72 h después de la operación.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Análisis de la zona trasplantada
<ol><li>Un mes después del trasplante, scarifice la rata y recoger el área trasplantado para histológica y el análisis de immunohistochemical.</li>
</ol>

<ol><li>Marra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+targets+and+oxidative+stress+biomarkers+in+hepatocellular+carcinoma%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Molecular targets and oxidative stress biomarkers in hepatocellular carcinoma: an overview.</a> Journal of Translational Medicine. 9, 171(2011).</li>
<li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130 (4), 601-610 (2007).</li>
<li>Kushida, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decrease+in+culture+temperature+releases+monolayer+endothelial+cell+sheets+together+with+deposited+fibronectin+matrix+from+temperature-responsive+culture+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research%22%5BJournal%5D)">Decrease in culture temperature releases monolayer endothelial cell sheets together with deposited fibronectin matrix from temperature-responsive culture surfaces.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 45 (4), 355-362 (1999).</li>
<li>Okano, T., Yamada, N., Sakai, H., Sakurai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+recovery+system+for+cultured+cells+using+plasma-treated+polystyrene+dishes+grafted+with+poly+%28N-isopropylacrylamide%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">A novel recovery system for cultured cells using plasma-treated polystyrene dishes grafted with poly (N-isopropylacrylamide).</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 27 (10), 1243-1251 (1993).</li>
<li>Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+mesenchymal+stem+cells%3A+their+phenotype%2C+differentiation+capacity%2C+immunological+features%2C+and+potential+for+homing%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing.</a> Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).</li>
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<li>Waterman, R. S., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell+1+%28MSC1%29-based+therapy+attenuates+tumor+growth+whereas+MSC2-treatment+promotes+tumor+growth+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell 1 (MSC1)-based therapy attenuates tumor growth whereas MSC2-treatment promotes tumor growth and metastasis.</a> PLoS One. 7 (9), e45590(2012).</li>
<li>Curtin, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+buprenorphine+in+a+postoperative+pain+model+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Evaluation of buprenorphine in a postoperative pain model in rats.</a> Comparative Medicine. 59 (1), 60-71 (2009).</li>
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<li>Alshareeda, A. T., Sakaguchi, K., Abumaree, M., Mohd Zin, N. K., Shimizu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+cell+sheet+technique+on+the+development+of+hepatocellular+carcinoma+in+rat+models%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The potential of cell sheet technique on the development of hepatocellular carcinoma in rat models.</a> PLoS One. 12 (8), e0184004(2017).</li>
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<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+cell+sheet+technique+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Reports%22%5BJournal%5D)">Application of the cell sheet technique in tissue engineering.</a> Biomedical Reports. 3 (6), 749-757 (2015).</li>
<li>Matsuura, K., Haraguchi, Y., Shimizu, T., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+sheet+transplantation+for+heart+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Cell sheet transplantation for heart tissue repair.</a> Journal of Controlled Release. 169 (3), 336-340 (2013).</li>
<li>Matsuura, K., Shimizu, T., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+development+of+bioengineered+human+three-dimensional+vascularized+cardiac+tissue+using+cell+sheet+technology%5BTitle%5D)+AND+%22International+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Toward the development of bioengineered human three-dimensional vascularized cardiac tissue using cell sheet technology.</a> International Heart Journal. 55 (1), 1-7 (2014).</li>
<li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+evidence+that+tumors+are+angiogenesis+dependent%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent?</a> Journal of the National Cancer Institute. 82 (1), 4-6 (1990).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Una gran cantidad de investigación se dedica a desarrollar un adecuado en vivo preclínicos modelo animal que se asemeja a los cánceres humanos. Actualmente, los principales enfoques utilizados para crear modelos animales de cáncer involucran la ingeniería genética y celular trasplante11. Modelos animales modificados genéticamente son buenas herramientas para la identificación y validación de genes diana, así como la comprensión de los mecanismos moleculares subyacentes la toxicidad droga-...

