Name: Reconocimiento de secuencia específica y selectivo de RNAs de doble cadena sobre ARN monocatenario de modifica químicamente los ácidos nucleicos péptidos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Aprende a estudiar el reconocimiento molecular de ARN de doble cadena mediante ácidos nucleicos péptidos modificados químicamente. Este protocolo utiliza electroforesis y espectrofotometría de fluorescencia para caracterizar interacciones específicas.

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Este trabajo fue apoyado por el Singapur Ministerio de Educación (MOE) nivel 1 (RGT3/13 y RG42/15 a G.C.) y MOE nivel 2 (MOE2013-T2-2-024 y MOE2015-T2-1-028 a G.C.).

Que se haya presentado una solicitud de patente (PAT/179/14/15/PCT) basada en el trabajo reportado aquí.

Oligómeros PNA RNA duplex vinculante (por ejemplo, 10-mers) son moléculas de tamaño mediano y así puede mostrar cambio de movilidad electroforética a enlace de RNAs con un tamaño comparable o ligeramente mayor (por ejemplo, 50-mer o menor). Si un ARN es significativamente mayor que la Prefectura Naval Argentina, valoración de PNA en el RNA puede no funcionar debido a un cambio de movilidad limitada gel. Así, el RNA grande puede truncarse por los análisis de la página no desnaturalizantes. Valoración de un RNA grande en una PNA fluoróforo permite el seguimiento de la formación del triple por un gel de agarosa desnaturalizantes no con la muestra cargada en el gel de40.
Para un experimento de valoración por página no desnaturalizar con una concentración total constante de ARN, por lo general usamos una concentración de RNA sin etiqueta de 1 μm para eficiente post coloración del RNA libre y bandas triples por bromuro de etidio. Una concentración de RNA tan baja como 0.2 μm también puede ser suficiente según el RNA construir31. La concentración del RNA sin etiqueta (0,2 μm) determina que los valores ded de Kque pueden medirse con precisión deben ser de 0,2 μm o más grandes. Otros colorantes de tinción pueden utilizarse para mejorar la eficacia de la coloración. Por otra parte, nuestros datos no publicados sugieren que Cy3 RNAs de marcado tinte puede utilizarse en condiciones no desnaturalizantes página experimentos para medir los eventos atascamiento apretado.
Debido a que sólo es moderadamente fluorescente 2-aminopurina, 2-aminopurina valoración de fluorescencia también es limitada a la medida del enlace con valores ded de Kcerca o por encima de 0,2 μm31. El ARN o la ANP puede etiquetarse con un tinte relativamente brillante para cuantificar un atascamiento relativamente estrecha en la solución a través de la valoración de la fluorescencia, si la Unión resulta en cambios en la fluorescencia señales53,54, 55.
La estrategia de focalización estructuras de ARN por Unión dsRNA PNAs ha sido probada para un número limitado de RNAs. Es probable que enlace propiedades puede variar por dsRNAs con diferentes composiciones de secuencias y pares. Uno siempre puede elegir la hebra rica en purina de un dúplex para el diseño de TFPNAs. Es fundamental entender cómo consecutivos Q· C-G triples pueden afectar la estabilidad de un triplex. Estudios más extensos de la secuencia-dependientes son necesarias para comprender las propiedades de enlace dependiente de la secuencia de TFPNAs.
La afinidad de TFPNAs puede mejorarse aumentando la longitud y/o modificar aún más las bases y redes troncales56,57 TFPNAs. Sin embargo, una región continua de dos caras puede a menudo consiste de más de 10 pares de bases consecutivos sin la interrupción por estructuras de Watson-Crick. Uno puede conjugar TFPNAs con pequeñas moléculas para el reconocimiento de Watson-Crick estructuras adyacentes a las regiones de dsRNA. En principio, se espera que una conjugación de la molécula de TFPNA pequeñas han mejorado la afinidad y especificidad en comparación con un TFPNA o solamente pequeñas moléculas. Sin embargo, las propiedades químicas y físicas de la linker para la conjugación58,59,60,61,62,63,64 debe ser optimizado.
El hecho de que TFPNAs puede atar selectivamente a dsRNAs ssRNAs y dsDNAs sugiere que es posible desarrollar TFPNAs sondas químicas muy útiles como ligandos potenciales terapéuticos a través de la regulación de la dinámica estructural del RNA y las interacciones con proteínas y metabolitos. La absorción celular de TFPNAs puede facilitarse a través de la conjugación con moléculas de penetrar en la célula como moléculas pequeñas, péptidos y nanopartículas, o formación de complejos con estructuras supramoleculares como liposomas5,6 ,12,17,25,31,41,65,66. Funcionalización de TFPNAs con las etiquetas de Bioimagen como fluoróforos y radioisótopos puede facilitar aún más la detección, la proyección de imagen y el señalamiento de estructuras de RNA funcionales en los organismos vivos.

