Reconocimiento de secuencia específica y selectivo de RNAs de doble cadena sobre ARN monocatenario de modifica químicamente los ácidos nucleicos péptidos

El objetivo general de este artículo sobre métodos es presentar los protocolos detallados utilizados por nuestro laboratorio para estudiar el reconocimiento molecular de ARN bicatenarios por ácidos nucleicos peptídicos modificados químicamente. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología química del ARN, como la detección y la orientación de estructuras de ARN. La principal ventaja de esta técnica es que los principios de diseño pueden ser aplicables a la orientación de cualquier estructura dúplex de ARN.

La demostradora del procedimiento estará a cargo de Desiree Toh, investigadora asociada de mi laboratorio. Para comenzar este procedimiento, agregue cuatro microlitros de una solución de glicerol al 35% a las muestras de ARN PNA previamente preparadas y mezcle suavemente. Con una micropipeta y puntas de carga de gel, coloque cuidadosamente 20 microlitros de cada muestra en un gel de poliacrilamida previamente preparado, asegurándose de no introducir burbujas de aire.

Haga funcionar el gel a un voltaje constante de 250 voltios durante cinco horas. Después de cinco horas, apague la fuente de alimentación y retire la placa de vidrio del soporte de gel. A continuación, retire la cinta de sellado de gel y desmonte la placa de vidrio.

Retire suavemente el gel de la placa de vidrio y colóquelo en un recipiente lleno de 350 mililitros de agua desionizada. Agregue con cuidado 35 microlitros de bromuro de etidio al recipiente y colóquelo en el agitador de plataforma a velocidad baja durante 30 minutos. Después de desechar la solución de bromuro de etidio, enjuague el gel con 1,5 a dos litros de agua destilada.

A continuación, escanee el gel con un generador de imágenes con un láser verde de 532 nanómetros y el filtro de emisión ajustado a 610 nanómetros. Cuantifique las intensidades de las bandas de gel utilizando software libre. Transfiera la cantidad adecuada de ARN bicatenario marcado con 2-aminopurina a un tubo limpio de 1,5 mililitros.

A continuación, concentre las soluciones de ARN utilizando un concentrador de vacío. A continuación, transfiera los volúmenes apropiados del PNA objetivo para diversas concentraciones del material principal previamente preparado a tubos separados de 1,5 mililitros. Concentre las soluciones de PNA utilizando el concentrador de vacío.

Agregue 975 microlitros de tampón de incubación al tubo que contiene el ARN seco y mezcle bien para asegurarse de que todo el ARN se disuelva. Después de centrifugar brevemente la solución de ARN, sométala a recocido colocando el tubo en un bloque de calor precalentado durante 10 minutos. Cuando termine, apague el bloque de calor y deje que la muestra se enfríe a temperatura ambiente.

Añadir 75 microlitros de ARN a cada uno de los tubos que contienen el PNA seco y mezclar bien. Después de dejar que las muestras se asienten a temperatura ambiente durante al menos una hora, incube a cuatro grados centígrados durante la noche. Ahora, transfiera las cantidades apropiadas de ARN monocatenario marcado con 2-aminopurina a tubos separados de 1,5 mililitros.

Transfiera los volúmenes apropiados de PNA objetivo para diversas concentraciones del stock principal a los tubos respectivos que contienen el ARN monocatenario. Después de secar las muestras, agregue 75 microlitros de tampón de incubación a cada uno de los tubos y mezcle bien. Someta cada muestra a recocido colocando cada tubo en un bloque de calor precalentado durante 10 minutos.

Después de dejar que las muestras se enfríen a temperatura ambiente, incube a cuatro grados centígrados durante la noche. Después de esto, transfiera 70 microlitros de cada muestra a una cubeta cuadrada de un centímetro. Coloque la cubeta en un espectrofotómetro de fluorescencia y mida la emisión en un rango de longitud de onda de 330 a 550 nanómetros.

Una vez completada la medición, retire el tampón de la cubeta. Enjuague la cubeta con agua destilada y seque con gas nitrógeno. Después de repetir la medición para todas las muestras, trace la intensidad de fluorescencia frente a la longitud de onda.

Transfiera las cantidades adecuadas de ARN monocatenario a tubos separados de 1,5 mililitros. A continuación, transfiera los volúmenes adecuados de PNA objetivo del stock principal a los tubos respectivos que contienen el ARN monocatenario. Después de secar las muestras, agregue 130 microlitros de tampón de incubación a cada uno de los tubos y mezcle bien.

Someta cada muestra a recocido colocando cada tubo en un bloque de calor precalentado durante 10 minutos. Después de dejar que las muestras se enfríen a temperatura ambiente, incube a cuatro grados centígrados durante la noche. Ahora, transfiera 130 microlitros de cada muestra a una cubeta de ocho microceldas con una celda que contiene tampón de incubación.

Usando un espectrofotómetro UV-Vis, mida la absorbancia de cada muestra a 260 nanómetros. Mida a una temperatura creciente de 15 a 95 grados Celsius seguida de una temperatura decreciente de 95 a 15 grados Celsius a una velocidad de rampa de 0,5 grados Celsius por minuto. Los oligómeros de PNA se obtuvieron después de dos purificaciones por HPLC en fase inversa.

La identidad de los PNA puede confirmarse mediante el análisis MALDI/TOF. Los datos de PAGE no desnaturalizantes sugieren que el PNA modificado Q y L solo puede reconocer la región de ARN bicatenario con un par C-G. Este reconocimiento específico y mejorado se realiza a través de la formación triple basada en dos T-A-U-L-G-C y Q-C-G PNA RNA.

Un estudio de titulación de fluorescencia de 2-aminopurinas mostró que un PNA modificado con Q y L se une a un ARN bicatenario dirigido, pero no a un ARN monocatenario. Los PNAs que contienen residuos Q no muestran transiciones de fusión térmica, lo que sugiere una ausencia de unión al ARN monocatenario debido al choque estérico en el par Q-G de Watson Watson-Crick. En comparación con el PNA P1 no modificado, los PNA P4 y P5 que contienen residuos de L muestran una temperatura de fusión más baja para los dúplex de ARN PNA correspondientes debido al choque estérico en el par L-G de Watson-Crick.

Los datos de fusión térmica detectados por absorbancia UV son consistentes con los datos de valoración de fluorescencia de 2-aminopurina, que también muestran que un PNA que contiene residuos Q y L no se une fuertemente al ARN monocatenario. La incorporación de una base Q es más desestabilizadora que una base L, ya que una base Q tiene un choque estérico más significativo en la formación de un par Q-G similar al de Watson-Crick. Una vez dominados, los diversos experimentos se pueden realizar en una semana si se realizan correctamente.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como sondear y dirigirse a las estructuras de ARN en las células, con el fin de responder a preguntas adicionales como si podemos detectar estructuras de ARN y regular las funciones del ARN mediante el uso de PNA de unión a ARN bicatenario. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología del ARN y la enfermedad exploraran el desarrollo terapéutico dirigido a la estructura del ARN.