Name: Caracterización dinámica de microbioma-citometría de flujo basado en flujos de trabajo de cultivos puros de las comunidades naturales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Aprende a caracterizar dinámicamente comunidades microbianas mediante citometría de flujo. Este método permite monitorear rápidamente la dinámica del microbioma en ecosistemas naturales y biotecnológicos con alta eficiencia de costos.

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Agradecemos a Michael Jahn y Yuting Guo para proporcionar el procedimiento y los conjuntos de datos de la cultura pura y de la comunidad de lodos activados, respectivamente. Además agradecemos a Katrin Mörters para el análisis de las muestras de la comunidad de biogás. Este trabajo fue financiado por la Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe e. V. (FNR, proyecto biogás-huella digital Nr. 22008313) en nombre del Ministerio Federal alemán para la alimentación y agricultura (BMEL), el programa Central de la innovación para las PYMES (ZIM) del Ministerio federal de de asuntos económicos y energía (BMWi) (INAR-ABO, 16KN043222), la Deutsche Bundesstiftung Umwelt (DBU, proyecto On-demand Produktion von Phosphatdünger aus Reststoffen von Brauerei und Kläranlage 33960/01-32), el Ministerio Federal de educación y Investigación (BMBF) (FZK 03XP0041G) y la Asociación Helmholtz orientada al programa fondos (POF III R31 tema 3 Bioenergía).

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Los autores no tienen nada que revelar.

Un acertado análisis de poblaciones microbianas y comunidades requiere citómetros bien afinado, una adecuada selección de los parámetros de la célula y un confiable flujo de trabajo de muestreo y fijación hacia la evaluación medición y datos. Los parámetros de la celda seleccionada deben asociarse con las longitudes de onda de excitación disponibles. Utilizamos y recomendamos DAPI, que es muy sensible a bajas concentraciones; pero deben ser excitados por un láser UV, que generalmente no se compone en configuraciones estándar citómetro. Otros tintes, como el SYBR Green, también mancha toda las poblaciones o comunidades pero generalmente entregan resoluciones inferiores. No recomendamos usar pescado procedimientos o pruebas de viabilidad en las comunidades microbianas. Estos enfoques son imposibles de cuantificar, verificar y controlar porque sus efectos sobre especies individuales en la comunidad es incierto. No puede ser confiablemente probaron, como una parte sustancial de las comunidades típicas todavía no está disponible como un cultivo puro.
Pasos críticos en el protocolo incluyen procedimientos de muestreo y fijación, así como la clasificación celular. El muestreo puede ser complicado por la tendencia de ciertos cultivos puros y comunidades microbianas a agregado en flóculos o se adhieren a las partículas de la matriz de la muestra. Es esencial para disipar estos agregados y separar las células en una muestra antes de la introducción al análisis de citometría de flujo para garantizar resultados confiables. Los protocolos de preparación presentado fueron optimizados para permitir análisis unicelular. Se realiza una filtración final 50 μm antes de la medición para eliminar cualquier agregados residual y prevenir la boquilla μm 70 del clasificador de la célula y la cubeta de flujo del analizador de obstrucción. Flóculos de célula de plantas de tratamiento de aguas residuales son especialmente abundante, robusto y vital para el funcionamiento del sistema. Investigamos los planctónicos y lodos basado en las comunidades microbianas en diferentes tanques de una planta de tratamiento de aguas residuales a gran escala para probar el protocolo establecido. El lodo formando agregados fueron disipados claramente de la célula y la composición de la comunidad se mantuvieron estables. Además, las comunidades planctónicas y de lodos exhibieron notables similitudes entre ellas en los tres tanques muestreados (figura 8, archivo complementario 1-S10). Estos resultados fueron verificados por comparativa 16S rDNA amplicon secuenciación de un fresco, un formaldehído tratadas-, fijación un formaldehído y etanol-y una muestra ordenada10. Sin embargo, extraordinariamente desafiante muestras ambientales, como biofilms fuertes o las bacterias crecen en cadenas firmemente conectadas, puede ser imposible de disipar. Muestras de suelo pueden ser particularmente problemáticas, mismo las partículas omnipresentes en el histograma y pueden obscurecer las células por pura abundancia. En tales casos, los métodos tradicionales de secuenciación deban aplicarse.
La estabilidad de la fijación de cada nuevo conjunto de muestra debe analizarse antes de diseñar el experimento para garantizar la validez del resultado. Estabilidad de buena fijación también permite el combinado manchas y medición de varios puntos de tiempo de la muestra en un solo día. Además permite mediciones de replicación y retrospectiva de la célula clasificación de momentos decisivos después de la conclusión y evaluación final del experimento. La estabilidad de la fijación de la cultura pura se verificó durante 28 días (figura 9). Para los experimentos in situ incluyendo el transporte de la muestra, la estabilidad de la fijación debe ser probada durante períodos más prolongados (en este caso, de 60 días para la comunidad de lodos activados, 195 días para la comunidad de biogás, archivo complementario 1-S9).
La tinción no suele ser problemática pero debe controlarse con un biológico estándar para permitir la aplicación de las herramientas de evaluación de la bioinformática. Se utilizó la cepa simulacro e. coli BL21 (DE3), que fue determinada según el protocolo ASC y almacenadas para su uso en cada lote de tinción.
Aparte de DAPI, SYBR Green se ha aplicado con éxito para resolver las comunidades microbianas para varios años14,23,24,25,26. SYBR Green puedo resolver comunidades en subconjuntos de alta y baja de ácido nucleico (HNA y LNA) utilizando células vivas en un modo en línea. DAPI, sin embargo, es más específico en su unión al ADN y permite la distinción de más de 50 subcomunidades en conjunto una muestra pero requiere un paso de fijación antes de la tinción.
Clasificación de células es una característica destacada de este enfoque y se puede aplicar si ciertas subcomunidades son de más interés. Hay que destacar que ni PFA-(realizado por sólo 30 min) ni tratamiento de etanol o DAPI tinción10 tuvo un efecto negativo en la secuenciación de amplicones de 16S posterior. Influencias del potencial de la fijación y procedimientos el metagenoma de la subcomunidad de tinción análisis aún deben ser probados.
Mucha información sobre las funciones de la comunidad y dinámica de la tendencia puede obtenerse independiente del enfoque de clasificación cuando involucrando herramientas bioinformáticas que resolución características de la comunidad a nivel de celda por celda virtual y conectan estas características abióticas parámetros.
Recientemente, una serie de nuevas herramientas bioinformáticas evaluación, todos los útiles para ambos el SYBR verde I y los enfoques de la DAPI, se han desarrollado para resolver patrones de comunidad de citometría. Se trata de FlowFP27, los paquetes utilizan en este estudio (flowCHIC20, flowCyBar28), un modelo de deconvolución establecido con las comunidades de agua dulce29 y una herramienta utilizada para diferenciar cepas según su fisiológico características30. Además, cytometric diversidad puede ser determinado25 y estabilidad incluso propiedades de las comunidades microbianas pueden seguirse ahora con una herramienta en línea10.
Así, los análisis de citometría de flujo tienen una gran ventaja cuando se trata de la evaluación rápida de las comunidades microbianas y correlaciones posibles parámetros abióticos. Sin embargo, todavía existen limitaciones al método. No se puede aplicar verdaderamente en línea con la herramienta de flowCyBar, debido al procedimiento de ajuste de puerta basado en experiencia. Además, el desarrollo de los citómetros de flujo a la medida, fácil de usar avanzaría grandemente la proliferación del enfoque de análisis de microbioma de citometría de flujo. Primeros pasos en esta dirección son realizados28.
Futuras aplicaciones de la citometría de flujo microbiano pueden ser visualizadas en ecología microbiana, ya que permite un monitoreo de alta frecuencia dentro del rango de tiempo de generación bacteriana y se ha demostrado que paradigmas ecológicos son aplicables a los datos de citometría5 ,10. El método es muy útil para exámenes de rutina de los ambientes naturales como los controles obligatorios de agua potable en Suiza31. También puede ser una valiosa herramienta para los usos médicos como animal32 proyección de microbioma humano15 . Además, los últimos avances en Bioinformática pueden permitir citometría de flujo microbiano que un sensor integral en los controles de proceso de sistemas microbianos gestionados. Comunidad microbiana citometría también proporciona una herramienta de detección para la clasificación de la célula, que permite mayor resolución investigaciones Genómicas de subconjuntos específicos de la comunidad.