RNAs están emergiendo como importantes biomarcadores y dianas terapéuticas, debido a los recientes avances en los descubrimientos de los roles de los RNAs en la regulación y la catálisis de procesos biológicos diversos1,2,3. Tradicionalmente, se han utilizado hilos antisentidos para enlazar a ssRNAs a través de Watson-Crick formación duplex3,4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. recientemente, triplex formando péptidos ácidos nucleicos (TFPNAs) han sido diseñados para enlazar a dsRNAs vía hidrógeno Hoogsteen vinculación (figura 1)3,28,29. dsRNA regiones están presentes en la mayoría de los ARNs antisentido dirigidos tradicionales, incluyendo pre-mRNAs y mRNAs, pre- o pri-miRNAs3y muchos otros no-codificación RNAs1,26,27. DsARNs a través de la formación de la triple hélice con TFPNAs puede ser ventajosa debido a la especificidad de su estructura y es de gran potencial para el uso en la restauración de las funciones normales de las RNAs, que son normales en las enfermedades, por ejemplo.
El recientemente publicado trabajo de Rozners et al.y nosotros3,28,29,30,31,32,33, 34,35,36,37,38,39,40,41, informó de los esfuerzos en la mejora de la Unión selectiva de TFPNAs modificados a dsRNAs con mayor afinidad. Hemos desarrollado métodos de síntesis de monómeros PNA racionalmente diseñados (figura 2) incluyendo thio-pseudoisocytosine (L) monómero30 y guanidina-modificado 5-metil citosina (Q) monómero31. A través de varios métodos de caracterización bioquímica y biofísica, hemos demostrado que PNAs relativamente corto (6-10 residuos) incorporación de residuos de L y Q muestren mejor reconocimiento de pares de bases Watson-Crick G-C y C-G, respectivamente, en dsRNAs. Por otra parte, comparado con PNAs sin modificar, PNAs que contiene residuos de L y Q mostraron enlace más selectiva hacia dsARN ssRNA y dsDNA. La funcionalidad de guanidina42 en la base de Q permite PNAs entrar en las células de HeLa31.
En nuestro laboratorio, sintetizamos PNAs por la Boc-química manual (Boc o t- Boc es tert-butyloxycarbony (ver figura 2) de método de síntesis de péptidos de fase sólida4. La síntesis del monómero PNA con Boc como la amina protección de grupo es conveniente que el grupo Boc es sterically menos voluminoso en comparación con la amina fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) protección de grupo, que puede ser beneficioso durante el monómero PNA de acoplamiento la soporte sólido. El grupo Boc es ácido lábil y se puede quitar fácilmente en el soporte sólido por 20-50% de ácido trifluoroacético (TFA) en diclorometano (DCM) durante la síntesis de PNA. Un sintetizador de péptidos automatizada se puede emplear para sintetizar oligómeros PNA; sin embargo, 3-5-fold exceso de monómero PNA es necesario para un sintetizador de péptidos automatizada. Síntesis manual requiere significativamente menos monómero ANP (2-3-fold exceso), con cada acoplamiento fácilmente monitoreado por el Kaiser prueba43. Además, muchos sintetizadores automatizados no son compatibles con la síntesis de la estrategia de Boc debido al uso de TFA corrosivo durante el paso de eliminación de Boc.
Los oligómeros PNA pueden ser purificados por fase reversa cromatografía líquida alto rendimiento (RP-HPLC) seguida de la caracterización del peso molecular por MALDI-TOF (figuras 3 y 4)30, 31. empleamos página no desnaturalizantes para monitorear la triple formación, debido a que construye duplex RNA libre y PNA obligado triplex a menudo muestran diferente migración tasas (figura 5)30,31 . No etiquetado es necesario si la coloración eficiente puede lograrse para ambos el RNA duplex y PNA· Bandas triples de RNA2 . Una relativamente pequeña cantidad de muestra se necesita para no desnaturalizar página experimentos. Sin embargo, los almacenadores intermediarios del cargamento (incubación) y los buffers de corrientes (pH 8,3) pueden no ser el mismo, dando por resultado las medidas se limita a la conexión cinéticamente estable, debido a un pH relativamente alto de 8.3 significativamente puede desestabilizar un triplex.
2-aminopurina es un isómero de la adenina (6-aminopurina); la intensidad de fluorescencia de la 2-aminopurina (con un pico de emisión en alrededor de 370 nm) es sensible a los cambios del entorno estructural y es conveniente para el seguimiento de la formación de triplex con el residuo de la 2-aminopurina incorporados cerca de la Prefectura Naval Argentina (sitio de Unión Figura 6) 31. a diferencia de muchos otros tintes que muestran la emisión de fluorescencia en la gama visible, RNA 2-aminopurina-labeled puede estar expuesto a luz de la habitación sin blanquear de la foto. A diferencia del experimento de la página en la que con frecuencia es necesaria un corriente buffer de pH 8.3, 2-aminopurina basado en titulación de fluorescencia permite la medición de la Unión en una sola solución a un pH determinado y así puede permitir la medición y detección de relativamente débil y enlace cinéticamente inestable equilibrio.
Experimentos de fusión termal detección de absorbancia UV permiten la medición de la estabilidad térmica de dúplex (figura 7)31 y tricomplejos30,32,44,45. Dependiendo de la composición de longitud y secuencia, la fusión de conexión puede o no puede mostrar una transición clara. Parámetros termodinámicos pueden obtenerse si se superponen las curvas de calentamiento y enfriamiento. Parámetros termodinámicos exactos se pueden obtener por titulación isotérmica calorimetría (ITC)32; sin embargo, cantidades relativamente grandes de muestras son generalmente necesarios para la ITC.

