Protocolo mejorado para microdisección láser de islotes pancreáticos humanos a partir de muestras quirúrgicas
January 6th, 2013
Microdisección por láser es una técnica que permite la recuperación de células seleccionados a partir de cantidades mínimas de parénquima. Aquí se describe un protocolo para la obtención islotes pancreáticos humanos a partir de especímenes quirúrgicos para su uso para transcriptomic estudios. Nuestro protocolo mejora la autofluorescencia intrínseca de las células beta humanas, lo que facilita su recogida.
Hola, Mi nombre es Dorte del Instituto Thea Hands de la Universidad de Tecnología, Reen Laser. La microdisección es una técnica que permite obtener una población celular especial a partir de cantidades muy pequeñas de tumor parental. Las células disecadas se pueden utilizar para estudios transcriptómicos y proteómicos, evaluación de ADN o análisis cromosómico.
Aquí proporcionamos nuestro protocolo para la adquisición de metacélulas pancreáticas humanas a partir de muestras quirúrgicas para su uso en estudios transcriptómicos. Corta el tejido pancreático en pedazos pequeños. Coloque una pieza en el centro de un molde criogénico y cúbrala con compuesto de inclusión refrigerado.
Congele el tejido inmediatamente con dos materiales refrigerados Bután y almacene a menos 80 grados centígrados. Seccionar la etiqueta de 40 portaobjetos adhesivos y preenfriarlos dentro de la Cámara Crist. Fije el tejido congelado en el portamuestras con el compuesto OCT después de recortar el bloque criogénico.
Corta 40 secciones de 10 micrómetros de grosor. Transfiera una sección a un portaobjetos tocando la parte posterior del portaobjetos con el dedo para calentar solo la posición para colocar la sección en él. Pruebe las secciones dos o tres minutos dentro del criogénico muerto y guárdelas después a menos 80 grados centígrados, prepare los reactivos de Ation y enfríe todos los líquidos excepto la selina en hielo. Esto aumentará la autofluorescencia intrínseca de las células de las mascotas antes de la microdisección.
Se reducirán cuatro secciones cada vez. Maneja dos secciones a la vez. Fíjelos primero en etanol al 70% durante 30 segundos.
A continuación, lava las secciones con cinco o seis inmersiones rápidas. En lo sucesivo, agua tratada con CPD. Deshidratar el tejido un minuto en etanol al 100% y repetir este paso, incubar los portaobjetos en selina durante cuatro minutos.
Mientras tanto, comienza la deshidratación de otro par de secciones. Finalmente, seque los portaobjetos al aire durante tres a cinco minutos en la oscuridad. Proteja el tejido de la humedad y la autofluorescencia del blanqueo colocando los dos portaobjetos espalda con espalda en un tubo de aluminio de 50 ml Antes de la sección, limpie el microscopio con los ARN y sujete la tapa adhesiva en el robot Mover.
Inserte la corredera en la platina y mueva la tapa cerca de la sección sin tocarla. Localice los ojales identificando las mejores áreas celulares autofluorescentes. La autofluorescencia intrínseca de las células humanas mejores aparece en amarillo en la configuración, mientras que los conductos pancreáticos muestran una autofluorescencia verde brillante.
Seleccione las mejores áreas de celda con la herramienta de selección de mano libre y microdiseccionelas iniciando el láser. Diseccione los ojales de cuatro secciones criogénicas reducidas en una tapa adhesiva en un plazo de 40 a 60 minutos. Si lo desea, revise el tejido capturado moviendo la tapa hasta el punto de control del microscopio.
Retire la tapa del robot motor y colóquelo. Tampón de extracción de 10 microlitros en la tapa de la tapa para la disrupción celular. Incuba el sombrero boca abajo a 42 grados centígrados durante 30 minutos.
Gire el lisado, etiquete el tubo y guárdelo a menos 80 grados Celsius disminuidos hasta que se pueda producir la extracción de ARN. Realice el láser de Ation, la microdisección y la lisis con las 40 criodisecciones. A continuación, unir los 10 lisados y continuar con el aislamiento del ARN utilizando el kit de aislamiento de ARN PU de UR siguiendo el protocolo suministrado para obtener 11 microlitros de ARN.
En general, no encontramos una relación directa entre la cantidad de tejido de microdisección y el rendimiento de ARN. Las diferencias en el intervalo de tiempo entre la recolección por parte de los cirujanos y la congelación de la muestra pancreática después de su examen por el patólogo, podrían explicar en parte la calidad térmica y la cantidad de ARN recuperado. Otros factores clave a tener en cuenta son la energía láser aplicada para la microdisección con la energía más baja, utilizando la mayor integridad del ARN, así como el enfoque del láser y la distancia de los puntos de apuntamiento del cortador de presión láser. Además, la cantidad de ARN se puede optimizar manteniendo la distancia entre la tapa adhesiva y la tan baja como sea posible.