Microorganismos desempeñan un papel vital en muchos aspectos del ser humano vivo. Son los principales impulsores bióticos de la carbón de planetas, nitrógeno, fósforo y azufre los ciclos1y acto degradante2,3 así como sintetizar4 biocatalizadores en varias industrias, tales como tratamiento de aguas residuales 5 o biotecnología6. Incluso constituyen el microbioma humano, que directamente influye en la salud y metabolismo7,8. Por lo tanto, la información sobre la estructura, función y comportamiento dinámico de los microorganismos, en respuesta a su entorno inmediato, es necesaria si queremos comprender y manipular estos sistemas. Next generation sequencing (NGS) es la tecnología establecida para la resolución de estructura y función de microbioma9. Sin embargo, el análisis y evaluación de datos NGS no puede ceder información cuantitativa y es todavía costoso, desperdiciador de tiempo y de ninguna manera dispuesto a proporcionar resultados in situ dentro de corredores de rendimiento. Algunas bacterias Mostrar tiempos de generación por debajo de 1 h y causa cambia constantemente las estructuras comunitarias en determinados entornos10. Siguiendo esta dinámica, utilizando métodos de secuenciación excedería la capacidad financiera y personal de laboratorios más científicos.
Por el contrario, citometría de flujo puede proporcionar comunidad huellas similares a datos NGS, manteniendo una eficacia más alta de tiempo, mano de obra y costo. Aquí, presentamos técnicas de citometría de flujo capaces de seguir la dinámica microbiana de la comunidad en línea en el nivel unicelular. A diferencia de NGS, citometría de flujo no proporciona la afiliación filogenética o información sobre genes funcionales, pero ofrece a un número cuantitativo de células. Mediante citometría de flujo, las comunidades microbianas pueden resolverse en subcomunidades con distinta dispersión de la luz y las propiedades de fluorescencia (forward scatter (FSC) y lado scatter (SSC) proporcionan indicaciones de tamaño y granularidad, respectivamente). El enfoque presentado utiliza predominante células tamaño - y cantidad de ADN información relacionada que se asocian a ciertos tipos de células y Estados fisiológicos (crecimiento). El contenido de ADN se cuantificó usando el UV-excitable 4', tinte del 6-diamidino-2'-phenylindole (DAPI), que se une a las regiones ricas A T del ADN y puede incluso resolver diferentes niveles cromosómicos. Combinando la fluorescencia DAPI y FSC sub-comunidades más de 50 pueden ser distinguidos y monitoreados por cambiantes abundancias en el tiempo11. Las variaciones de abundancia de subcomunidad pueden correlacionarse con cambios en el entorno micro ambiental, tales como pH y producto títulos12, con parámetros globales, como el tiempo13,14, o en caso de intestino o saliva microbiomes con ciertos tratamientos médicos15. Estas correlaciones revelan subcomunidades claves responsables de funciones particulares en la red metabólica de toda la comunidad. La subcomunidad clave puede entonces ser específicamente promovido suprimida mediante la alteración de los micro-ambientes circundantes u ordenados secuenciación posterior15 o proteómicos de investigación16.
Sin embargo, citometría de flujo de la comunidad microbiana no es todavía ampliamente establecido debido a un número bastante bajo de aparatos de citometría de flujo capaces de resolver correctamente las poblaciones de microbios o comunidades. Además, la falta de experiencia, comunidad análisis tuberías y evaluación efectiva de datos constituyen una barrera de entrada para los investigadores retos análisis de microbioma. Hemos establecido flujos de trabajo integrales para abordar estas cuestiones. Para ilustrar su aplicabilidad general, les presentamos en tres conjuntos de muestra ejemplar (archivo complementario 1-S1), es decir, yo) un cultivo puro (PC) para aplicaciones biotecnológicas cultivados en medios claramente definidos (Pseudomonas putida KT 2440 en nivel de glucosa), ii) una comunidad de laboratorio complejas en medio claro (comunidad de lodos activados (ASC) en agua residual sintética) y iii) una compleja comunidad de entornos naturales en una matriz densa (comunidad de biogás (AC) en ensilaje de maíz).
Varios factores influyen en la elección de protocolo para cada uno de estos conjuntos de la muestra. Congelación, renuncia a la utilización de productos químicos tóxicos pero se limita principalmente a entornos de laboratorio debido al uso de nitrógeno líquido para baño de descarga. La estabilización de formaldehído y etanol posterior fijación permite el muestreo a granel sin necesidad de preparación de la alícuota y ha demostrado para ser estable durante largos períodos. Sin embargo, ricos en proteínas las muestras como la saliva humana15 pueden ser problemáticas, porque flóculos de proteína, denaturized por el formaldehído pueden causar desfavorable señal a proporción de ruido. El secado de la muestra se llevará más tiempo (aproximadamente 1 h en total) de los procedimientos en esta comparación, pero se puede realizar en sitio sin productos químicos tóxicos. Produce pellets estables en tubos, que pueden ser fácilmente enviados sin precauciones peligro de enfriamiento o adicional. Además, un montón de métodos de fijación alternativos han sido propuesto11. Aconsejamos fuertemente para poner a prueba la estabilidad resolución y fijación de los diferentes protocolos de introducción de un nuevo conjunto de muestra.
Utilizamos dos citómetros de flujo diferentes para analizar los conjuntos de: i) una investigación muy sofisticado y caro, centrado en el clasificador de células y ii) un aplicación enfocada Banco analizador superior que parece más apropiado para aplicación in situ5. El BC se midió con el analizador superior del Banco, mientras que el PC y el ASC se midieron con el clasificador de células. El análisis de la muestra ejemplar tres sistemas requieren procedimientos diferentes para reproducibilidad optimizado, muestra estabilidad y comodidad de flujo de trabajo. El siguiente protocolo especificará las secciones para los tres sistemas diferentes.

