Molecular Sonda Optimización para determinar la mortalidad celular en una fotosintética Organismo ( Microcystis aeruginosa) Usando citometría de flujo

El objetivo general de este procedimiento es demostrar cómo crear un protocolo que pueda analizar el estado fisiológico de las cianobacterias de manera efectiva, utilizando citometría de flujo y sondas moleculares. Este protocolo puede ayudar a responder preguntas clave sobre la fisiología celular de las comunidades microbianas. La principal ventaja de este procedimiento es que un protocolo optimizado de sonda fluorescente puede distinguir entre los estados fisiológicos de las cianobacterias a nivel de célula individual en tiempo real.

David Hartnell, estudiante de doctorado que trabaja en el laboratorio de citometría de la Universidad de Bournemouth, demostrará este procedimiento. Antes de comenzar el experimento, coloque un tubo de hemólisis vacío en la sonda de inyección de muestra. Haga clic en desatascar.

Y luego enjuague a contracorriente para iniciar el proceso de limpieza de citometría de flujo. Al final del retrolavado, cargue un nuevo tubo de hemólisis que contenga dos mililitros de agua filtrada ultrapura en la sonda de inyección de muestra, o SIP, y establezca el límite de tiempo en 10 a 15 minutos, y la velocidad del fluido en rápida. A continuación, seleccione una nueva celda de datos y establezca los umbrales de fluorescencia y dispersión de luz relevantes para reducir el ruido de fondo.

A continuación, haga clic en ejecutar. Si el total de eventos por segundo no es inferior a la recomendación del fabricante, ejecute dos mililitros de solución de descontaminación durante dos minutos rápidamente. Y repita los pasos de lavado a contracorriente y lavado con agua ultrapura.

Para preparar un monocultivo primario de M.aeruginosa, se autoclave 98 mililitros de agua filtrada ultrapura, mezclada con dos mililitros de medio algal, en un vaso de precipitados de 250 mililitros durante 20 minutos a 120 grados centígrados. Cuando un cultivo se encuentra en una alta densidad de estado estacionario, se desagregan dos mililitros de células mediante vórtice. Y luego transfiera las células debajo de la sonda de inyección de muestra.

Confirme que las células se dispersan uniformemente por microscopía óptica. A continuación, seleccione un gráfico de histograma en el software del citómetro de flujo para registrar los datos de dispersión de la luz directa. Y haga clic en registro para ver los datos en una escala de registro en el eje x.

En una salida separada, configure otro histograma de eje logarítmico para registrar la fluorescencia natural de las células de M. aeruginosa. A continuación, seleccione una fuente de luz que pueda excitar la ficocianina y un detector que pueda filtrar las emisiones de la fluorescencia resultante. Para grabar a la resolución más alta, seleccione la configuración más cercana al tamaño del núcleo del organismo objetivo.

Y establezca un caudal relativamente lento. Antes de adquirir los datos, establezca un umbral para bloquear cualquier señal de dispersión de luz y fluorescencia causada por el ruido de fondo electrónico o los restos de muestras de celdas. A continuación, seleccione una nueva celda de datos.

Cree una gráfica de densidad con parámetros de dispersión directa y lateral en una escala logarítmica y haga clic en ejecutar. Ahora aplique la dispersión de luz directa y la puerta de fluorescencia natural a los datos de dispersión directa por lado para excluir cualquier señal de dispersión de bajo nivel e incluir solo las señales de ficocianina de fluorescencia relativa más alta. A continuación, recopile eventos hasta que finalice la muestra y utilice los datos para determinar el recuento inicial de células.

Para optimizar la absorción de células de la sonda molecular, exponga la mitad del monocultivo previamente preparado a las condiciones adecuadas para generar un control muerto. Verifique las variaciones en el microambiente de la muestra para confirmar la muerte del cultivo. Y luego desagregar la formación de colonias como se acaba de demostrar.

A continuación, seleccione un láser de 488 nanómetros junto con un detector que pueda registrar la fluorescencia de las sondas de ácido nucleico verde y naranja. Y el láser de 640 nanómetros para registrar las señales de ficocianina a través de sus respectivos detectores. En una nueva hoja de datos, configure un gráfico de densidad con parámetros de dispersión hacia adelante y hacia los lados.

