Reconocimiento de secuencia específica y selectivo de RNAs de doble cadena sobre ARN monocatenario de modifica químicamente los ácidos nucleicos péptidos

El objetivo general de este artículo de métodos es presentar los protocolos detallados utilizados por nuestro laboratorio para estudiar el reconocimiento molecular de ARN bicatenarios por ácidos nucleicos péptidos químicamente modificados. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología química del ARN, como la detección y el direccionamiento de estructuras de ARN. La principal ventaja de esta técnica es que los principios de diseño pueden aplicarse al direccionamiento de cualquier estructura de dúplex de ARN.

La procedura será demostrada por Desiree Toh, una asociada de investigación de mi laboratorio. Para comenzar este procedimiento, agregue cuatro microlitros de una solución de glicerol al 35 % a las muestras de ARN-PNA previamente preparadas y mezcle suavemente. Utilizando una micropipeta y puntas para carga de geles, cargue cuidadosamente 20 microlitros de cada muestra en un gel de poliacrilamida previamente preparado, asegurándose de no introducir burbujas de aire.

Corra el gel a un voltaje constante de 250 voltios durante cinco horas. Después de cinco horas, apague la fuente de alimentación y retire la placa de vidrio del soporte del gel. Luego retire la cinta selladora del gel y desarme la placa de vidrio.

Retire suavemente el gel de la placa de vidrio y colóquelo en un recipiente lleno con 350 mililitros de agua desionizada. Añada cuidadosamente 35 microlitros de bromuro de etidio al recipiente y colóquelo en el agitador rotatorio a baja velocidad durante 30 minutos. Después de desechar la solución de bromuro de etidio, enjuague el gel con 1,5 a dos litros de agua destilada.

Luego, escanee el gel utilizando un equipo de imagen con un láser verde de 532 nanómetros y un filtro de emisión ajustado a 610 nanómetros. Cuantifique las intensidades de las bandas del gel utilizando software gratuito. Transfiera la cantidad adecuada de ARN bicatenario marcado con 2-aminopurina a un tubo limpio de 1,5 mililitros.

Luego, concentre las soluciones de ARN utilizando un concentrador al vacío. A continuación, transfiera los volúmenes adecuados del PNA diana para diversas concentraciones desde el stock principal previamente preparado a tubos separados de 1,5 mililitros. Concentre las soluciones de PNA utilizando el concentrador al vacío.

Añada 975 microlitros de tampón de incubación al tubo que contiene el ARN seco y mezcle bien para asegurar que todo el ARN se disuelva. Después de centrifugar brevemente la solución de ARN, sométala a hibridación colocando el tubo en un bloque térmico precalentado durante 10 minutos. Una vez finalizado, apague el bloque térmico y deje que la muestra se enfríe a temperatura ambiente.

Añada 75 microlitros de ARN a cada uno de los tubos que contienen el PNA seco y mezcle bien. Después de dejar que las muestras reposen a temperatura ambiente durante al menos una hora, incúbelas a cuatro grados Celsius durante la noche. Ahora, transfiera las cantidades adecuadas de ARN monocatenario marcado con 2-aminopurina a tubos separados de 1,5 mililitros.

Transfiera los volúmenes adecuados de PNA dirigido para diversas concentraciones desde el stock principal a los tubos respectivos que contienen el ARN de cadena sencilla. Después de secar las muestras, agregue 75 microlitros de tampón de incubación a cada uno de los tubos y mezcle completamente. Somete cada muestra a hibridación colocando cada tubo en un bloque térmico precalentado durante 10 minutos.

Después de permitir que las muestras se enfríen a temperatura ambiente, incúbelas a cuatro grados Celsius durante la noche. A continuación, transfiera 70 microlitros de cada muestra a una cubeta cuadrada de un centímetro. Coloque la cubeta en un espectrofotómetro de fluorescencia y mida la emisión en el rango de longitud de onda de 330 a 550 nanómetros.

Una vez finalizada la medición, retire el tampón de la cubeta. Enjuague la cubeta con agua destilada y seque con gas nitrógeno. Después de repetir la medición para todas las muestras, grafique la intensidad de fluorescencia frente a la longitud de onda.

Transfiera las cantidades apropiadas de ARN de cadena sencilla a tubos separados de 1,5 mililitros. Luego transfiera los volúmenes adecuados de PNA dirigido desde el stock principal a los tubos respectivos que contienen el ARN de cadena sencilla. Después de secar las muestras, agregue 130 microlitros de tampón de incubación a cada uno de los tubos y mezcle bien.

Somete cada muestra a un proceso de recocido colocando cada tubo en un bloque térmico precalentado durante 10 minutos. Después de permitir que las muestras se enfríen a temperatura ambiente, incúbalas a cuatro grados Celsius durante la noche. A continuación, transfiere 130 microlitros de cada muestra a una cubeta de ocho microceldas, con una celda conteniendo tampón de incubación.

Utilizando un espectrofotómetro UV-Vis, mida la absorbancia de cada muestra a 260 nanómetros. Mida a temperatura creciente desde 15 hasta 95 grados Celsius, seguido de temperatura decreciente desde 95 hasta 15 grados Celsius a una velocidad de rampa de 0,5 grados Celsius por minuto. Los oligómeros de PNA se obtuvieron tras dos purificaciones por HPLC en fase reversa.

La identidad de las PNA puede confirmarse mediante análisis MALDI/TOF. Los datos de PAGE no desnaturalizante sugieren que la PNA modificada con Q y L solo puede reconocer la región de ARN de doble cadena con un par C-G. Este reconocimiento específico y mejorado se lleva a cabo mediante la formación de dos tríadas basadas en PNA-ARN: T-A-U-L-G-C y Q-C-G.

Un estudio de titulación de fluorescencia de 2-aminopurina mostró que una PNA modificada con Q y L se une a un ARN bicatenario diana, pero no al ARN monocatenario. Las PNA que contienen residuos Q no muestran transiciones de fusión térmica, lo que sugiere ausencia de unión al ARN monocatenario debido al choque estérico en el par Q-G tipo Watson-Crick. En comparación con la PNA no modificada P1, las PNA P4 y P5 que contienen residuos L presentan una temperatura de fusión más baja para los dúplex correspondientes de ARN-PNA debido al choque estérico en el par L-G tipo Watson-Crick.

Los datos de fusión térmica detectados por absorbancia UV son consistentes con los datos de titulación de fluorescencia de 2-aminopurina, que también muestran que un PNA que contiene residuos Q y L no se une fuertemente al ARN de cadena sencilla. La incorporación de una base Q es más desestabilizadora que una base L, ya que una base Q presenta un choque estérico más significativo en la formación de un par Q-G similar al de Watson-Crick. Una vez dominados, los diversos experimentos pueden realizarse en una semana si se llevan a cabo adecuadamente.

Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la detección y el direccionamiento de estructuras de ARN en células, con el fin de responder preguntas adicionales, como si podemos detectar estructuras de ARN y regular las funciones del ARN mediante el uso de PNAs que se unen al ARN bicatenario. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología del ARN y las enfermedades exploraran el desarrollo de terapias dirigidas a la estructura del ARN.