<table><tbody><tr><td>Sistema Milli-Q Synthesis A10</td><td>Merck, Darmstadt, (GER)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioPak Cartucho de ultrafiltración</td><td>Merck, Darmstadt, (GER)</td><td>CDUF BI0 01</td><td></td></tr><tr><td>Clasificador de células MoFlo Legacy</td><td>Beckman-Coulter, Brea, California (EE. UU.)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Innova 90C</td><td>Coherent, Inc , Santa Clara (EE. UU.)</td><td></td><td>334 nm - 364 nm, 100 mW</td></tr><tr><td>Innova 70C&nbsp;</td><td>Coherent, Inc , Santa Clara (EE.UU.)</td><td></td> <td>488 nm, 400 mW</td></tr><tr><td>Genesis MX488-500 STM OPS</td><td>Coherent, Inc , Santa Clara (EE.UU.)</td><td></td> <td>488 nm, 400 mW</td></tr><tr><td>Xcyte CY-355-150</td><td>Lumentum, Milpitas, California, EE.UU</td><td></td>. <td>355 nm, 150 mW</td></tr><tr><td>Tubos fotomultiplicadores R928 y R3896</td><td>Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japón)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software</td> <td>Summit 4.3Beckman-Coulter, Brea, California (EE.UU.)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 y micro; m&nbsp; Sondas moleculares FluoSpheres</td><td>, Eugene, Oregón (EE. UU.)</td><td>F8815</td><td>350/440 azul fluorescente</td></tr><tr><td>2 &mu; m YG FluoSpheres Sondas moleculares</td><td>, Eugene, Oregón (EE. UU.)</td><td>F-8827</td><td>505/515 perlas fluorescentes amarillo-verde&nbsp;</td></tr><tr><td>0,5 &mu; m Microesferas de carboxilato BB de fluoresbrite</td><td>PolyScience, Niles, Illinois (EE. UU.)</td><td>18339</td><td>360/407</td></tr><tr><td>1 &mu; m Fluoresbrite BB Microesferas de carboxilato PolyScience</td><td>, Niles, Illinois (EE. UU.)</td><td>17458</td><td>360/407 azul fluorescente</td></tr><tr><td>1 &; mYG FluoSpheres</td><td>Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA)</td><td>F-13081</td><td>505/515 perlas fluorescentes amarillo-verde&nbsp;</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis (EE. UU.)</td><td>CAS n.º 7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis (EE.UU.)</td><td>CAS n.º 7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Cyflow Space&nbsp;</td><td>Sysmex Corporation, Kobe (Japón)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV Laser Genesis CX,Coherent</td><td>, Inc , Santa Clara (EE. UU.)</td><td></td><td>355 nm, 150 mW</td></tr><tr><td>H6779-32 series PMT</td><td>Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japón)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FloMax software</td><td>Sysmex Partec GmbH, G&ouml; rlitz, (GER)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>todos los filtros ópticos</td><td>Carl Zeiss, Jena (GER)</td>KH<td></td><td></td></tr><tr><td>2PO4</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis (USA)</td><td>CAS no. 7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Carl Roth, Karlsruhe (GER)</td><td>6781.3</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 10.0.8r1</td><td>FlowJo, LLC, Ashland, Oregon (USA)</td><td></td><td>Número de compilación: 42398</td></tr><tr><td>R-software v.3.4.3</td><td>R Core Team</td><td></td><td></td></tr><tr><td>flowCHIC</td><<td>a href="http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html">http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>flowCyBar</td><td><a href="http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/flowCyBar.html">http://www.bioconductor.org/packages/devel/ bioc/html/flowCyBar.html</a></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