A continuación, cree un histograma utilizando el canal del detector óptico de la sonda molecular correspondiente. Un histograma para detectar las emisiones de ficocianina y un histograma para eventos de dispersión directa, todo a escala logarítmica. Ejecute las muestras de cianobacterias utilizando diferentes concentraciones y tiempos de incubación.

Cree una puerta en el histograma de dispersión directa para incluir eventos solo con el tamaño de celda del organismo objetivo. Y aplicarlo al canal de sonda de fluorescencia correspondiente. A continuación, en el canal de la sonda de fluorescencia, cree otra puerta de software inclusiva contra el pico más alto del histograma.

Y, posteriormente, compuerta la fluorescencia de la sonda positiva correspondiente en el gráfico de densidad. Compare el número de señales de fluorescencia con el número de células de control muertas, donde el porcentaje más alto de absorción de la sonda nucleica celular no produce tinción inespecífica. Para probar la superposición de interferencia de fluorescencia de la tinción de células intrínsecas o no específicas, seleccione los datos de cultivo mixto de 50 por ciento vivos y 50 por ciento muertos.

Y retire las puertas fluorescentes. Aplique puertas para incluir solo el histograma de dispersión directa para el tamaño de celda del organismo objetivo en el histograma del canal de ficocianina. Seleccionar los picos más altos y más bajos de ficocianina, y etiquetarlos vivos y muertos, respectivamente.

A continuación, aplique por separado las puertas a las señales de ficocianina viva y muerta. Y registra ambas longitudes de onda medias. Para determinar la sensibilidad del protocolo, relacione las longitudes de onda medias de la fluorescencia de la sonda molecular muerta positiva y la señal viva intrínseca no específica.

Por último, seleccione el protocolo optimizado en el que se haya teñido la mayor cantidad de células muertas sin que se produzcan tinciones inespecíficas. En estos gráficos, se muestran las salidas representativas de dispersión de luz frontal y lateral, para el tamaño celular y la complejidad interna de un cultivo por lotes de M. aeruginosa en la fase exponencial. La compuerta se puede realizar refinando los datos entre ciertos puntos de la salida de dispersión de luz directa.

La ficocianina produce una señal fuerte cuando es interrogada por una fuente de luz roja, que se puede utilizar para controlar aún más las poblaciones de interés. A partir de la dispersión de la luz directa y las señales fluorescentes, los datos se pueden aislar desde la salida original hasta datos específicos sobre la muestra de M. aeruginosa para los recuentos finales de células. Cuando se mezclan controles vivos de alta pigmentación y muertos de baja pigmentación, el cambio decreciente en la autofluorescencia se hace evidente.

En las células con membrana comprometida, las sondas de ácido nucleico producen una señal adicional que puede observarse mediante citometría de flujo y confirmarse aún más mediante microscopía de epifluorescencia. La discriminación de fluorescencia entre células vivas y muertas aumenta con el tiempo entre las concentraciones de 0,05 y 0,5 micromolares, pero disminuye entre las concentraciones de uno y 100 micromolares para ambas sondas. De hecho, la concentración óptima para la sonda de ácido nucleico verde parece ser de 0,5 micromolares con un tiempo de incubación de 30 minutos.

Para la sonda de ácido nucleico naranja, la concentración óptima es de un micromolar para una incubación de 10 minutos. Una vez dominada, para cada sonda molecular, la optimización se puede completar en un día, si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener las sondas en un entorno estable, bajo las condiciones adecuadas de temperatura, pH y luz.

Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la microbiología exploraran la heterogeneidad de las comunidades en el fitoplancton. Después de haber visto el video, ahora debería tener una buena comprensión de cómo desarrollar un protocolo óptimo para evaluar la fisiología celular utilizando citometría de flujo y sondas moleculares. No olvide que trabajar con sondas moleculares y organismos tóxicos puede ser extremadamente peligroso, y que siempre se deben tomar precauciones como usar el EPP adecuado y tener un conocimiento completo de los materiales COSHH al realizar este procedimiento.