HCC es un cáncer primario del hígado que está significativamente asociado con un pronóstico pobre. Anualmente, casi medio millón se diagnostican nuevos pacientes con HCC, que representan el 85% de pacientes de cáncer de hígado en todo el mundo1. Hepatocarcinogenesis no es una enfermedad de forma individual; por el contrario, es una colección de enfermedades que tienen diferentes características histopatológicas y la variabilidad genética y genómica, además variados resultados pronóstico1. Por lo tanto, los principales retos en el desarrollo de una estrategia terapéutica efectiva para el CHC son el conocimiento limitado de la biología HCC y la falta de un adecuado modelo experimental animal que puede ayudar a entender esta compleja enfermedad. Un en vivo modelo animal que simula cáncer humano es necesario para la selección de genes candidatos y la identificación de marcadores pronóstico/predicción implicados en la inducción de cáncer, así como para investigar los diferentes factores que pueden afectar las respuestas de cáncer a los agentes terapéuticos.
Estudios de cáncer in vitro están todavía asociados con limitaciones importantes. Esto es debido a que las células cancerosas pierden muchas de sus características en vivo cuando se mantienen en cultivo. Los cambios que se producen a las células en vitro resultado de la ausencia de la fisiología del tejido todo en un entorno de ex vivo . Interacción de célula a célula de cáncer (stromal, inmune, vasculatura, epitelial, etc.) dentro del microambiente del tumor refleja grandemente en cáncer celular características2. El microambiente tumoral podría alterar la expresión de gene de la proteína de la célula de cáncer y características fenotípicas, además de angiogenetic y potencial metastásico. El sistema de cultivo bidimensionales (2D) en vitro también carece de una matriz de tejido adecuado, que es necesaria regular la progresión del tumor. Así, debido a estas limitaciones, en vivo modelos siempre deben ser utilizados para apoyar los resultados preliminares de los modelos en vitro . En este estudio, utilizamos tecnología de hoja de la célula para desarrollar un en vivo modelo animal que aclara el proceso biológico subyacente HCC.
Hace más de una década, laboratorio de Okano estableció un nuevo método de la ingeniería de tejido partiendo de células hoja tecnología3. Esta técnica utiliza un plástico termo-sensible de la cultura para permitir adherencia/desprendimiento celular reversible mediante el control de la hidrofobicidad superficial. Este método permite una extracción suave de células cultivadas en un formato (3D) tridimensional intacta (hoja i.e.,cell), con una cuidada matriz extracelular (ECM) y las interacciones célula a célula. La técnica de la hoja de la célula requiere cubrir el primero de los platos de la cultura con un poly(N-isopropylacrylamide) de polímero sensible a la temperatura (PIPA soy), que está comercialmente disponible y listo para usar. A una temperatura inferior a 20 ° C, PIPA soy polímeros se convierten hidratados y se disuelven en soluciones acuosas, mientras que, en una temperatura más alta (37 ° C), los polímeros se deshidrate y transforman en un precipitado turbio. El polímero contiene amida hidrofílico cadenas y las cadenas laterales hidrofóbicas (grupos isopropilo). A altas temperaturas, el movimiento browniano de las moléculas de agua se intensifica, mientras que a baja temperatura, las moléculas del agua que rodea los grupos isopropilo de la ruptura de la estructura hidratada y los grupos de isopropilo hidrofóbica agregadas debido a las interacciones hidrofóbicas. Por lo tanto, toda la cadena del polímero agregados y precipitados de4.
En el estudio presentado, esta técnica se emplea para desarrollar un modelo animal de HCC con tres hojas de células diferentes. La primera hoja empleada consiste en células HCC célula línea solamente, mientras que las otras dos hojas consisten en una combinación de células de línea de células HCC y MSCs de dos fuentes diferentes: MSCs (BMMSCs) de la médula ósea y cordón umbilical MSCs (UCMSCs). MSCs son células estromales no-hematopoyéticas que son capaces de distinguir los derivados intocell de la estirpe mesenquimal, incluyendo adipocitos, osteocitos, condrocitos y miocitos5. La razón por la que emplean estas células al crear la hoja de la célula de cáncer es la información inconsistente sobre el efecto de MSCs en cánceres. Se ha sugerido que MSCs pueden tener dos fenotipos distintos: "MSC1", un fenotipo proinflamatorias y "MSC2", un fenotipo inmunosupresores6. MSCs expresan receptores toll-like (TLRs). Cebado de TLR4 de MSCs aumenta su secreción de factores proinflamatorios, mientras que TLR3 cebado aumenta su secreción de factores inmunosupresores6. Un estudio en vitro de estos dos fenotipos informó que un cocultivo de MSC1 con líneas celulares de cáncer había atenuado crecimiento celular del cáncer, mientras que cultura Co MSC2 tenía el efecto opuesto7. Esto implica que MSCs pueden ser cáncer Pro o contra el cáncer, según su fenotipo. Así, además de desarrollar el modelo animal de HCC, utilizando la tecnología de hoja celular, queremos explorar el efecto de los trasplantes MSC en el desarrollo del tumor, y si estas células se aumentar o reducir el desarrollo de este modelo.

