Name: Extracción de cafeína, la actividad enzimática y la expresión del gen de la sintasa de cafeína de suspensiones celulares de plantas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Aprende a extraer y cuantificar cafeína en suspensiones celulares de C. arabica L. y evalúa la actividad enzimática de la sintasa de cafeína. Este método facilita el estudio de la biosíntesis de metabolitos secundarios en plantas.

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El trabajo de nuestro laboratorio fue financiado por una subvención de la Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT 219893) a Smiths. Esta investigación también fue apoyada por una beca otorgada a RJPK (núm. 37938) por CONACyT y el Sistema Nacional de Investigadores (4422). Los autores agradecen CIATEJ para el uso de sus instalaciones durante la escritura de este manuscrito. Especial agradecimiento se extiende a Dr. Víctor Manuel González Mendoza para todas las recomendaciones en la sección de biología molecular y Valentín Mendoza Rodríguez, IFC, UNAM por las facilidades durante la filmación de este artículo.

1. la cafeína extracción en suspensiones celulares de C. arabica L.
<ol><li>Uso de suspensiones de células de C. arabica 9. Mantener las suspensiones quincenales subcultivos en un medio Murashige y Skoog a pH 4.3 con constante 100 rpm de agitación a 25 ° C bajo luz continua (8,3 W/m2).</li>
	<li>Cosecha de las células debajo de filtración de vacío utilizando papel de filtro de poro de 11 μm y un embudo de Buchner.</li>
	<li>Registrar el peso fresco de las células colectadas usando una escala, envuelva en papel aluminio, congelar en nitrógeno líquido y mantenerlos a-80 ° C hasta su análisis.</li>
	<li>Liofilizar el material celular congelado durante 72 h.</li>
	<li>Registrar el peso de las células liofilizadas para estimar el rendimiento del peso seco.</li>
	<li>Almacenar el material en polvo en bolsas de polietileno reutilizables (9 cm x 7,5 cm). Macerar el material a un polvo fino y guárdelo en un desecador hasta su uso.</li>
	<li>Medir 0.5 g de materia seca de celular en la balanza analítica y agregar a un matraz de vidrio (25 mL).<ol>
<li>Añadir 10 mL de acetona a las células liofilizadas y mezclar en un vórtex durante 30 s de homogeneización. Luego, sellar el frasco con papel de aluminio.</li>
		<li>La mezcla a 100 rpm usando un agitador a temperatura ambiente (25 ° C) durante 5 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transferir todo el material a un tubo cónico de 15 mL y centrifugar a 13.000 x g durante 10 minutos traspaso el líquido a un tubo nuevo de la fase y reducir a él sequedad a temperatura ambiente en la campana.</li>
	<li>Resuspender la muestra con 25 μl de acetona.</li>
</ol>2. condiciones para la evaluación de cafeína por delgada capa de cromatografía (TLC)-densitometría
<ol><li>1 μl del extracto de cafeína previamente resuspendido se aplican a la fase estacionaria. Nota: las placas de gel de sílice (F254) se utilizan como la fase estacionaria. Antes de aplicar las muestras, las placas se desarrollaron con 10 mL de Cloroformo-metanol [9:1 v/v] en una cámara de cromatografía (14 cm x 12 cm x 9.5 cm), y las placas se secaron a temperatura ambiente. Las características de la placa cromatográfica donde se aplican las muestras se muestran en la figura 1. La cámara se saturó por 30 min con solvente antes de desarrollar la placa. Placas de TLC deben manipular usando guantes para evitar la contaminación.</li>
	<li>Desarrollar el TLC en la cámara de cromatografía con 10 mL de la fase móvil ciclohexano-acetona [40:50 v/v]. Nota: Esta mezcla permite la separación de la cafeína en un factor de retención (Rf) de 0.34.<ol>
<li>Retire la placa de TLC de la cámara y dejarla secar completamente a temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Visualizar bandas de cafeína en la luz ultravioleta de longitud de onda corta (Ultravioleta, 254 nm). Utilice una lámpara de UV compactada. Además, para este paso, uso gafas con protección UV.</li>
	<li>Cuantificar los niveles de cafeína por densitometría en 273 nm. El instrumento es controlado con el software de cromatografía.</li>
