Caracterización dinámica de microbioma-citometría de flujo basado en flujos de trabajo de cultivos puros de las comunidades naturales

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en ecología microbiana y biotecnología, por ejemplo, qué conceptos ecológicos impulsan un ecosistema dado. La principal ventaja de esta técnica es que se puede utilizar para cerrar la dinámica rápida del microbioma con el régimen de muestreo de intervalo corto, sin dejar de ser muy rentable. Este método se puede utilizar para obtener información sobre las comunidades microbianas biotecnológicas y naturales y también sobre los microbiomas animales y humanos para los estados nutricionales y de salud.

La demostración del procedimiento estará a cargo de Florian Schattenberg, técnico y operador de SediMeter en nuestro laboratorio. Para secar una muestra comunitaria de biogás, utilice una punta de pipeta modificada de un mililitro para transferir 200 microlitros del digestato viscoso a un tubo de dos mililitros que contenga 1,7 mililitros de PBS. Después de mezclarlos bien, coloque los tubos en un baño ultrasónico durante un minuto para disolver los agregados de células grandes y unir las células que se adhieran a los residuos de células vegetales.

Después de la sonicación, mezcle bien la muestra y filtre las células a través de un colador de malla de poros de 50 micrómetros en un tubo de plástico de 2 mililitros. Divida el filtrado en cuatro alícuotas de 400 microlitros y centrifugue las alícuotas dos veces, desechando el sobrenadante por completo en ambas ocasiones para deshidratar mecánicamente la muestra de microbios lo más completamente posible. A continuación, seque la muestra en una centrífuga de vacío calentada para crear un pellet estable y almacene el pellet a cuatro grados centígrados protegido de la luz.

Para la estabilización y fijación de muestras de lodo activado, centrifugar cuatro mililitros de las celdas y volver a suspender el pellet en cuatro mililitros de formaldehído al dos por ciento en PBS. Después de 30 minutos a temperatura ambiente, centrifugar la muestra de celda estabilizada y fijar el pellet en cuatro mililitros de etanol al 70% para un almacenamiento de menos 20 grados centígrados. Mezcle y transfiera 0,6 mililitros de la suspensión de celda fija a un tubo de vidrio que contenga 1,4 mililitros de PBS y, después de una mezcla completa, sonique durante 10 minutos como se demuestra.

Al final de la sonicación, recoja las células por centrifugación y vuelva a suspender el pellet en dos mililitros de PBS fresco. Después de una mezcla minuciosa, sonique las celdas como se acaba de demostrar durante cinco minutos y ajuste el OD 700 nanómetro a 035 con PBS nuevo. Recoja las células por centrifugación y vuelva a suspender el pellet en un mililitro de tampón de permeabablización que contenga 0,11 molar de ácido cítrico y 4,1 milimolares 20, con una mezcla completa, para una incubación de 20 minutos a temperatura ambiente.

A continuación, recoja las células por centrifugación y vuelva a suspender completamente el pellet en dos mililitros de solución de tinción que contenga 0,68 micromolares de DAPI, durante una incubación de al menos 60 minutos a temperatura ambiente, protegida de la luz. Para la calibración de cordones, cargue la mezcla de perlas para la calibración lineal en el citómetro de flujo y mida los cordones continuamente mientras manipula las posiciones de la boquilla y la óptica láser para precalibrar el instrumento en el rango lineal. Cuando los picos de cuentas se puedan ajustar en una plantilla de calibración preestablecida, cambie al modo de registro y cargue una muestra de cuentas de calibración logarítmica.

Ajuste los picos logarítmicos del cordón a su plantilla de calibración preestablecida para ajustar el hardware del instrumento, y utilice el ajuste de ganancia del tubo fotomultiplicador para realizar los ajustes finales necesarios en la posición del cordón. El aspecto más crítico de este procedimiento es mantener mediciones consistentes para permitir la comparabilidad entre experimentos. Por lo tanto, la calibración diaria del citómetro y el uso de perlas en los párpados biológicos son vitales para el éxito de la diálisis lenta del microbioma citromático. Cuando las celdas estén listas, mezcle y filtre las muestras y agregue la mezcla de perlas logarítmicas a las celdas.

