Molecular Sonda Optimización para determinar la mortalidad celular en una fotosintética Organismo (

El objetivo general de este procedimiento es demostrar cómo crear un protocolo que permita analizar de forma eficaz el estado fisiológico de cianobacterias, utilizando citometría de flujo y sondas moleculares. Este protocolo puede ayudar a responder preguntas clave sobre la fisiología celular de comunidades microbianas. La principal ventaja de este procedimiento es que un protocolo optimizado con sondas fluorescentes puede distinguir entre los estados fisiológicos de cianobacterias a nivel individual de la célula en tiempo real.

David Hartnell, un estudiante de doctorado que trabaja en el laboratorio de citometría de la Universidad de Bournemouth, demostrará este procedimiento. Antes de comenzar el experimento, coloque un tubo de hemólisis vacío en la sonda de inyección de la muestra. Haga clic en desatascar.

Luego, realice una retrofluencia para iniciar el proceso de limpieza de la citometría de flujo. Al final de la retrofluencia, cargue un nuevo tubo de hemólisis que contenga dos mililitros de agua filtrada ultra pura en la sonda de inyección de muestra, o SIP, y establezca el límite de tiempo entre 10 y 15 minutos, y la velocidad fluidica en rápida. A continuación, seleccione una nueva celda de datos y ajuste los umbrales relevantes de fluorescencia y dispersión de la luz para reducir el ruido de fondo.

Luego haga clic en ejecutar. Si el número total de eventos por segundo no es inferior a la recomendación del fabricante, ejecute dos mililitros de solución de descontaminación durante dos minutos a velocidad rápida. Repita los pasos de retroflujo y enjuague con agua ultrapura.

Para preparar un cultivo puro primario de M.aeruginosa, autoclave 98 mililitros de agua filtrada ultra pura, mezclada con dos mililitros de medio algal, en un vaso de precipitados de 250 mililitros durante 20 minutos a 120 grados Celsius. Cuando un cultivo se encuentre en una densidad estacionaria alta, desagregue dos mililitros de células mediante vortex. Luego transfiera las células bajo la sonda de inyección de muestra.

Confirme que las células están uniformemente dispersas mediante microscopía de luz. Luego, seleccione un gráfico de histograma en el software del citómetro de flujo para registrar los datos de dispersión de luz directa. Y haga clic en log para ver los datos en una escala logarítmica en el eje x.

En una salida separada, configure otro histograma con eje logarítmico para registrar la fluorescencia natural de las células de M.aeruginosa. A continuación, seleccione una fuente de luz capaz de excitar la ficocianina y un detector que pueda filtrar las emisiones provenientes de la fluorescencia resultante. Para la grabación con la máxima resolución, elija los ajustes más cercanos al tamaño del núcleo del organismo objetivo.

Y establezca una velocidad de flujo relativamente lenta. Antes de adquirir los datos, configure un umbral para excluir cualquier dispersión de la luz y señales de fluorescencia causadas por ruido electrónico de fondo o restos de la muestra celular. Luego, seleccione una nueva celda de datos.

Cree un gráfico de densidad con los parámetros de dispersión frontal y lateral en escala logarítmica, y haga clic en ejecutar. Aplique ahora la compuerta de dispersión frontal y fluorescencia natural a los datos de dispersión frontal frente a lateral para excluir cualquier señal de dispersión de bajo nivel, e incluir únicamente las señales más altas de fluorescencia relativa de ficocianina. Luego, recolecte eventos hasta que finalice la muestra, y utilice los datos para determinar el recuento inicial de células.

Para optimizar la absorción celular de la sonda molecular, exponga la mitad de la monocultura previamente preparada a las condiciones adecuadas para generar un control muerto. Revise las variaciones en el microentorno de la muestra para confirmar la muerte de la cultura. Luego, disgregue la formación de colonias como se acaba de demostrar.

A continuación, seleccione un láser de 488 nanómetros junto con un detector capaz de registrar la fluorescencia de las sondas de ácidos nucleicos verdes y anaranjadas. Y el láser de 640 nanómetros para registrar las señales de ficocianina mediante sus detectores respectivos. En una hoja de datos nueva, configure un gráfico de densidad con los parámetros de dispersión hacia adelante y dispersión lateral.