<table><tbody><tr><td>Tamices moleculares, 4A, pellets de 1-2 mm de diámetro&nbsp;</td><td>Alfa Aesar</td><td>87956</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de 4-metilbenzhidrilamina (MBHA&Yuml; HCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>532444</td><td></td></tr><tr><td>N,N-diisopropiletilamina (DIPEA)</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11801</td><td></td></tr><tr><td>(Benzotriazol-1-il-oxy)tripirrolidinofosfonio hexafluorofosfato (PyBOP)</td><td>Alfa Aesar</td><td>B25251</td><td></td></tr><tr><td>Anhyride acético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320102</td><td></td></tr><tr><td>Kaiser Test Kit&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60017</td><td></td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético (TFA)</td><td>Alfa Aesar</td><td>L06374</td><td></td></tr><tr><td>Monómeros de PNA no modificados</td><td>ASM Research Chemicals GmbH</td><td>5004007, 5004008, 5004009, 5004010</td><td></td></tr><tr><td>Boc-Lys(Z)-OH / Fmoc-Lys(Boc)-OH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8389 / 47624</td><td></td></tr><tr><td>Thioanisol</td><td>Alfa Aesar</td><td>A14846</td><td></td></tr><tr><td>1,2-Ethanedithiol</td><td>Alfa Aesar</td><td>L12865</td><td></td></tr><tr><td>Ácido trifluorometanosulfónico</td><td>Alfa Aesar</td><td>A10173</td><td></td></tr><tr><td>LiChrosper&reg; 100 RP-18 tapado (5 y micro; m) LiChroCART&reg; 250-4</td><td>Millipore Merck 150838</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oligos de ARN&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Personalizado&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&alfa;-ácido ciano-4-hidroxicinámico (CHCA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>39468</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)</td><td>Alfa Aesar</td><td>J15694</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>17-737E</td><td></td></tr><tr><td>Acrilamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8887</td><td></td></tr><tr><td>N.N'-metilenebisiscrilamida</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>146072</tr><tr><td>Persulfato de amonio (APS)</td><td>Bio-rad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametiletilendiamina (TEMED)</td><td>Bio-rad</td><td>161-0800</td><td></td></tr><tr><td>10X Tampón Tris-Borato-EDTA (TBE), pH 8.3</td><td>1ª Base</td><td>BUF-3010-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol&nbsp;</td><td>Promega&nbsp;</td><td>H5433</td><td></td></tr><tr><td>Bromuro de etidio (10 mg/mL)</td><td>Bio-rad&nbsp;</td><td>161-0433</td><td></td></tr><tr><td>Célula de alta precisión (Quartz Suprasil, 200-2500 nm)</td><td>Hellma Analytics&nbsp;</td><td>105.250-QS</td><td></td></tr></tbody></table>

reconocimiento de secuencia específica y selectivo de rnas de doble cadena sobre arn monocatenario de modifica químicamente los ácidos nucleicos péptidos

