Protocolo mejorado para microdisección láser de islotes pancreáticos humanos a partir de muestras quirúrgicas
6 de enero de 2013
Microdisección por láser es una técnica que permite la recuperación de células seleccionados a partir de cantidades mínimas de parénquima. Aquí se describe un protocolo para la obtención islotes pancreáticos humanos a partir de especímenes quirúrgicos para su uso para transcriptomic estudios. Nuestro protocolo mejora la autofluorescencia intrínseca de las células beta humanas, lo que facilita su recogida.
Hola, Mi nombre es Dorte del Instituto Thea Hands de la Universidad de Tecnología, Reen Laser. La microdisección es una técnica que permite obtener una población celular especial a partir de cantidades muy pequeñas de tumor parental. Las células disecadas se pueden utilizar para estudios transcriptómicos y proteómicos, evaluación de ADN o análisis cromosómico.
Aquí proporcionamos nuestro protocolo para la adquisición de metacélulas pancreáticas humanas a partir de muestras quirúrgicas para su uso en estudios transcriptómicos. Corta el tejido pancreático en pedazos pequeños. Coloque una pieza en el centro de un molde criogénico y cúbrala con compuesto de inclusión refrigerado.
Congele el tejido inmediatamente con dos materiales refrigerados Bután y almacene a menos 80 grados centígrados. Seccionar la etiqueta de 40 portaobjetos adhesivos y preenfriarlos dentro de la Cámara Crist. Fije el tejido congelado en el portamuestras con el compuesto OCT después de recortar el bloque criogénico.
Corta 40 secciones de 10 micrómetros de grosor. Transfiera una sección a un portaobjetos tocando la parte posterior del portaobjetos con el dedo para calentar solo la posición para colocar la sección en él. Pruebe las secciones dos o tres minutos dentro del criogénico muerto y guárdelas después a menos 80 grados centígrados, prepare los reactivos de Ation y enfríe todos los líquidos excepto la selina en hielo. Esto aumentará la autofluorescencia intrínseca de las células de las mascotas antes de la microdisección.
Se reducirán cuatro secciones cada vez. Maneja dos secciones a la vez. Fíjelos primero en etanol al 70% durante 30 segundos.
A continuación, lava las secciones con cinco o seis inmersiones rápidas. En lo sucesivo, agua tratada con CPD. Deshidratar el tejido un minuto en etanol al 100% y repetir este paso, incubar los portaobjetos en selina durante cuatro minutos.
Mientras tanto, comienza la deshidratación de otro par de secciones. Finalmente, seque los portaobjetos al aire durante tres a cinco minutos en la oscuridad. Proteja el tejido de la humedad y la autofluorescencia del blanqueo colocando los dos portaobjetos espalda con espalda en un tubo de aluminio de 50 ml Antes de la sección, limpie el microscopio con los ARN y sujete la tapa adhesiva en el robot Mover.
Inserte la corredera en la platina y mueva la tapa cerca de la sección sin tocarla. Localice los ojales identificando las mejores áreas celulares autofluorescentes. La autofluorescencia intrínseca de las células humanas mejores aparece en amarillo en la configuración, mientras que los conductos pancreáticos muestran una autofluorescencia verde brillante.
Seleccione las mejores áreas de celda con la herramienta de selección de mano libre y microdiseccionelas iniciando el láser. Diseccione los ojales de cuatro secciones criogénicas reducidas en una tapa adhesiva en un plazo de 40 a 60 minutos. Si lo desea, revise el tejido capturado moviendo la tapa hasta el punto de control del microscopio.
Retire la tapa del robot motor y colóquelo. Tampón de extracción de 10 microlitros en la tapa de la tapa para la disrupción celular. Incuba el sombrero boca abajo a 42 grados centígrados durante 30 minutos.
Gire el lisado, etiquete el tubo y guárdelo a menos 80 grados Celsius disminuidos hasta que se pueda producir la extracción de ARN. Realice el láser de Ation, la microdisección y la lisis con las 40 criodisecciones. A continuación, unir los 10 lisados y continuar con el aislamiento del ARN utilizando el kit de aislamiento de ARN PU de UR siguiendo el protocolo suministrado para obtener 11 microlitros de ARN.
En general, no encontramos una relación directa entre la cantidad de tejido de microdisección y el rendimiento de ARN. Las diferencias en el intervalo de tiempo entre la recolección por parte de los cirujanos y la congelación de la muestra pancreática después de su examen por el patólogo, podrían explicar en parte la calidad térmica y la cantidad de ARN recuperado. Otros factores clave a tener en cuenta son la energía láser aplicada para la microdisección con la energía más baja, utilizando la mayor integridad del ARN, así como el enfoque del láser y la distancia de los puntos de apuntamiento del cortador de presión láser. Además, la cantidad de ARN se puede optimizar manteniendo la distancia entre la tapa adhesiva y la tan baja como sea posible.
Evite la pérdida de tejido microdiseccionado durante el proceso de captura, siempre que se disponga del microscopio de microdisección láser. Este procedimiento podría implementarse en cualquier institución de investigación que realice ectomías parciales del páncreas, aumentando así el acceso al material del párpado humano tanto de sujetos diabéticos como no diabéticos.
