Protocolo mejorado para microdisección láser de islotes pancreáticos humanos a partir de muestras quirúrgicas

Hola, Mi nombre es Dorte del Instituto Thea Hands de la Universidad de Tecnología, Reen Laser. La microdisección es una técnica que permite obtener una población celular especial a partir de cantidades muy pequeñas de tumor parental. Las células disecadas se pueden utilizar para estudios transcriptómicos y proteómicos, evaluación de ADN o análisis cromosómico.

Aquí proporcionamos nuestro protocolo para la adquisición de metacélulas pancreáticas humanas a partir de muestras quirúrgicas para su uso en estudios transcriptómicos. Corta el tejido pancreático en pedazos pequeños. Coloque una pieza en el centro de un molde criogénico y cúbrala con compuesto de inclusión refrigerado.

Congele el tejido inmediatamente con dos materiales refrigerados Bután y almacene a menos 80 grados centígrados. Seccionar la etiqueta de 40 portaobjetos adhesivos y preenfriarlos dentro de la Cámara Crist. Fije el tejido congelado en el portamuestras con el compuesto OCT después de recortar el bloque criogénico.

Corta 40 secciones de 10 micrómetros de grosor. Transfiera una sección a un portaobjetos tocando la parte posterior del portaobjetos con el dedo para calentar solo la posición para colocar la sección en él. Pruebe las secciones dos o tres minutos dentro del criogénico muerto y guárdelas después a menos 80 grados centígrados, prepare los reactivos de Ation y enfríe todos los líquidos excepto la selina en hielo. Esto aumentará la autofluorescencia intrínseca de las células de las mascotas antes de la microdisección.

Se reducirán cuatro secciones cada vez. Maneja dos secciones a la vez. Fíjelos primero en etanol al 70% durante 30 segundos.

A continuación, lava las secciones con cinco o seis inmersiones rápidas. En lo sucesivo, agua tratada con CPD. Deshidratar el tejido un minuto en etanol al 100% y repetir este paso, incubar los portaobjetos en selina durante cuatro minutos.

Mientras tanto, comienza la deshidratación de otro par de secciones. Finalmente, seque los portaobjetos al aire durante tres a cinco minutos en la oscuridad. Proteja el tejido de la humedad y la autofluorescencia del blanqueo colocando los dos portaobjetos espalda con espalda en un tubo de aluminio de 50 ml Antes de la sección, limpie el microscopio con los ARN y sujete la tapa adhesiva en el robot Mover.

Inserte la corredera en la platina y mueva la tapa cerca de la sección sin tocarla. Localice los ojales identificando las mejores áreas celulares autofluorescentes. La autofluorescencia intrínseca de las células humanas mejores aparece en amarillo en la configuración, mientras que los conductos pancreáticos muestran una autofluorescencia verde brillante.

Seleccione las mejores áreas de celda con la herramienta de selección de mano libre y microdiseccionelas iniciando el láser. Diseccione los ojales de cuatro secciones criogénicas reducidas en una tapa adhesiva en un plazo de 40 a 60 minutos. Si lo desea, revise el tejido capturado moviendo la tapa hasta el punto de control del microscopio.

Retire la tapa del robot motor y colóquelo. Tampón de extracción de 10 microlitros en la tapa de la tapa para la disrupción celular. Incuba el sombrero boca abajo a 42 grados centígrados durante 30 minutos.

Gire el lisado, etiquete el tubo y guárdelo a menos 80 grados Celsius disminuidos hasta que se pueda producir la extracción de ARN. Realice el láser de Ation, la microdisección y la lisis con las 40 criodisecciones. A continuación, unir los 10 lisados y continuar con el aislamiento del ARN utilizando el kit de aislamiento de ARN PU de UR siguiendo el protocolo suministrado para obtener 11 microlitros de ARN.

En general, no encontramos una relación directa entre la cantidad de tejido de microdisección y el rendimiento de ARN. Las diferencias en el intervalo de tiempo entre la recolección por parte de los cirujanos y la congelación de la muestra pancreática después de su examen por el patólogo, podrían explicar en parte la calidad térmica y la cantidad de ARN recuperado. Otros factores clave a tener en cuenta son la energía láser aplicada para la microdisección con la energía más baja, utilizando la mayor integridad del ARN, así como el enfoque del láser y la distancia de los puntos de apuntamiento del cortador de presión láser. Además, la cantidad de ARN se puede optimizar manteniendo la distancia entre la tapa adhesiva y la tan baja como sea posible.

Evite la pérdida de tejido microdiseccionado durante el proceso de captura, siempre que se disponga del microscopio de microdisección láser. Este procedimiento podría implementarse en cualquier institución de investigación que realice ectomías parciales del páncreas, aumentando así el acceso al material del párpado humano tanto de sujetos diabéticos como no diabéticos.