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

RNAs están emergiendo como importantes biomarcadores y dianas terapéuticas. Así, hay gran potencial en el desarrollo de sondas químicas y terapéuticas ligandos para el reconocimiento de la estructura y secuencia de ARN. Modificar químicamente péptidos ácidos nucleicos (PNA) oligómeros se han desarrollado recientemente que puede reconocer dúplex RNA de una manera específica de secuencia. PNAs son químicamente estables con un esqueleto de péptidos como neutral. PNAs se pueden sintetizar relativamente fácilmente por el método de síntesis de péptidos de fase sólida manual de Boc-química. PNAs son purificadas por HPLC de fase inversa, seguido de la caracterización del peso molecular por láser asistida por matriz de desorción/ionización-tiempo de vuelo (MALDI-TOF). Técnica de electroforesis (PAGE) de gel de poliacrilamida no desnaturalizantes facilita la proyección de imagen de la formación de triplex, porque cuidadosamente diseñado gratis RNA duplex construye y PNA obligado triplex a menudo Mostrar tasas de migración diferentes. Página no desnaturalizar con bromuro de etidio post coloración es a menudo una técnica fácil e informativa para la caracterización de las afinidades de Unión y especificidades de oligómeros PNA. Por lo general, múltiples horquillas de RNA o dúplex con mutaciones de pares solo puede utilizarse para caracterizar propiedades de enlace de PNA, como vinculante las afinidades y especificidades. 2-aminopurina es un isómero de la adenina (6-aminopurina); la intensidad de fluorescencia de la 2-aminopurina es sensible a los cambios del entorno estructural y es conveniente para la supervisión de formación de triplex con el residuo de la 2-aminopurina incorporado cerca el sitio de unión de la Prefectura Naval Argentina. 2-aminopurina valoración de fluorescencia puede utilizarse también para confirmar la selectividad de unión de PNAs modificados hacia objetivos RNAs de doble hebra (dsARN) en ARN monocatenario (ssRNAs). Experimentos de fusión termal detección de absorbancia UV permiten la medición de la estabilidad térmica de PNA-ARN dúplex y PNA· Tríplex de2 RNA. Aquí, describimos la síntesis y purificación de oligómeros PNA incorporando modifica residuos y describir los métodos bioquímicos y biofísicos para la caracterización del reconocimiento de dúplex RNA por las PNAs modificados.