caracterización dinámica de microbioma-citometría de flujo basado en flujos de trabajo de cultivos puros de las comunidades naturales

Characterizing Microbiome Dynamics &#8211; Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities

La investigación de cultivos puros y monitoreo de la dinámica de la comunidad microbiana es esenciales para entender y controlar los ecosistemas naturales y aplicaciones técnicas impulsadas por microorganismos. Próxima generación métodos de secuenciación se utilizan ampliamente para resolver microbiomes, pero son generalmente recursos y tiempo intensivo y entregar información sobre todo cualitativa. Análisis de microbioma cytometric del flujo no sufre de las desventajas y puede proporcionar la abundancia relativa de la subcomunidad y absoluto celular números en línea. Aunque no entrega información filogenética directa, puede mejorar la profundidad de análisis y resolución de métodos de secuenciación. En contraste con usos médicos en la investigación y ajustes de rutina, citometría de flujo es aún no ampliamente utilizada para análisis de microbioma. Información faltante en tuberías de análisis de datos y preparación de muestra puede crear una barrera de entrada para los investigadores retos microbioma análisis que a menudo aplicaciones de citometría de flujo manual. Aquí presentamos tres flujos de trabajo integrales para cultivos puros, comunidades complejas en claro las comunidades medianas y complejas en matrices difíciles, respectivamente. Describir los procedimientos de muestreo y fijación y optimizado tinción protocolos para los conjuntos de la muestra respectiva. Elaborar el análisis de citometría con una compleja investigación centrada y un aplicación enfocada Banco superior dispositivo, describir la célula clasificación procedimiento y proponer paquetes de análisis de datos. Además propone importantes controles experimentales y los flujos de trabajo presentados se aplican a los conjuntos de la muestra respectiva.