Ahora mezcle y cargue la muestra en el citómetro y cree una puerta para incluir las células teñidas y excluir el ruido y las perlas. A continuación, analice el conjunto de muestras consecutivamente a una velocidad máxima de 3.000 eventos por segundo hasta que se detecten 250.000 células dentro de la puerta de la celda. Para analizar los datos de citometría de flujo, desarrolle una plantilla de puerta maestra para su uso en todas las muestras.

Comience cargando los archivos estándar de citometría de flujo en un programa de análisis de citometría de flujo adecuado y procese las muestras sucesivamente. Cargue las muestras, haga doble clic en una medición y seleccione los parámetros de los ejes X e Y en sus respectivos menús desplegables para abrir un gráfico de fluorescencia de dispersión directa frente a DAPI. Utilice la herramienta de dibujo de polígonos para reproducir la puerta de celda de medición generada anteriormente para excluir las cuentas y el ruido, y asigne un nombre a la puerta en consecuencia.

Arrastre la entrada de la puerta de celda a la lista de grupos de todas las muestras y haga doble clic en la puerta de celda para mostrar selectivamente solo los eventos de celda. Defina las subcomunidades prevalentes en una muestra con la herramienta de puerta elíptica y agrupe. A continuación, agregue asignaciones de subcomunidades adicionales y muestras posteriores hasta que la plantilla de puerta maestra se ajuste a todas las muestras.

Controle la plantilla de la puerta maestra con el método de escaneo de dispersión lateral para resolver la agrupación de subcomunidades cerca unas de otras. A continuación, agregue todas las subcomunidades al editor de tablas y establezca la estadística de salida en la frecuencia del elemento principal. Utilice el editor de tablas para exportar las abundancias relativas de la subcomunidad a un software de hoja de cálculo adecuado y adapte el formato de los datos de acuerdo con las directrices del manual de la barra lateral.

A continuación, para visualizar la dinámica y las correlaciones de la subcomunidad, instale y cargue el paquete R, y cargue y normalice el archivo txt. Los gráficos de fluorescencia de dispersión directa frente a DAPI revelan los estados del ciclo celular de los cultivos de cepas puras en diferentes puntos de un cultivo por lotes. El uso de una plantilla de puerta maestra permite cuantificar la proporción de células con uno, dos o varios cromosomas, revelando, por ejemplo, la capacidad de este microbio representativo para replicar sus cromosomas más rápido que su tiempo de generación.

Al investigar comunidades microbianas complejas a lo largo del tiempo, el ritmo y la importancia del cambio de la comunidad se pueden visualizar fácilmente con una secuencia de diagrama de puntos. Las subcomunidades dominantes en las diferentes etapas del experimento se pueden identificar claramente utilizando la herramienta de código de barras citométrico. La combinación de estos datos con la distribución de frecuencias de las abundancias relativas de la subcomunidad permite la selección de puertas que demuestran cambios significativos en la abundancia en puntos clave del tiempo.

La visualización de estos datos en un gráfico de escala multidimensional no métrico puede facilitar una comprensión más profunda de la dinámica de la comunidad. Las comunidades de biogás pueden enfrentarse a heterogeneidades espaciales debido a las limitaciones de agitación. Los ejemplares puntos de muestreo de la comunidad de biogás exhiben poca heterogeneidad espacial, pero pronunciada en el tiempo.

Las fuertes correlaciones positivas o negativas con los parámetros abióticos, como los ajustadores del producto, pueden ayudar a comprender y optimizar los ecosistemas y los procesos biotecnológicos. Además, facilitan la identificación de puertas de especial interés para su posterior clasificación y análisis. Al establecer este procedimiento, se recomienda evaluar diferentes procedimientos de fijación y tinción para evaluar su rendimiento y estabilidad para cada nuevo conjunto de muestras.

Después de la clasificación, se pueden aplicar otros enfoques, como el cercado amplicónico, la metagenómica y la proteómica, para seleccionar las principales comunidades que brindan información sobre la afiliación protogenética en los estados de actividad fuera de las vías metabólicas. Este método allanó el camino para que los ecólogos microbianos y los ingenieros de bioprocesos siguieran la dinámica del microbioma en los ecosistemas naturales y controlados con una inversión razonable de recursos.