HPLC de fase inversa permite la purificación de oligómeros PNA. Podemos obtener oligómeros PNA puros con dos rondas de la purificación de HPLC (figura 3). La identidad de los PNAs puede confirmarse por análisis de MALDI-TOF (figura 4).
Página de desnaturalización no es una técnica fácil e informativa para la caracterización de las afinidades de Unión y especificidades de oligómeros PNA. Por lo general utilizamos múltiples horquillas de RNA o dúplex con mutaciones de base par caracterizar propiedades de enlace (figura 5). Los datos de la página de desnaturalización no que se muestra en la figura 5 indican claramente que el Q - y L-modificado PNA puede reconocer una región de dsRNA con un par de C-G (figura 5B, panel inferior) pero no uno sin un par de C-G (figura 5B, superior panel). Este reconocimiento específico y mayor es el T· A-U, L· G-C y Q· C-G PNA· RNA2 base triple (figura 1A, C, D) la formación. Varios PNAs con una o varias mutaciones pueden usarse para demostrar las propiedades de enlace mejorado de un ANP modificado. Hemos demostrado que añadir 2 mM Mg2 + en el tampón de incubación no afecta el atascamiento perceptiblemente31.
Hemos demostrado por titulación de la fluorescencia de la 2-aminopurina que una PNA Q y L modificado se une a una región de dsRNA dirigido (figura 6A, 6 C, 6 D) pero no ssRNA (figura 6B, 6E, 6F). P3 de la Prefectura Naval Argentina se une al dsRNA 2-aminopurina-etiquetados con un valor ded Kde 0,8 ± 0,1 μm. La intensidad de fluorescencia a 370 nm para la 2-aminopurina-labeled ssRNA permanece relativamente constante con la variada concentración de P3, indicando la falta de unión de PNA P3 a la ssRNA.
PNAs con show de residuos (P2 y P3) Q no termo fusión de transiciones (figura 7), no sugiriendo vinculante a la ssRNA. Esto es debido al choque estérico presente en Watson-Crick como par Q-G. En comparación con P1 PNA sin modificar, PNAs P4 y P5 que contiene modificaron L residuos pero sin residuos Q, mostrar disminución de temperatura de fusión para la dúplex RNA-PNA correspondiente debido al choque estérico presente en Watson-Crick como par L-G. Los datos de fusión termal detección de absorbancia UV son consistentes con los datos de valoración de fluorescencia 2-aminopurina, que también muestran que una PNA que contiene residuos de Q y L no se une a ssRNA apreciable (figura 6B, 6E, 6F). Incorpora una base Q es más desestabilizadora que una base de L, como una base Q tiene un choque estérico más importante en la formación de un par de Watson-Crick-como Q-G (figura 1F) comparado con un par de Watson-Crick-como L-G (figura 1E ).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig1v2.jpg"> 
Figura 1 : Estructuras químicas de estructuras estable base triple e inestable par. (A, D) PNA· mayor-surco RNA2 base triples de T· A-U (A), C+· G-C (B), L· G-C (C) y Q· C-G (D). (E, F) Watson-Crick inestable como pares bajos PNA-RNA L-G (E) y Q-G (F). La letra R representa lo azúcar-fosfato de ARN. Enlaces de hidrógeno están indicados por líneas discontinuas negras. Se reproduce la figura de referencia31. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig2v2.jpg"> 
Figura 2 : Estructuras químicas de los monómeros PNA de. Se muestran cuatro monómeros PNA (T, C, L y Q). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig3.jpg"> 
Figura 3 : Estructura química de un oligómero PNA y de purificación por RP-HPLC. (A) estructura química de la secuencia PNA P3. (B, C) Datos de RP-HPLC de crudo PNA P3 (B) y volver a PNA P3 (C). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig4.jpg"> 
Figura 4 : Espectro MALDI-TOF de purificada PNA P3. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig5.jpg"> 
Figura 5 : Horquilla de RNA y las secuencias PNA y caracterización vinculante por página no desnaturalizantes. Horquillas para el pelo (A) RNA (rHP1 y rHP2), PNA P3 y un PNA· RNA2 triplex formado entre PNA P3 y rHP2. Página de desnaturalización no (B) (12%) resultados para rHP1 y atascamiento de rHP2 a PNA P3. El tampón de incubación es 200 mM NaCl, 0.5 mM EDTA 20 mM HEPES, pH 7,5. Las horquillas cargadas de RNA (rHP1 y rHP2) están a 1 μm de 20 μl. Las concentraciones de la Prefectura Naval Argentina en los carriles de izquierda a derecha son 0, 0.2, 0.4, 1, 1.6, 2, 4, 10, 16, 20, 28, y 50 μm. PNA P3 no enlazar a rHP1 (panel superior) pero se une a rHP2 (panel inferior). (C) Kd determinación P3 Unión rHP2. La fracción de la formación de triplex (Y) se enfrenta a la concentración de ANP. La figura es adaptada de la referencia31. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig6.jpg"> 
Figura 6 : Estudio de valoración de fluorescencia de enlace PNA P3a la 2-aminopurina-labeled RNAs. El residuo de la 2-aminopurina es señalado como '2' en la secuencia de RNA. El tampón de incubación es 200 mM NaCl, 0.5 mM EDTA 20 mM HEPES, pH 7,5. (A) un PNA· RNA2 triplex formado entre P3 y un dsRNA etiquetado 2-aminopurina (dsRNA2-2AP). (B) un duplex de PNA-RNA hipotético formado entre P3 y un 2-aminopurina-labeled ssRNA (ssRNA2-2AP). (C, E) Espectros de emisión de fluorescencia para la 2-aminopurina-labeled RNA duplex (1 μm) y ssRNA (1 μm), respectivamente, con variar P3 concentración a pH 7,5. El pico en alrededor de 475 nm es debido a la emisión de fluorescencia débil de la base de la L en la Prefectura Naval Argentina. (D, F) K d determinación basada en las parcelas de la intensidad de fluorescencia de la 2-aminopurina (a 370 nm) de la RNA duplex y ssRNA, respectivamente, frente a concentración de ANP P3. La figura es adaptada de la referencia31. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig7.jpg"> 
Figura 7 : Termo fusión resultados para dúplex RNA-Prefectura Naval Argentina. El tampón de incubación es 200 mM NaCl, 0.5 mM EDTA 20 mM NaH2PO4, pH 7,5. Todas las muestras contienen 5 μm de RNA monocatenario (ssRNA1) y PNA en 130 μl. (A) RNA monocatenario (ssRNA1), PNAs (P1, P2, P3, P4 y P5) y un dúplex de PNA-RNA hipotético formado entre PNA P3 y ssRNA1 en una orientación paralela. El choque estérico está indicado para el Crick de Watson como pares L G Q G. (B) fusión de curvas para diferentes PNAs a ssRNA1. La temperatura de fusión se muestra las curvas con transiciones de fusión. La figura es adaptada de la referencia31.