</ol>3. ácido ribonucleico (ARN) aislamiento
<ol><li>Tomar las suspensiones de células de paso 1.1 y vacío filtrado con papel de filtro (tamaño de poro de 11 μm).</li>
	<li>Recoger el material celular del papel de filtro, pesar 0.5 g de material celular en una balanza analítica y envuélvalo en papel de aluminio. Congelación de la muestra con líquido N2.</li>
	<li>Macerar la muestra de células en un mortero de porcelana con nitrógeno líquido y añadir 1 mL de reactivo de aislamiento de RNA hasta homogeneizada. Nota: se deben esterilizar los morteros de porcelana en un horno a 300 ° C por 6 h. RNA aislamiento reactivo contiene isotiocianato de guanidina, fenol y otros componentes.<ol>
<li>Transferir 500 μl de la muestra a un tubo de microcentrífuga estéril (1,5 mL). Añadir 300 μL de cloroformo-isoamyl alcohol (24:1) y 300 μL de fenol equilibrado (pH 8.0).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mezclar la muestra con un mezclador de tipo vórtex y luego lo Centrifugue a 20.000 x g durante 15 min a 4 ° C.</li>
	<li>Transferir 300 μL de la fase superior a un tubo de microcentrífuga. Añadir 200 μL de isopropanol. Incubar el tubo por 1 h a-20 ° C.</li>
	<li>Centrifugar el tubo a 12.000 x g durante 10 min a 4 ° C y luego decantar la fase líquida.<ol>
<li>Añadir 1 mL de etanol (70%) para formar un pellet en el tubo. Centrifugar a 12.000 x g durante 10 minutos y decantar. Repita este paso dos veces.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Secar la muestra durante 1,5 h a temperatura ambiente (25 ° C). Agite el extracto de RNA con 25 μL de dietil pirocarbonato (DEPC)-agua tratada. Nota: Para la extracción de RNA, use agua tratada con DEPC 0.1% v/v.</li>
</ol>4. incubación de transcripción de ARN con desoxirribonucleasa (DNasa)
<ol><li>En un tubo de microcentrífuga estéril, agregar Extracto de 2 μg de ARN total. Añadir 1 μL de tampón de reacción de 10 x (100 mM Tris-HCl 25 mM MgCl2, 1 mM CaCl2). Añadir 1 μL de DNasa U/μL 1.<ol>
<li>Llevar la reacción hasta un volumen final de 10 μL con agua tratada con DEPC. Mezcle la muestra y centrifugar brevemente a 2.000 x g durante 1 minuto.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubar la muestra a 37 ° C durante 30 minutos.</li>
	<li>Detener la reacción con la adición de 1 μL de 50 mM disódica, dihidrato ethylenediaminetetraacetate (Na2EDTA) e incubar la muestra a 65 ° C durante 10 minutos.</li>
	<li>Análisis de la integridad del ARN por electroforesis en gel de agarosa.<ol>
<li>Preparar un estándar del gel de agarosa al 1% y tinción con 1 μl de 3 x intercalando solución de tinción de ácido nucleico.</li>
		<li>Aplicar 500 ng de ARN a la agarosa gel y correr el gel.</li>
		<li>Visualizar la integridad del RNA usando un sistema de documentación de foto de gel.</li>
		<li>Uso el RNA como plantilla para síntesis de cDNA por la transcriptasa inversa.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. como complemento del ácido desoxirribonucléico (cDNA) síntesis
<ol><li>Añadir 2,5 μg de RNA total a un tubo de microcentrífuga. Añadir 1 μL de cebador oligo-deoxythymine (dT) y llenar el tubo hasta un volumen final de 13 μL con agua libre de nucleasa. Mezcle la muestra y luego centrifugar a 2.000 x g durante 1 minuto.</li>
	<li>Incubar la muestra a 65 ° C por 5 min y luego a 4 ° C por 2 min.</li>
	<li>Añada 4 μL de 5 x buffer de reacción para la transcriptasa reversa, 2 μL de mezcla de Deoxinucleótidos trifosfatos (dNTPs) (10 mM de cada dNTP) y 1 μL de transcriptasa reversa (200 U/μL). Mezclar suavemente y centrifugar a 2.000 x g durante 1 minuto.</li>
	<li>Incubar la muestra a 45 ° C durante 50 minutos y luego a 70 ° C durante 10 minutos.</li>
	<li>Cuantificar la concentración de cDNA utilizando un espectrofotómetro UV.</li>
	<li>Utilice el cDNA como plantilla para la reacción en cadena de polimerasa (PCR). Nota: Se utilizó el buffer de reacción 10 x (paso 4.1.1) y 5 veces x concentraron (paso 5.3), respectivamente.</li>
</ol>6. en tiempo real PCR cuantitativa (qPCR) para amplificar el gen ECC1