Los siguientes resultados representativos destacan la necesidad de repeticiones y ejemplifican técnicas de visualización y análisis de datos diferentes en cada uno de los tres tipos de muestra. Muestran los resultados de datos evaluación tuberías adecuado para responder a preguntas de investigación estándar sobre el respectivo conjunto. Sin embargo, las técnicas presentadas no son exclusivas para el conjunto de la muestra que se presentan con. Los datos brutos de la citometría de flujo se hizo disponibles públicamente con el ID FlowRepository FR-FCM-ZY46. Previamente datos cargados de la ASC están disponibles bajo ID FR-FCM-ZYD7.
Réplicas biológicas y técnicas fueron tomadas, preparados y analizados según protocolos publicados11. Réplicas biológicas de la PC y ASC fueron tomadas de tres frascos paralelo. Réplicas biológicas de el BC se toman como tres muestreos subsecuentes en un lugar único en una planta a escala piloto. Tres alícuotas de una muestra se fija, manchados y se analizaron para asegurar la reproductibilidad técnica. Se evaluó la reproducibilidad de los métodos según los procedimientos previamente publicados en11. Una plantilla de puerta para todas las muestras del conjunto de una muestra (archivo complementario 1-S6) se utilizó para el cálculo de la desviación estándar (%) por la puerta.
Para el PC, la máxima desviación estándar de la abundancia relativa fue 3.44%, mientras que la desviación estándar promedio fue del 2.13% (figura 1). Para el ASC y el BC, la máxima desviación estándar de la abundancia relativa fueron 1,27% y 0,88%, mientras que los promedios de las desviaciones estándar fueron 2.13% y 0.21% (archivo complementario 1-S8).
Un procedimiento estándar, al investigar una cultura de pura cepa, es la preparación de una curva de crecimiento para analizar la fase lag, tiempos de generación y densidad celular bajo condiciones específicas. Hemos combinado este procedimiento con el workflow de análisis citometría de flujo para lograr una comprensión más profunda del sistema (figura 2). El FSC vs DAPI fluorescencia parcelas revelan los Estados del ciclo celular de la cultura en diferentes puntos de la cultura de la hornada. Una plantilla de la puerta principal (archivo complementario 1-S6) fue establecida para cuantificar la proporción de células con uno (c1n), dos (c2n) y cromosomas múltiples (cXn, figura 2B). La proporción predominante de células inoculadas tenía sólo un cromosoma (93.7% en 0 h). Esto cambió drásticamente durante el crecimiento exponencial, donde casi todas las células figuran más de una (99,6%, 4 h) y más de la mitad de la población (53,1%) incluso más de dos cromosomas. Esto muestra la capacidad de s de p. putidapara replicar sus cromosomas más rápidamente que su tiempo de generación.
Análisis cytometric del flujo ha demostrado ser muy útil para monitorear la evolución de las comunidades microbianas. Puede seguir la dinámica comunitaria mucho más cerca que el recurso más intensivo métodos moleculares5,10. Destacó estas dinámicas en una película y obtuvo una visión general de los cambios de la comunidad de lodos activados con el tiempo. Cada segundo el marco muestra una parcela de fluorescencia FSC vs DAPI de un punto de muestra (archivo adicional 2). Un cambio muy distinto entre el día 0 y día 4 fue seguido por el establecimiento de una comunidad de base después de día 7. Subcomunidad adicional ocurrió en el día 21. Hemos establecido una plantilla de la puerta principal (archivo complementario 1-S6) que permitió la evaluación de la dinámica microbiana a nivel de subcomunidad. La subcomunidad dominante en las diferentes etapas del experimento fueron identificados claramente con la herramienta de CyBar (figura 3). Combinación con la distribución de frecuencia de la abundancia relativa de la subcomunidad ayudó a seleccionar puertas que son interesantes (cambios significativos en la abundancia activado en un momento clave) y viable (sobre la abundancia relativa de 5%) para la clasificación y más Análisis22.
Aplicaciones del biorreactor a escala industrial pueden enfrentar posibles heterogeneidades espaciales debido a las limitaciones de la agitación. También con frecuencia están expuestos a los cambios de parámetros de funcionamiento, como alteraciones en la calidad de los sustratos no sintético. El AC representa un sistema y se tomaron muestras de diferentes localidades de un reactor de flujo tapón dinámicamente impulsado. Parcelas de fluorescencia de la FSC vs DAPI (figura 4) de los puntos de muestra ejemplar muestran heterogeneidad temporal sólo poco espacial, pero pronunciado. El BC fue investigada más a fondo con ambos, el CHIC rápido automatizado y la plantilla de la puerta principal más profunda CyBar enfoque basado en.
Su naturaleza automatizada, rápida e imparcial, hace el CHIC especialmente interesante para el control in situ de bioprocesos en un entorno industrial. Compara datos raw .fcs de todas las muestras disponibles. Dos de estas comparaciones se muestran en la figura 5. Los valores de disimilitud obtenidos confirman las observaciones anteriores sobre la heterogeneidad espacial y temporal. El NMDS parcelas generadas forma la matriz de disimilitud de herramientas CHIC (figura 6) más fundamenta este resultado y visualiza en consecuencia.
Además, se calculó la abundancia relativa de 23 subcomunidades de el BC con una plantilla de la puerta principal (archivo complementario 1-S6). Se realizó un análisis de correlación de 48 muestras de un período de un año para comprender las relaciones funcionales en la comunidad microbiana. Esto puede ayudar a identificar puertas de interés para la posterior investigación (4 clasificación de la célula). Fuerte correlación positiva o negativa con parámetros abióticos como producto títulos pueden ayudar a comprender y optimizar los ecosistemas y procesos biotecnológicos. La tasa de carga orgánica en esta correlación (figura 7) es un ejemplo de tal un parámetro abiótico. G5 y G4, G10 exhiben fuertes correlaciones positivas y podrían posiblemente contener especie fermentativa, mientras que la correlación negativa en el G8 podría apuntar hacia archaea metanogénicas.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig1.jpg"> Figura 1: reproducibilidad de los análisis de citometría de la pura cultura. Fluorescencia de FSC vs DAPI parcelas con cuentas de control (A, B) y parcelas de la abundancia de la subcomunidad de 3 [%] con barras de error que representa ± una desviación estándar (C, D). La abundancia relativa se determinó con la plantilla de la puerta que se muestra en la archivo adicional 1-S6. Tres réplicas biológicas A, B y C fueron tomadas de la curva de crecimiento en 4 h y tres repeticiones técnicas P1, P2, P3 se prepararon de la muestra A y tres veces, respectivamente: M1, M2, M3 y con sus respectivas desviaciones estándar. se registraron 50.000 eventos en la puerta de la celda. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig2.jpg"> Figura 2: análisis del ciclo de la célula de la cultura pura en una curva de crecimiento experimento sobre 12 h. (A). Fluorescencia de FSC vs DAPI parcelas de las muestras cada dos horas que exhiben un cambio del contenido de ADN durante la fase de crecimiento exponencial. Esta serie de medición no incluye granos (véase la archivo adicional 1-S3). (B). curva de crecimiento basado en la densidad óptica con barras de error que representa una desviación estándar de ± y abundancia relativa en la subcomunidad con el tiempo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig3.jpg"> Figura 3: evolución de la estructura de la comunidad de lodo activado durante 24 días. (A) el flowCyBar con superposición de distribuciones de frecuencia visualizadas en boxplots para las puertas individuales que son arregladas por la similitud de las tendencias, el correspondiente color clave (B) y un análisis de semejanza en un ingenio de la trama NMDS R &lt; (0.001 C). las parcelas subyacentes aparecen en la secuencia de la película en archivo adicional 2. Abundancia relativa se determinó utilizando la plantilla de la puerta en la archivo adicional 1 - S6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig4.jpg"> Figura 4: reactor de biogás del flujo del enchufe heterogeneidad espacial y temporal de la estructura de la comunidad microbiana en escala industrial. Muestreo (A) la comparación de la estructura de la comunidad microbiana de los cuatro puertos I-IV día 223. (B) la comparación de las variaciones de estructura comunidad dependiente de tiempo desde el día 0 a día 384 puerto II. El ruido ha sido cortado tardíamente para mejorar la visualización. 250.000 eventos fueron medidos en la puerta de la celda (archivo complementario 1-S6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig5.jpg"> Figura 5: histograma de la citometría de imagen comparación — elegante. El principio del algoritmo CHIC se ejemplifica mediante la comparación de dos muestras que representan la heterogeneidad espacial y temporal, respectivamente. (i) imágenes CHIC se crean de los archivos de .fcs después de seleccionar dos parámetros para mostrar (fluorescencia de FSC vs DAPI). La escala de grises (0 – 255) los códigos de la cuenta del evento en un píxel. (ii) CHIC subconjuntos se generan después de especificar el área que contiene las células (aquí: 200 &lt; x &lt; 4000, 200 &lt; y &lt; 2200). (iii) imagen de combinación XOR se crea mediante la comparación de píxeles entre los subconjuntos. Ninguna diferencia es igual a 0 y se muestra como negro. Diferencia máxima igual a 200 y se muestra como blanco. El valor correspondiente de la XOR se calcula agregando los valores de escala de grises de todos los píxeles de la imagen de la XOR. (iv) recubrimiento combinación imagen se crea mediante la adición de los valores de escala de grises de los píxeles de los subconjuntos. El valor de recubrimiento correspondiente se calcula contando los píxeles de una imagen de superposición que no igual a cero y por lo tanto contienen información. (v) valores de disimilitud se calculan dividiendo valores XOR y superposición. Estas son la base para la trama de la NMDS en la figura 6. Tanto los valores de disimilitud y la demostración de parcela NMDS un insignificante espacial- y una comunidad temporal pronunciada heterogeneidad. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig6.jpg"> Figura 6: CHIC basado en análisis de similitud de las muestras de biogás comunidad. La muestra de 0-day fue excluida de este terreno debido a su estructura extremadamente distintas comunidades que distorsionan el análisis (archivo complementario 1-S11). La trama de la NMDS confirma la suposición bajo espacial- y la mayor heterogeneidad temporal utilizando la herramienta elegante y explicado en la figura 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig7.jpg"> Figura 7: Análisis de correlación en la comunidad de biogás. La matriz se calculó con el coeficiente de orden de rango de Spearman y se basa en la abundancia relativa de 23 subcomunidades que se determinaron con la plantilla de la puerta principal en la archivo adicional 1-S6. Fueron correlacionados con la tasa de carga orgánica (OLR) para 48 muestras de un período de un año. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig8.jpg"> Figura 8: Análisis de similitud de planctónicos (P) y fango basado en comunidades (S) en aguas residuales. Se tomaron muestras de la cuenca de lodos del clarificador primario (LCP), activado (AS) y tanque digestor (DT) de una planta de tratamiento de aguas residuales a gran escala (punto parcelas en archivo adicional 1-S10). Abundancia relativa se determinó utilizando la plantilla de la puerta que se muestra en la archivo adicional 1-S6. También se analizaron estas abundancias de subcomunidad con la herramienta flowCyBar para crear un CyBar (archivo complementario 1-S10) y NMDS parcela (R &lt; 0,01). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig8large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig9.jpg"> Figura 9: estabilidad de la fijación de la pura cultura. Las muestras del experimento de la curva de crecimiento en 0 h fueron almacenadas durante 28 días a-80 ° C después de la fijación en glicerol al 15%. Fluorescencia de FSC vs DAPI parcelas con control aparecen granos. Serie de medición no incluye granos (archivo complementario 1-S3). se registraron 50.000 eventos en la puerta de la celda (archivo complementario 1-S6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig9large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Archivo adicional 1: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/Supplementary-File-1.pdf" target="_blank">por favor haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo adicional 2: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/Supplementary_File_2.gif" target="_blank">por favor haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Análisis cytometric del flujo ha demostrado ser valioso para investigar cultivos puros y monitoreo de la dinámica de la comunidad microbiana. Presentamos tres flujos de trabajo integrales, de muestreo para análisis de datos, para cultivos puros y comunidades complejas en medio claro, así como en matrices difíciles, respectivamente.