Divulgamos los protocolos para la síntesis y purificación de oligómeros del péptido de ácido nucleico (PNA) incorporando modificado residuos. Se describen los métodos bioquímicos y biofísicos para la caracterización del reconocimiento de dúplex RNA por las PNAs modificados.

Reconocimiento de secuencia específica y selectivo de RNAs de doble cadena sobre ARN monocatenario de modifica químicamente los ácidos nucleicos péptidos

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

El objetivo general de este artículo de métodos es presentar los protocolos detallados utilizados por nuestro laboratorio para estudiar el reconocimiento molecular de ARN bicatenarios por ácidos nucleicos péptidos químicamente modificados. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología química del ARN, como la detección y el direccionamiento de estructuras de ARN. La principal ventaja de esta técnica es que los principios de diseño pueden aplicarse al direccionamiento de cualquier estructura de dúplex de ARN.La procedura será demostrada por Desiree Toh, una asociada de investigación de mi laboratorio. Para comenzar este procedimiento, agregue cuatro microlitros de una solución de glicerol al 35 % a las muestras de ARN-PNA previamente preparadas y mezcle suavemente. Utilizando una micropipeta y puntas para carga de geles, cargue cuidadosamente 20 microlitros de cada muestra en un gel de poliacrilamida previamente preparado, asegurándose de no introducir burbujas de aire.Corra el gel a un voltaje constante de 250 voltios durante cinco horas. Después de cinco horas, apague la fuente de alimentación y retire la placa de vidrio del soporte del gel. Luego retire la cinta selladora del gel y desarme la placa de vidrio.Retire suavemente el gel de la placa de vidrio y colóquelo en un recipiente lleno con 350 mililitros de agua desionizada. Añada cuidadosamente 35 microlitros de bromuro de etidio al recipiente y colóquelo en el agitador rotatorio a baja velocidad durante 30 minutos. Después de desechar la solución de bromuro de etidio, enjuague el gel con 1,5 a dos litros de agua destilada.Luego, escanee el gel utilizando un equipo de imagen con un láser verde de 532 nanómetros y un filtro de emisión ajustado a 610 nanómetros. Cuantifique las intensidades de las bandas del gel utilizando software gratuito. Transfiera la cantidad adecuada de ARN bicatenario marcado con 2-aminopurina a un tubo limpio de 1,5 mililitros.Luego, concentre las soluciones de ARN utilizando un concentrador al vacío. A continuación, transfiera los volúmenes adecuados del PNA diana para diversas concentraciones desde el stock principal previamente preparado a tubos separados de 1,5 mililitros. Concentre las soluciones de PNA utilizando el concentrador al vacío.Añada 975 microlitros de tampón de incubación al tubo que contiene el ARN seco y mezcle bien para asegurar que todo el ARN se disuelva. Después de centrifugar brevemente la solución de ARN, sométala a hibridación colocando el tubo en un bloque térmico precalentado durante 10 minutos. Una vez finalizado, apague el bloque térmico y deje que la muestra se enfríe a temperatura ambiente.Añada 75 microlitros de ARN a cada uno de los tubos que contienen el PNA seco y mezcle bien. Después de dejar que las muestras reposen a temperatura ambiente durante al menos una hora, incúbelas a cuatro grados Celsius durante la noche. Ahora, transfiera las cantidades adecuadas de ARN monocatenario marcado con 2-aminopurina a tubos separados de 1,5 mililitros.Transfiera los volúmenes adecuados de PNA dirigido para diversas concentraciones desde el stock principal a los tubos respectivos que contienen el ARN de cadena sencilla. Después de secar las muestras, agregue 75 microlitros de tampón de incubación a cada uno de los tubos y mezcle