Luego, cree un histograma utilizando el canal del detector óptico del sonda molecular respectivo. Un histograma para detectar las emisiones de ficocianina y un histograma para los eventos de dispersión hacia adelante, todos en escala logarítmica. Ejecute las muestras de cianobacterias utilizando diferentes concentraciones y tiempos de incubación.

Cree una compuerta en el histograma de dispersión directa para incluir solo eventos con el tamaño celular del organismo diana. Aplíquela al canal correspondiente de la sonda fluorescente. A continuación, en el canal de la sonda fluorescente, cree otra compuerta de software inclusiva frente al pico más alto en el histograma.

y posteriormente seleccione la fluorescencia correspondiente de la sonda positiva en el gráfico de densidad. Compare el número de señales de fluorescencia con el número de células muertas del control, donde el porcentaje más alto de captación de la sonda de ácidos nucleicos no produzca tinción no específica. Para evaluar la superposición de interferencia de fluorescencia proveniente de la tinción celular intrínseca o no específica, seleccione los datos del cultivo mixto de 50 por ciento de células vivas y 50 por ciento de células muertas.

Y elimine las compuertas fluorescentes. Aplique compuertas para incluir únicamente el histograma de dispersión directa para el tamaño celular del organismo diana en el histograma del canal de ficocianina. Compuerte los picos más alto y más bajo de ficocianina, y etiquételos como «vivos» y «muertos», respectivamente.

Luego, aplique por separado las compuertas a las señales de ficocianina de células vivas y muertas. Y registre ambas longitudes de onda medias. Para determinar la sensibilidad del protocolo, calcule la relación entre las longitudes de onda medias de la fluorescencia del marcador molecular positivo para células muertas y la señal intrínseca no específica de las células vivas.

Finalmente, seleccione el protocolo optimizado en el que se haya marcado la mayor cantidad de células muertas sin la aparición de tinción no específica. En estos gráficos, se muestran las salidas representativas de dispersión de luz hacia adelante y lateral, para el tamaño celular y la complejidad interna de un cultivo por lote de M.aeruginosa en fase exponencial. La selección de la población puede realizarse refinando los datos entre ciertos puntos de la salida de dispersión de luz hacia adelante.

La ficocianina produce una señal intensa cuando se la excita con una fuente de luz roja, lo cual puede utilizarse para delimitar aún más las poblaciones de interés. A partir del dispersión de la luz hacia adelante y de las señales fluorescentes, los datos pueden entonces ser seleccionados a partir de la salida original, obteniendo datos específicos sobre la muestra de M.aeruginosa para los conteos finales de células. Cuando se mezclan controles vivos con mayor pigmentación y muertos con menor pigmentación, el desplazamiento decreciente en la autofluorescencia se vuelve evidente.

En células con membrana comprometida, las sondas de ácidos nucleicos producen una señal adicional que puede observarse mediante citometría de flujo y confirmarse además mediante microscopía de epifluorescencia. La discriminación de fluorescencia entre células vivas y muertas aumenta con el tiempo entre las concentraciones de 0,05 y 0,5 micromolares, pero disminuye entre las concentraciones de uno y 100 micromolares para ambas sondas. De hecho, la concentración óptima para la sonda verde de ácidos nucleicos parece ser de 0,5 micromolar con un tiempo de incubación de 30 minutos.

Para la sonda de ácido nucleico naranja, la concentración óptima es de un micromolar para una incubación de 10 minutos. Una vez dominado, para cada sonda molecular, la optimización puede completarse en un día, si se realiza adecuadamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener las sondas en un entorno estable, bajo las condiciones adecuadas de temperatura, pH y luz.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la microbiología exploraran la heterogeneidad comunitaria en fitoplancton. Tras ver el video, ahora debería tener una buena comprensión de cómo desarrollar un protocolo óptimo para evaluar la fisiología celular mediante citometría de flujo y sondas moleculares. No olvide que trabajar con sondas moleculares y organismos tóxicos puede ser extremadamente peligroso, y que siempre se deben tomar precauciones como usar el E.P.P. adecuado y comprender completamente los materiales COSHH al realizar este procedimiento.