<table><tbody><tr><td><reactivos fuertes> </fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS&nbsp;</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>DMEM alto contenido de glucosa&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D5671-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina&nbsp;</td><td>Life Technology</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>solución salina fisiológica estéril</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>S0817-1GA</td><td></td></tr><tr><td>Línea celular HepG2 humana</td><td>ATCC, EE. UU</td>. <td>HB-8065</td><td></td></tr><tr><td>Médula ósea humana MSCs línea celular PromoCell</td><td>, EE. UU</td>. <td>C-12974</td><td></td></tr><tr><td>tejido de cordón umbilical humano MSCs</td><td>PromoCell, EE. UU. &nbsp;</td><td>C-12971</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina 50%</td><td>Rompun, Bayer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xilacina 2%</td><td>Rompun</td><td>23076-35-9</td><td></td></tr><tr><td>Alphadine&reg; &nbsp; solución.</td><td>Riyadh Pharma</td><td>LBL0816</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Desechables:&nbsp; < / fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15mL Tubo de centrífuga de polipropileno de alta claridad PP</td><td>Halcón &nbsp;</td><td></td><td></td>352097</tr><tr><td>placas de cultivo estériles UpCell de 3,5 cm con el papel de filtro (membrana)</td><td>Sigma</td><td>174904-1CS</td><td></td></tr><tr><td>100-1000 &micro; l &nbsp; Puntas de pipeta&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>CLS4868-1000EA&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Procedimiento básico Cortina</td><td>Thermofisher</td><td>PMD5293.0</td><td></td></tr><tr><td>Equipment&nbsp; Pipeta </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plus, volumen variable</td><td>Eppendorf&reg; &nbsp; Investigación&reg;</td><td>Z683779-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de cultivo de tejidos 37 &deg; C, 5% CO2</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cabina de seguridad biológica</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de cultivo de tejidos 20 &deg; C, 5% CO2</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Herramientas quirúrgicas estériles y ratas desnudas:&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tijeras</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>bisturí &nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sutura de nylon&nbsp; 5-0</td><td>Accutome</td><td>AB-3854S</td><td>Monofilamento, Lanceta</td></tr><tr><td>1 ml Jeringas de Tuberculina</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-88</td><td></td></tr><tr><td>Ratas desnudas&nbsp;</td><td>Río</td><td></td><td></td> Charles</tr></tbody></table>

explorar el potencial de la hoja de células madre mesenquimales en el desarrollo de carcinoma hepatocelular en vivo

Exploring the Potential of Mesenchymal Stem Cell Sheet on The Development of Hepatocellular Carcinoma In Vivo