Evite la pérdida de tejido microdiseccionado durante el proceso de captura, siempre que se disponga del microscopio de microdisección láser. Este procedimiento podría implementarse en cualquier institución de investigación que realice ectomías parciales del páncreas, aumentando así el acceso al material del párpado humano tanto de sujetos diabéticos como no diabéticos.
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Visión general
Este artículo presenta un protocolo para la microdisección con láser para recuperar islotes pancreáticos humanos de especímenes quirúrgicos. La técnica mejora la recolección de células beta para estudios transcriptómicos.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Transcriptómica
Antecedentes
- La microdisección con láser permite el aislamiento de poblaciones celulares específicas.
- Es particularmente útil para muestras de tejido pequeñas.
- La técnica se puede aplicar a varios estudios, incluyendo análisis transcriptómicos y proteómicos.
- Mejorar la autofluorescencia ayuda en la recolección de células específicas.
Propósito del estudio
- Proporcionar un protocolo detallado para obtener islotes pancreáticos humanos.
- Facilitar el estudio de células beta en investigaciones transcriptómicas.
- Mejorar la eficiencia de la recolección de células de especímenes quirúrgicos.
Métodos utilizados
- Técnica de microdisección con láser aplicada al tejido pancreático.
- Preparación de muestras de tejido cortando en pequeños trozos.
- Incrustación de tejido en un compuesto enfriado para una disección óptima.
- Recolección de células beta para análisis adicionales.
Principales resultados
- Aislamiento exitoso de islotes pancreáticos humanos.
- Mejora de la autofluorescencia de las células beta observada.
- El protocolo demostró su efectividad para estudios transcriptómicos.
- Facilitó la recolección de poblaciones celulares específicas de muestras pequeñas.
Conclusiones
- El protocolo mejora la recuperación de islotes pancreáticos humanos.
- La microdisección con láser es una herramienta valiosa para el análisis celular.
- Los métodos mejorados pueden conducir a mejores conocimientos en investigación transcriptómica.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Laser microdissection enables precise isolation of human pancreatic beta cells from limited surgical specimens, addressing a critical bottleneck in transcriptomic studies of diabetes-relevant tissues. By enhancing intrinsic autofluorescence through ice-cold reagent processing, the protocol reduces tissue handling time and improves RNA preservation, directly supporting target validation in metabolic disease research. This approach strengthens mechanistic de-risking by providing purified cell populations for downstream omics applications in early discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating pure beta cell populations for pathway analysis in type 2 diabetes models.
- Operational Value: Facilitates biological de-risking through rapid, accurate identification of target cells via enhanced autofluorescence, reducing false positives in target selection.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for assay standardization by providing consistent, high-integrity RNA inputs from microdissected islets.
- Operational Value: Supports reproducible quantitative outputs essential for screening readiness and platform reuse in biomarker discovery pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance by enabling transcriptomic analysis of human pancreatic islets directly linked to diabetic pathophysiology.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery through preclinical validation by supplying defined cell populations for mechanistic follow-up studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by enabling hypothesis testing in early biology, supporting assay development through standardized inputs, and informing translational decisions via quantitative molecular profiling.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking by isolating beta cells for functional target validation in metabolic disease models.
- Screening: Delivers assay-ready samples with reproducible RNA yields, critical for screening compound effects on isolated islets.
- Analytics: Generates quantitative transcriptomic readouts that allow comparison between diabetic and non-diabetic states to inform lead identification.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing human-relevant samples that bridge in vitro findings to disease mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for accessing primary human islets across multiple projects, reducing dependency on variable donor sources.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in beta cell-specific signaling pathways.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through controlled tissue processing and defined dissection parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of target engagement in human-relevant cells, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of diabetes targets based on validated human islet transcriptomic profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in histology, cryosectioning, and laser microdissection instrumentation.
- Dependent on access to a PALM MicroBeam system or equivalent LMD platform with AutoLPC capability.
- Necessitates standardized reagent handling protocols to maintain autofluorescence and RNA integrity across users.
- Involves adaptation considerations for varying pancreatic specimen quality and ischemic time between harvest and freezing.
- Limited by RNA yield constraints, necessitating pooling of multiple microdissected samples for sufficient input to downstream kits.
