Analizar el tamaño, forma y direccionalidad de las redes de astrocitos acoplados

Aquí presentamos un protocolo para evaluar la organización de redes astrocytic. El método descrito minimiza el sesgo para proporcionar medidas descriptivas de estas redes como recuento de células, el tamaño, zona y posición dentro de un núcleo. Anisotropía es evaluada con un análisis vectorial.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la organización de redes astrocíticas en las estructuras cerebrales. La principal ventaja de esta técnica es que propone un método imparcial para contar celdas de etiquetas y documentar su organización anatómica dentro de una estructura definida. Abra ImageJFIJI, seleccione el archivo deseado y haga clic en Aceptar en la ventana de opciones de importación del bioformato.

Para redefinir una pila Z que contendrá solo los sectores ópticos necesarios para la pila Z final, primero seleccione el proyecto STK y Z y, a continuación, haga clic en el mando de pila en la barra de herramientas. Seleccione intensidad máxima en la configuración del tipo de proyección. Guarde el archivo y asígnele el nombre stack file.

Si el archivo de imágenes contiene varios canales, utilice el color de la imagen y los canales divididos para mostrar solo el canal con la imagen de la red astrocítica. Compruebe la configuración de píxeles de la imagen seleccionando imagen, propiedades, píxel, con una para la dimensión de píxel. A continuación, utilice la herramienta restar fondo abriendo el proceso y restar el fondo para eliminar el etiquetado de biocytina de fondo.

Utilice la función de vista previa para establecer el radio de la bola rodante, que generalmente se establece en 50 píxeles. Si se requiere una reducción de ruido adicional después del paso de fondo de restar, seleccione el proceso, el ruido y elimine los valores atípicos. Seleccione bright en el ajuste de valores atípicos y utilice la función de vista previa para establecer el radio y el umbral.

Tenga cuidado con la herramienta eliminar valores atípicos, ya que puede desenfocar los datos, como se muestra aquí. Ajuste el umbral mediante la imagen, el ajuste, el umbral. Seleccione el modo predeterminado y los modos B y W.

Haga clic en Aplicar. Convierta la imagen en una imagen binaria con la herramienta de proceso binario seleccionando process, binary y make binary. Guarde el archivo como un archivo tiff y asígnele el nombre binario.

Para contar celdas, establezca primero el tipo de medida haciendo clic en analizar y establecer la medición. A continuación, seleccione la opción centroide. Asegúrese de que el archivo binario está abierto en pantalla.

Una vez más, abra el menú Analizar y, esta vez, seleccione analizar partículas. A continuación, seleccione mostrar y contornos. Esto genera un nuevo archivo que muestra el resultado de la detección.

Optimice los parámetros para refinar la detección. Para detectar solo celdas, utilice un valor de tamaño entre 30 y 6000, y la circularidad entre cero a uno, donde se define un círculo perfecto y cero una forma aleatoria. Ejecute la detección haciendo clic en Aceptar. Aparecerán dos tablas, un resumen de tabla titulado que proporciona el número de celdas detectadas y una tabla titulada resultados que proporciona las coordenadas X e Y de cada celda.

Copie los valores y péguelos en una aplicación de hoja de cálculo. Guarde esta tabla en la tabla de detección de nombres. También aparecerá un archivo con una gráfica de celdas detectadas.

Guarde este archivo como un archivo tiff en el archivo de detección de nombres. Si un grupo de dos o más celdas etiquetadas se detectan como una sola celda con la herramienta Analizar partículas, utilice la herramienta Cuenca hidrográfica de la imagen binaria seleccionando proceso, binario y cuenca hidrográfica antes de aplicar la herramienta Analizar partículas. Para medir el área de superficie de las redes, utilice el archivo de detección en ImageJ.

Haga clic con el botón izquierdo del ratón para seleccionar la herramienta de selección de polígonos en la barra de herramientas. Haga clic izquierdo de nuevo para comenzar a trazar una región de interés, o ROI, que conecta todas las celdas ubicadas en la periferia externa de la red. Haga clic con el botón derecho para cerrar el polígono.

Abra la ventana de medición establecida y seleccione la opción de área. A continuación, abra el gestor de ROI y agregue el polígono rastreado en el gestor de ROI haciendo clic en agregar. Ejecute la medición haciendo clic en medir en el administrador de ROI.