Un en vivo modelo animal que simula cáncer podría tener diversas aplicaciones que ofrecen información clínica importante. Las técnicas actualmente utilizadas para el desarrollo de modelos de cáncer en vivo tienen considerables limitaciones. Por lo tanto, en este estudio, nuestro objetivo es implementar la tecnología de hoja de la célula para desarrollar un modelo de cáncer en vivo . Carcinoma hepatocelular (HCC) se desarrolló con éxito en ratas desnudas utilizando hojas de célula creadas a partir de células de línea de células HCC. Las hojas de la célula de cáncer se generan a través de la adhesión intracelular y la formación de una estructura estratificada, controlada por la matriz extracelular. Esto permite que el trasplante de la hoja HCC en el hígado y la creación de un modelo animal con tumores dentro de un mes. Además, se investiga el papel de las células madre mesenquimales (MSC) en el desarrollo de este modelo de cáncer. Además de la hoja de línea de células HCC, se crean otro hojas de dos células: una hoja de células HCC y médula MSCs (BMMSCs) y una hoja de células HCC y cordón umbilical MSCs (UCMSCs). Las hojas que tienen una combinación de células HCC y MSCs también son capaces de producir un animal con tumores. Sin embargo, la adición de MSCs reduce el tamaño del tumor formado, y este efecto adverso en el desarrollo del tumor varía dependiendo de la fuente de las MSCs usado. Esto indica que se podría utilizar una hoja de la célula de ciertos subtipos MSC en control y gestión de tumor.

Colonización de hojas de células trasplantadas en ratas:
Un mes después del trasplante, todas las hojas de células trasplantadas en hígados de ratas han desarrollado tumores (figura 3). El tamaño promedio de los tumores desarrollados desde hojas de células HepG2/UCMSC, HepG2/BMMSC y HepG2 fueron 4,5 cm, 4 cm y 2,5 cm, respectivamente10.
<p class="jove_con...

Aquí, presentamos un protocolo para desarrollar un modelo de cáncer en vivo utilizando la tecnología de hoja de la célula. Tal modelo podría ser muy útil para la evaluación de la terapéutica contra el cáncer.

Explorar el potencial de la hoja de células madre mesenquimales en el desarrollo de Carcinoma Hepatocelular en Vivo

An in vivo animal model that mimics human cancer could have various applications that deliver significant clinical information. The currently used ...