Caracterización dinámica de microbioma-citometría de flujo basado en flujos de trabajo de cultivos puros de las comunidades naturales

The investigation of pure cultures and monitoring of microbial community dynamics is vital to understand and control natural ecosystems and technical ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en ecología microbiana y biotecnología, por ejemplo, qué conceptos ecológicos impulsan un ecosistema dado. La principal ventaja de esta técnica es que se puede utilizar para cerrar la dinámica rápida del microbioma con el régimen de muestreo de intervalo corto, sin dejar de ser muy rentable. Este método se puede utilizar para obtener información sobre las comunidades microbianas biotecnológicas y naturales y también sobre los microbiomas animales y humanos para los estados nutricionales y de salud.La demostración del procedimiento estará a cargo de Florian Schattenberg, técnico y operador de SediMeter en nuestro laboratorio. Para secar una muestra comunitaria de biogás, utilice una punta de pipeta modificada de un mililitro para transferir 200 microlitros del digestato viscoso a un tubo de dos mililitros que contenga 1,7 mililitros de PBS. Después de mezclarlos bien, coloque los tubos en un baño ultrasónico durante un minuto para disolver los agregados de células grandes y unir las células que se adhieran a los residuos de células vegetales.Después de la sonicación, mezcle bien la muestra y filtre las células a través de un colador de malla de poros de 50 micrómetros en un tubo de plástico de 2 mililitros. Divida el filtrado en cuatro alícuotas de 400 microlitros y centrifugue las alícuotas dos veces, desechando el sobrenadante por completo en ambas ocasiones para deshidratar mecánicamente la muestra de microbios lo más completamente posible. A continuación, seque la muestra en una centrífuga de vacío calentada para crear un pellet estable y almacene el pellet a cuatro grados centígrados protegido de la luz.Para la estabilización y fijación de muestras de lodo activado, centrifugar cuatro mililitros de las celdas y volver a suspender el pellet en cuatro mililitros de formaldehído al dos por ciento en PBS. Después de 30 minutos a temperatura ambiente, centrifugar la muestra de celda estabilizada y fijar el pellet en cuatro mililitros de etanol al 70% para un almacenamiento de menos 20 grados centígrados. Mezcle y transfiera 0,6 mililitros de la suspensión de celda fija a un tubo de vidrio que contenga 1,4 mililitros de PBS y, después de una mezcla completa, sonique durante 10 minutos como se demuestra.Al final de la sonicación, recoja las células por centrifugación y vuelva a suspender el pellet en dos mililitros de PBS fresco. Después de una mezcla minuciosa, sonique las celdas como se acaba de demostrar durante cinco minutos y ajuste el OD 700 nanómetro a 035 con PBS nuevo. Recoja las células por centrifugación y vuelva a suspender el pellet en un mililitro de tampón de permeabablización que contenga 0,11 molar de ácido cítrico y 4,1 milimolares 20, con una mezcla completa, para una incubación de 20 minutos a temperatura ambiente.A continuación, recoja las células por centrifugación y vuelva a suspender completamente el pellet en dos mililitros de solución de tinción que contenga 0,68 micromolares de DAPI, durante una incubación de al menos 60 minutos a temperatura ambiente, protegida de la luz. Para la calibración de cordones, cargue la mezcla de perlas para la calibración lineal en el citómetro de flujo y mida los cordones continuamente mientras manipula las posiciones de la boquilla y la óptica láser para precalibrar el instrumento en el rango lineal. Cuando los picos de cuentas se puedan ajustar en una plantilla de calibración preestablecida, cambie al modo de registro y cargue una muestra de cuentas de calibración logarítmica.Ajuste los picos logarítmicos del cordón a su plantilla de calibración preestablecida para ajustar el hardware del instrumento, y utilice el ajuste de ganancia del tubo fotomultiplicador para realizar los ajustes finales necesarios en la posición del cordón. El aspecto más crítico de este procedimiento es mantener mediciones consistentes para permitir la comparabilidad entre experimentos. Por lo tanto, la calibración diaria del citómetro y el uso de perlas en los párpados biológicos son vitales para el éxito de la diálisis lenta del microbioma citromático. Cuando las celdas estén listas, mezcle y filtre las muestras y agregue la mezcla de perlas logarítmicas a las celdas.Ahora mezcle y cargue la muestra en el citómetro y cree una puerta para incluir las células teñidas y excluir el ruido y las perlas. A continuación, analice el conjunto de muestras consecutivamente a una velocidad máxima de 3.000 eventos por segundo hasta que se detecten 250.000 células dentro de la puerta de la celda. Para analizar los datos de citometría de flujo, desarrolle una plantilla de puerta maestra para su uso en todas las muestras.Comience cargando los archivos estándar de citometría de flujo en un programa de análisis de citometría de flujo adecuado y procese las muestras sucesivamente. Cargue las muestras, haga doble clic en una medición y seleccione los parámetros de los ejes X e Y en sus respectivos menús desplegables para abrir un gráfico de fluorescencia de dispersión directa frente a DAPI. Utilice la herramienta de dibujo de polígonos para reproducir la puerta de celda de medición generada anteriormente para excluir las cuentas y el ruido, y asigne un nombre a la puerta en consecuencia.Arrastre la entrada de la puerta de celda a la lista de grupos de todas las muestras y haga doble clic en la puerta de celda para mostrar selectivamente solo los eventos de celda. Defina las subcomunidades prevalentes en una muestra con la herramienta de puerta elíptica y agrupe. A continuación, agregue asignaciones de subcomunidades adicionales y muestras posteriores hasta que la plantilla de puerta maestra se ajuste a todas las muestras.Controle la plantilla de la puerta maestra con el método de escaneo de dispersión lateral para resolver la agrupación de subcomunidades cerca unas de otras. A continuación, agregue todas las subcomunidades al editor de tablas y establezca la estadística de salida en la frecuencia del elemento principal. Utilice el editor de tablas para exportar las abundancias relativas de la subcomunidad a un software de hoja de cálculo adecuado y adapte el formato de los datos de acuerdo con las directrices del manual de la barra lateral.A continuación, para visualizar la dinámica y las correlaciones de la subcomunidad, instale y cargue el paquete R, y cargue y normalice el archivo txt. Los gráficos de fluorescencia de dispersión directa frente a DAPI revelan los estados del ciclo celular de los cultivos de cepas puras en diferentes puntos de un cultivo por lotes. El uso de una plantilla de puerta maestra permite cuantificar la proporción de células con uno, dos o varios cromosomas, revelando, por ejemplo, la capacidad de este microbio representativo para replicar sus cromosomas más rápido que su tiempo de generación.Al investigar comunidades microbianas complejas a lo largo del tiempo, el ritmo y la importancia del cambio de la comunidad se pueden visualizar fácilmente con una secuencia de diagrama de puntos. Las subcomunidades dominantes en las diferentes etapas del experimento se pueden identificar claramente utilizando la herramienta de código de barras citométrico. La combinación de estos datos con la distribución de frecuencias de las abundancias relativas de la subcomunidad permite la selección de puertas que demuestran cambios significativos en la abundancia en puntos clave del tiempo.La visualización de estos datos en un gráfico de escala multidimensional no métrico puede facilitar una comprensión más profunda de la dinámica de la comunidad. Las comunidades de biogás pueden enfrentarse a heterogeneidades espaciales debido a las limitaciones de agitación. Los ejemplares puntos de muestreo de la comunidad de biogás exhiben poca heterogeneidad espacial, pero pronunciada en el tiempo.Las fuertes correlaciones positivas o negativas con los parámetros abióticos, como los ajustadores del producto, pueden ayudar a comprender y optimizar los ecosistemas y los procesos biotecnológicos. Además, facilitan la identificación de puertas de especial interés para su posterior clasificación y análisis. Al establecer este procedimiento, se recomienda evaluar diferentes procedimientos de fijación y tinción para evaluar su rendimiento y estabilidad para cada nuevo conjunto de muestras.Después de la clasificación, se pueden aplicar otros enfoques, como el cercado amplicónico, la metagenómica y la proteómica, para seleccionar las principales comunidades que brindan información sobre la afiliación protogenética en los estados de actividad fuera de las vías metabólicas. Este método allanó el camino para que los ecólogos microbianos y los ingenieros de bioprocesos siguieran la dinámica del microbioma en los ecosistemas naturales y controlados con una inversión razonable de recursos.