completamente. Somete cada muestra a hibridación colocando cada tubo en un bloque térmico precalentado durante 10 minutos.Después de permitir que las muestras se enfríen a temperatura ambiente, incúbelas a cuatro grados Celsius durante la noche. A continuación, transfiera 70 microlitros de cada muestra a una cubeta cuadrada de un centímetro. Coloque la cubeta en un espectrofotómetro de fluorescencia y mida la emisión en el rango de longitud de onda de 330 a 550 nanómetros.Una vez finalizada la medición, retire el tampón de la cubeta. Enjuague la cubeta con agua destilada y seque con gas nitrógeno. Después de repetir la medición para todas las muestras, grafique la intensidad de fluorescencia frente a la longitud de onda.Transfiera las cantidades apropiadas de ARN de cadena sencilla a tubos separados de 1,5 mililitros. Luego transfiera los volúmenes adecuados de PNA dirigido desde el stock principal a los tubos respectivos que contienen el ARN de cadena sencilla. Después de secar las muestras, agregue 130 microlitros de tampón de incubación a cada uno de los tubos y mezcle bien.Somete cada muestra a un proceso de recocido colocando cada tubo en un bloque térmico precalentado durante 10 minutos. Después de permitir que las muestras se enfríen a temperatura ambiente, incúbalas a cuatro grados Celsius durante la noche. A continuación, transfiere 130 microlitros de cada muestra a una cubeta de ocho microceldas, con una celda conteniendo tampón de incubación.Utilizando un espectrofotómetro UV-Vis, mida la absorbancia de cada muestra a 260 nanómetros. Mida a temperatura creciente desde 15 hasta 95 grados Celsius, seguido de temperatura decreciente desde 95 hasta 15 grados Celsius a una velocidad de rampa de 0,5 grados Celsius por minuto. Los oligómeros de PNA se obtuvieron tras dos purificaciones por HPLC en fase reversa.La identidad de las PNA puede confirmarse mediante análisis MALDI/TOF. Los datos de PAGE no desnaturalizante sugieren que la PNA modificada con Q y L solo puede reconocer la región de ARN de doble cadena con un par C-G. Este reconocimiento específico y mejorado se lleva a cabo mediante la formación de dos tríadas basadas en PNA-ARN: T-A-U-L-G-C y Q-C-G.Un estudio de titulación de fluorescencia de 2-aminopurina mostró que una PNA modificada con Q y L se une a un ARN bicatenario diana, pero no al ARN monocatenario. Las PNA que contienen residuos Q no muestran transiciones de fusión térmica, lo que sugiere ausencia de unión al ARN monocatenario debido al choque estérico en el par Q-G tipo Watson-Crick. En comparación con la PNA no modificada P1, las PNA P4 y P5 que contienen residuos L presentan una temperatura de fusión más baja para los dúplex correspondientes de ARN-PNA debido al choque estérico en el par L-G tipo Watson-Crick.Los datos de fusión térmica detectados por absorbancia UV son consistentes con los datos de titulación de fluorescencia de 2-aminopurina, que también muestran que un PNA que contiene residuos Q y L no se une fuertemente al ARN de cadena sencilla. La incorporación de una base Q es más desestabilizadora que una base L, ya que una base Q presenta un choque estérico más significativo en la formación de un par Q-G similar al de Watson-Crick. Una vez dominados, los diversos experimentos pueden realizarse en una semana si se llevan a cabo adecuadamente.Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la detección y el direccionamiento de estructuras de ARN en células, con el fin de responder preguntas adicionales, como si podemos detectar estructuras de ARN y regular las funciones del ARN mediante el uso de PNAs que se unen al ARN bicatenario. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología del ARN y las enfermedades exploraran el desarrollo de terapias dirigidas a la estructura del ARN.