Hola, soy el Dr. Alaa Alshareeda del Centro Internacional de Investigación Médica Rey Abdullah en el Departamento de Células Madre y Medicina Regenerativa. Hoy demostraremos el efecto de las células madre mesenquimales en el desarrollo de carcinoma hepatocelular en un modelo de rata mediante el uso de la tecnología de lámina celular. Hola, soy Abdullah Almubarak.Trabajo en Cirugía Experimental y Laboratorio Animal en la Universidad King Saud. Utilizamos la rata desnuda para evitar cualquier rechazo después de trasplantar la lámina de células. Este diagrama muestra el procedimiento de trasplante de láminas celulares en ratas desnudas.En este estudio se utilizarán ratas desnudas de ocho a 12 semanas de edad. Primero, corte las ratas y haga un corte de siete a diez centímetros entre la piel y los músculos subyacentes con bisturí para exponer el hígado. Para transferir la lámina de células, utilice una membrana estéril.Coloque la membrana sobre la lámina celular para recogerla. A continuación, coloque la lámina celular con la membrana sobre un lóbulo del hígado. Construcción de lámina de celda.Antes de sembrar las células, cubra las placas de cultivo UpCell de 3,5 centímetros sensibles a la temperatura con FBS sin diluir. El recubrimiento de las placas con FBS favorece el crecimiento de las células en la capa de membrana y evita la degradación de las células. Asegúrese de cubrir toda la superficie de los platos.Incubar las placas durante 24 horas a 37 grados centígrados en una atmósfera humidificada que contenga un 5% de dióxido de carbono y un 95% de aire. Al día siguiente, retire el exceso de FBS y deje que los platos se sequen a temperatura ambiente durante al menos una hora. Siembrar al menos un millón de células cancerosas HepG2 solas o cocultivadas con células madre mesenquimales en un medio de cultivo DMEM.El medio suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina. La proporción utilizada de células cancerosas a células madre mesenquimales en este estudio es de 4:1. Después de agregar las celdas, agite suavemente los platos.Incubar las células a 37 grados centígrados en una atmósfera humidificada que contenga un 5% de dióxido de carbono y un 95% de aire. Desprendimiento de la lámina de la celda. Al 100% de confluencia celular, saque las placas de la incubadora a 37 grados centígrados.Ahora, incube la lámina de células cancerosas HepG2 durante una hora a temperatura ambiente, mientras incuba la HepG2 cocultivada con células madre mesenquimales durante 30 a 40 minutos a 20 grados Celsius en una atmósfera humidificada que contenga 5% de dióxido de carbono al 95% de aire. Durante el tiempo de incubación para el desprendimiento de la lámina celular, inicie el procedimiento con el animal. Todos los estudios en animales fueron aprobados por el comité de ética de la Universidad Rey Saud.Realización del procedimiento quirúrgico. Compruebe la profundidad de la anestesia probando el reflejo de retirada del pedal. Desinfecte el área de la cirugía con yodo.Ahora, aplica un segundo exfoliante con yodo. Cubra al animal con un paño esterilizado para evitar la contaminación de la incisión. Con un bisturí esterilizado, haga un corte entre la piel y los músculos subyacentes, de unos siete a diez centímetros de tamaño, para exponer el hígado.Separe el músculo abdominal de la piel con el borde trasero plano del bisturí. Apuñale con cuidado la línea alba con un bisturí y extienda el corte con una tijera afilada. Trasplante de lámina celular en hígado de rata.Golpee suavemente el plato de cultivo sobre el banco para separar la hoja de su superficie. Separe la hoja de celdas de la superficie del plato raspando los bordes de la hoja en un semicírculo. Ahora, retire suavemente todo el medio de cultivo del plato.Asegúrese de que la hoja esté intacta sin ningún daño, de lo contrario, no se puede usar. Prepare una membrana estéril para recolectar y transferir la lámina de células. Entonces, primero, empape la membrana con solución salina normal, luego elimine el exceso de solución salina con un bastoncillo de algodón estéril.Coloque la membrana húmeda sobre la lámina celular, evitando cualquier burbuja de aire entre la membrana y la lámina celular. Agregue unas gotas de solución salina normal sobre la membrana y la lámina celular para recoger el material. Deje la membrana durante unos segundos para asegurarse de que la lámina celular esté correctamente adherida a la membrana, luego recójala.Ahora, prepare el hígado para el trasplante. Asegúrese de que la superficie del hígado esté seca. Coloque la membrana con la lámina celular sobre un solo lóbulo del hígado de la rata.Agregue unas gotas de solución salina esterilizada para separar la lámina celular de la membrana. Espere cinco minutos antes de retirar con cuidado la membrana. La lámina de células se puede ver adjunta en el hígado en este video.Finalmente, cierre los músculos subyacentes y las incisiones de la piel con cinco suturas de nailon. Después de cerrar la incisión, desinfecte el área de la cirugía con betadine. El tiempo desde que se apaga la anestesia hasta que se levanta la cabeza es variable, pero suele oscilar entre cinco y 20 minutos.Esta figura muestra el tumor desarrollado en el hígado de rata después de un mes de trasplante de lámina de células HepG2. Aquí, el tumor se desarrolló después del trasplante de células cancerosas HepG2 fabricadas con láminas celulares y células madre mesenquimales de la médula ósea. Mientras que este muestra, el tumor más pequeño desarrollado en el hígado de rata después del trasplante de la lámina celular fabricada a partir de células cancerosas HepG2 y células madre mesenquimales del cordón umbilical, esta figura muestra la tinción H y E del hígado de rata después de un mes de trasplante de lámina celular.Donde A representa células hepáticas normales de rata y B muestra células hepáticas cancerosas de rata. Conclusión. Entonces, después de ver este video, debería poder desarrollar un modelo de carcinoma hepatocelular en ratas desnudas mediante el uso de la tecnología de láminas de células. Gracias por mirar.

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