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Las curvas innovadoras (BTC) son herramientas eficientes para estudiar el transporte de bacterias en medios porosos. Aquí introducimos herramientas basadas en dispositivos fluidos en combinación con microscopía y conteo citométrico de flujo para obtener BTC.

Combinación de dispositivos fluidos con microscopía y citometría de flujo para estudiar el transporte microbiano en medios porosos a través de escalas espaciales

Describimos aquí un análisis simple de la heterogeneidad del compartimento de células B inmunes murinas en el peritoneo, el bazo y los tejidos de la médula ósea por citometría de flujo. El protocolo se puede adaptar y extender a otros tejidos de ratón.

Caracterización citométrica de flujo del desarrollo de células B murinas

Este protocolo describe un enfoque cuantitativo para medir la autoagregación microbiana mediante citometría de flujo por imágenes.

Citometría de flujo por imágenes para estudiar la autoagregación microbiana

Este protocolo proporciona una guía completa para la configuración y el seguimiento cuantitativo de cocultivos, incluidas las cianobacterias fotoautótrofas secretoras de azúcar y las levaduras heterótrofas.

Ensamblaje y cuantificación de cocultivos que combinan levaduras heterótrofas con cianobacterias fototróficas secretoras de azúcar

Proporcionamos una técnica para preservar el floema intacto de los árboles y prepararlo para la observación.  Creamos un aparato llamado sándwich de floema que permite la introducción y observación de artrópodos, microbios y otros organismos que habitan en los tejidos del floema.

Técnica para el estudio de los artrópodos y las comunidades microbianas dentro de los tejidos del árbol

Aprende a caracterizar dinámicamente comunidades microbianas mediante citometría de flujo. Este método permite monitorear rápidamente la dinámica del microbioma en ecosistemas naturales y biotecnológicos con alta eficiencia de costos.

Caracterización dinámica de microbioma-citometría de flujo basado en flujos de trabajo de cultivos puros de las comunidades naturales (Video) | JoVE Journal

Caracterización dinámica de microbioma-citometría de flujo basado en flujos de trabajo de cultivos puros de las comunidades naturales

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