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Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

De alto rendimiento selectiva 2 'acilación hidroxilo analizados por extensión del cebador (FORMA) utiliza un software de predicción de estructura secundaria de producto químico nuevo sondeo de la tecnología, la transcripción inversa, electroforesis capilar y para determinar las estructuras de ARN de varios cientos a varios miles de nucleótidos en una sola resolución de nucleótidos.

ARN de predicción de estructura secundaria Utilizando SHAPE de alto rendimiento

Las interacciones ARN-proteína se encuentran en el corazón de muchos procesos celulares. Aquí, describimos un método in vivo para aislar ARN específico e identificar nuevas proteínas que están asociadas con él. Esto podría arrojar nueva luz sobre cómo se regulan los ARN en la célula.

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Se describe un protocolo para identificar proteínas RNA-que atan y mapa de sus regiones de unión de ARN en células vivas usando photocrosslinking mediada por la UV y espectrometría de masas.

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Este método de pull-down del RNA permite identificar los objetivos de RNA de un ARN largo no codificante (lncRNA). Basado en la hibridación de caseros, diseñadas anti-sentido oligonucleótidos sondas de ADN específicas para este lncRNA en un tejido adecuadamente fijo o línea celular, permite la captura de todos los objetivos de la lncRNA RNA eficientemente.

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RNA de doble hebra producido durante la replicación de virus de ARN puede ser reconocido por los receptores de reconocimiento de patrón para inducir una respuesta inmune innata. Virus de ARN de sentido negativo, la interacción entre el bajo nivel dsARN y PRRs sigue siendo confusa. Hemos desarrollado un método de microscopia confocal para visualizar arenavirus dsARN y PRR en células individuales.

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La especificidad de la secuencia es fundamental para la regulación genética. Las proteínas reguladoras que reconocen secuencias específicas son importantes para la regulación genética. Definir sitios de unión funcional para tales proteínas es un problema biológico desafiante. Aquí se describe un enfoque iterativo para la identificación de un sitio de unión para una proteína de unión al ARN y es aplicable a todas las proteínas de unión al ARN.

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MALDI-TOF se utilizó para caracterizar fragmentos obtenidos de la reactividad entre el ARN oxidado y la exoribonucleasa Xrn-1. El presente protocolo describe una metodología que puede aplicarse a otros procesos que involucran ARN y/o ADN.

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Los oligonucleótidos 5′-trifosfatos son componentes ubicuos en vías biológicas esenciales y han visto un uso creciente en aplicaciones biotecnológicas. Aquí, describimos técnicas para la síntesis y purificación rutinaria de oligonucleótidos 5′-trifosfatos, a partir de oligonucleótidos preparados por técnicas de síntesis automatizadas estándar.

Trifosforilación química de oligonucleótidos

El protocolo actual demuestra el uso de un ensayo de amplificación exponencial rápido, de 3 etapas, basado en aptámeros para detectar objetivos. La preparación de la muestra, la amplificación de la señal y el desarrollo del color están cubiertos para implementar este sistema para reconocer la presencia de teofilina sobre la de cafeína.

Detección de objetivos basada en aptámeros facilitada por una reacción de amplificación exponencial isotérmica G-quadruplex de 3 etapas

Las nanomáquinas basadas en DNAzyme se pueden utilizar para la detección altamente selectiva y sensible de ácidos nucleicos. Este artículo describe un protocolo detallado para el diseño de nanomáquinas basadas en DNAzyme con un núcleo 10-23 utilizando software libre y su aplicación en la detección de un fragmento de virus de Epstein-Barr como ejemplo.

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Aprende a estudiar el reconocimiento molecular de ARN de doble cadena mediante ácidos nucleicos péptidos modificados químicamente. Este protocolo utiliza electroforesis y espectrofotometría de fluorescencia para caracterizar interacciones específicas.

Reconocimiento de secuencia específica y selectivo de RNAs de doble cadena sobre ARN monocatenario de modifica químicamente los ácidos nucleicos péptidos (Video) | JoVE Journal

Reconocimiento de secuencia específica y selectivo de RNAs de doble cadena sobre ARN monocatenario de modifica químicamente los ácidos nucleicos péptidos

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