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Resumen
Este artículo presenta un protocolo para la microdisección láser con el fin de recuperar islotes pancreáticos humanos a partir de especímenes quirúrgicos. La técnica mejora la recolección de células beta para estudios transcriptómicos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Transcriptómica
Antecedentes
- La microdisección láser permite el aislamiento de poblaciones celulares específicas.
- Es particularmente útil para muestras de tejido pequeñas.
- La técnica puede aplicarse a diversos estudios, incluidos análisis transcriptómicos y proteómicos.
- Mejorar la autofluorescencia facilita la recolección de células diana.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un protocolo detallado para la obtención de islotes pancreáticos humanos.
- Facilitar el estudio de las células beta en investigaciones transcriptómicas.
- Mejorar la eficiencia en la recolección de células a partir de especímenes quirúrgicos.
Métodos Utilizados
- Técnica de microdisección láser aplicada al tejido pancreático.
- Preparación de muestras de tejido mediante corte en pequeños fragmentos.
- Inclusión del tejido en un compuesto enfriado para una microdisección óptima.
- Recopilación de células beta para análisis posteriores.
Resultados principales
- Aislamiento exitoso de islotes pancreáticos humanos.
- Se observó una autofluorescencia mejorada de las células beta.
- El protocolo demostró efectividad para estudios transcriptómicos.
- Facilitó la recolección de poblaciones celulares específicas a partir de muestras pequeñas.
Conclusiones
- El protocolo mejora la recuperación de islotes pancreáticos humanos.
- La microdisección láser es una herramienta valiosa para el análisis celular.
- Los métodos mejorados pueden conducir a mejores conocimientos en la investigación transcriptómica.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La microdisección láser permite el aislamiento preciso de células beta pancreáticas humanas a partir de muestras quirúrgicas limitadas, abordando un cuello de botella crítico en los estudios transcriptómicos de tejidos relacionados con la diabetes. Al realzar la autofluorescencia intrínseca mediante el procesamiento con reactivos fríos en hielo, el protocolo reduce el tiempo de manipulación del tejido y mejora la preservación del ARN, apoyando directamente la validación de dianas en la investigación de enfermedades metabólicas. Este enfoque fortalece la desviación mecanicista al proporcionar poblaciones celulares purificadas para aplicaciones ómicas posteriores en flujos de trabajo de descubrimiento temprano.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante el aislamiento de poblaciones puras de células beta para el análisis de vías en modelos de diabetes tipo 2.
- Valor operativo: Facilita la reducción del riesgo biológico mediante la identificación rápida y precisa de células diana a través de la autofluorescencia mejorada, reduciendo los falsos positivos en la selección de dianas.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados para la estandarización de ensayos al proporcionar entradas de ARN consistentes y de alta integridad a partir de islotes microdiseccionados.
- Valor operativo: Apoya salidas cuantitativas reproducibles, esenciales para la preparación de cribados y la reutilización de plataformas en los flujos de trabajo de descubrimiento de biomarcadores.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Mantiene la relevancia para la enfermedad al permitir el análisis transcriptómico de islotes pancreáticos humanos directamente relacionados con la fisiopatología de la diabetes.
- Valor operativo: Asegura la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al proporcionar poblaciones celulares definidas para estudios mecanicistas de seguimiento.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento al permitir la prueba de hipótesis en biología temprana, apoyar el desarrollo de ensayos mediante entradas estandarizadas e informar decisiones traslacionales mediante perfiles moleculares cuantitativos.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la aclaración de vías y la reducción del riesgo biológico mediante el aislamiento de células beta para la validación funcional de dianas en modelos de enfermedades metabólicas.
- Cribado: Proporciona muestras listas para ensayos con rendimientos reproductibles de ARN, esenciales para evaluar los efectos de compuestos sobre islotes aislados.
- Analítica: Genera lecturas transcriptómicas cuantitativas que permiten comparar estados diabéticos y no diabéticos para orientar la identificación de compuestos líderes.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica al proporcionar muestras relevantes para humanos que vinculan hallazgos in vitro con mecanismos de enfermedad.
- Reutilización Empresarial: Establece una capacidad reutilizable para acceder a islotes humanos primarios en múltiples proyectos, reduciendo la dependencia de fuentes donantes variables.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva al reducir la ambigüedad mecanicista en las vías de señalización específicas de las células beta.
- Valor operativo: Mejora la estandarización y la reproducibilidad mediante un procesamiento controlado de tejidos y parámetros definidos de disección.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al permitir una evaluación temprana del acoplamiento al blanco en células relevantes para el ser humano, reduciendo el riesgo biológico en fases tardías.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de blancos para la diabetes basándose en perfiles transcriptómicos validados de islotes humanos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en histología, crioseccionado e instrumentación de microdisección láser.
- Depende del acceso a un sistema PALM MicroBeam o plataforma de microdisección láser equivalente con capacidad AutoLPC.
- Necesita protocolos estandarizados de manejo de reactivos para mantener la autofluorescencia y la integridad del ARN entre diferentes usuarios.
- Implica consideraciones de adaptación según la calidad variable de las muestras pancreáticas y el tiempo isquémico entre la extracción y la congelación.
- Limitado por las restricciones en el rendimiento de ARN, lo que requiere la agrupación de múltiples muestras microdiseccionadas para obtener una cantidad suficiente de entrada para los kits posteriores.