La medida de área aparecerá en una tabla y se expresará en píxeles. No olvide convertir este valor con un factor de conversión para el microscopio utilizado para obtener el valor en micrómetros cuadrados. Abra el archivo de pila en ImageJFIJI e identifique la celda parcheada con su intensidad de etiquetado más fuerte.

A continuación, abra el archivo denominado tabla de detección en una aplicación de hoja de cálculo y busque el número asociado con la celda parcheada y sus coordenadas correspondientes. Si no puede determinar con precisión la celda parcheada, utilice la herramienta poligonal para rodear el área donde el depósito de biocytina es más denso y refiérase a esta posición como la de la celda parcheada. Utilice el administrador de ROI como antes para dibujar un ROI en la ubicación de la celda parcheada y agregarlo al administrador de ROI.

A continuación, establezca la medida y seleccione la opción centroide. En el gestor de RIO, haga clic en medir para obtener las coordenadas del centroide del área trazada. Utilice estas coordenadas como punto de referencia para esta red específica.

Utilice esta fórmula para calcular las coordenadas de cada celda en referencia al astrocito parcheado. Expresar las coordenadas de cada celda en referencia al astrocito parcheado es un paso importante para calcular el vector a partir de los astrocitos parcheados. Utilice esta fórmula para calcular las coordenadas del vector principal de orientación preferencial.

El vector principal de orientación preferencial de la red es la suma de todos los vectores calculados previamente para cada celda compuesta en la red. Divida la longitud del vector principal por el número de celdas de la red, menos una para excluir la celda parcheada, para normalizar los valores y habilitar las comparaciones entre redes. Para determinar la posición de cada red en el núcleo de interés, primero abra la imagen de cuatro x con un editor de imágenes vectoriales.

Multiplique las dimensiones de la ventana de dimensión por cinco para aumentar el tamaño de la imagen de cuatro x. Aquí, la imagen se muestreó a 800 por 800 píxeles, por lo que la resolución de muestreo se cambia a 4000 por 4000 píxeles. Exporte el archivo en formato tiff y asígnelo el nombre de cuatro x.

Alinee la esquina superior izquierda de la imagen de cuatro x redimensionada con la esquina inferior izquierda del documento de Adobe Illustrator. El software proporciona coordenadas desde un punto referencial de la esquina inferior izquierda. Abra la imagen de 20 x de la red.

Utilice el archivo binario o el archivo de detección porque son más fáciles de alinear. A continuación, juegue con la herramienta de opacidad en el archivo binario de la imagen de 20 x para alinearla con la imagen de cuatro x redimensionada. Una vez completada la alineación, seleccione y mantenga presionada la herramienta de pipeta para que aparezca la herramienta de medición y selecciónela en la barra de herramientas izquierda.

Utilice la herramienta de medición para hacer clic en la esquina superior izquierda de la imagen de 20 x para obtener las coordenadas del punto referencial de 20 x en la imagen de cuatro x redimensionada. Estas coordenadas referenciales de 20 x son útiles para expresar la posición de cada red en un dibujo esquemático del núcleo. Para resumir los datos, se utiliza la normalización del núcleo como rectángulo.

Para ello, utilice la herramienta poligonal para rodear el núcleo en la imagen de cuatro x redimensionada. A continuación, abra el gestor de ROI y agregue el ROI dibujado. Utilice la imagen con luces transparentes si no se pueden ver los bordes del núcleo, en cuyo caso recuerde cambiar su tamaño primero.

En la medición de conjunto, seleccione la opción rectángulo delimitador para calcular el rectángulo más pequeño dentro del núcleo dibujado. Por último, haga clic en medir y, a continuación, siga los pasos del protocolo escrito para expresar las coordenadas de celda etiquetadas en un núcleo normalizado representado por el rectángulo delimitador. Un solo astrocito en la parte dorsal del núcleo sensorial principal trigémino, etiquetado por SR101, fue dirigido para el registro de células enteras y lleno de 0.2%biocytina.

La estimulación eléctrica del quinto tracto aumentó el etiquetado de biocytina en la parte dorsal del núcleo sensorial principal trigémino, lo que representa un aumento en el número de células acopladas. Las redes astrocíticas permanecen confinadas dentro de la parte dorsal del núcleo sensorial principal trigémino y su orientación principal. Esta técnica fue desarrollada para posicionar redes astrocíticas dentro de una estructura definida, pero se puede utilizar para expresar la posición de la población de células etiquetadas en cualquier estructura.