<ol><li>Añadir 7,5 μL de Taq ADN polimerasa 2 x (0,1 U/mL) y 0.1 μM de 5-carboxi-X-rodamina (ROX) a un tubo de microcentrífuga PCR. Nota: El hot start Taq ADN polimerasa 2 x fue utilizado como una solución 2 x concentrado.<ol>
<li>Añadir 5 μL de agua libre de nucleasa.</li>
		<li>Añadir 0,75 μL de 10 μM hacia adelante y hacia atrás la cartilla para amplificar el gen ECC1 (AB086414) (forward: 5'-CCTGTATCCTGCGATGAACA-3' y hacia atrás: 5'-AACACTATCATAGAAGCCTTTG-3'). Usar primers de tubulina como el gen de mantenimiento de la casa en una reacción independiente (adelante: 5'-GTGCCCAACTGGGTTCAA-3' y hacia atrás: 5'-CCTTCCTCCATACCTTCACC-3')9.</li>
		<li>Agregar 600 ng de plantilla de cDNA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realizar la reacción de amplificación a 50 ° C por 2 min y 95 ° C por 5 min incuban la reacción en el sistema PCR en tiempo real durante 40 ciclos de 95 ° C por 30 s, 60 ° C durante 30 s y 72 ° C por 30 s.</li>
	<li>Incubar la muestra a 50 ° C para 30 s y 20 ° C durante 10 s.</li>
	<li>Analizar los datos con el software PCR.</li>
	<li>Calcular la expresión relativa de la 2-ΔΔCT método descrito por Livak y Schmittgen (2001)12. Nota: Analizar una reacción de control que contiene todos los componentes excepto la plantilla de la DNA (sin control de plantilla, NTC) reactivos de desecho contaminado o cartilla-dímeros de amplificación.</li>
</ol>7. total extracto proteico de suspensiones celulares de C. arabica L.
<ol><li>Suspensiones celulares de filtro al vacío con un papel de filtro de poro mediano.</li>
	<li>Pesar 1 g de material celular y envuélvalo en papel de aluminio.<ol>
<li>Congelación de la muestra con nitrógeno líquido. Macerar la muestra en un mortero esterilizado porcelana hasta obtener un polvo fino.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transferir la muestra a un frasco de vidrio y agregar 2,5 mL de tampón de extracción (400 mM tris (hidroximetil) aminometano clorhidrato (Tris-HCl), a pH 8.0, que contienen β-mercaptoetanol de 10 mM, 5 mM Na2EDTA y ascorbato de sodio 0.5% (p/v).<ol>
<li>Mezclar la muestra en un vórtex durante 2 minutos. Nota: Es importante que la muestra se mantiene en hielo para evitar la desnaturalización de la proteína.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifugar la muestra a 20.000 x g durante 20 min a 4 ° C y transvasar 500 μL en frascos criogénicos (2 mL). Almacenar las muestras a-72 ° C hasta su uso.</li>
	<li>Medir la concentración de proteína de la muestra a 562 nm en un espectrofotómetro usando análisis ácido bicinchoninic con albúmina sérica bovina como estándar.</li>
</ol>8. ensayo enzimático para la cafeína sintasa
<ol><li>Preparar una mezcla de reacción en un tubo de microcentrífuga que contiene 200 μm SAM, 4.07 kBq de metilo [3H]-SAM 200 teobromina μm, 200 μm MgCl2y cafeína 5 μm. Aumentar el volumen a 200 μL con 100 mM Tris-HCl a pH de 8.0.</li>
	<li>Mantenga el tubo de microcentrífuga en hielo y añadir un volumen de la fracción soluble contiene 7-9 mg de proteína. Luego, mezclar por vortex e incubar durante 30 min a 30 ° C en un baño termostático/circulador. Para un lote de varias muestras, incubar cada muestra por duplicado en períodos de 1 min para dar tiempo suficiente para parar las reacciones para todas las muestras en un período de tiempo exacto de 30 minutos.<ol>
<li>Añadir 1 mL de cloroformo para detener la reacción y luego agitar la muestra con un mezclador de tipo vórtex. Agite la muestra usando un mezclador de tipo vórtex durante 3 minutos para eliminar la cafeína radiactiva en el solvente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifugar las muestras a 11.000 x g durante 5 minutos y con cuidado recuperar un volumen de 900 μl. Luego, se transfieren las muestras a viales de centelleo.</li>
	<li>Evaporar el cloroformo para completar sequedad en la campana a temperatura ambiente a 25 ° C. Añadir 5 mL de líquido de centelleo para el vial y mezclar la muestra.</li>
	<li>Analizar la radiactividad incorporada en la cafeína en un contador de centelleo.</li>
</ol>

<ol><li>Ferruzzi, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+beverage+composition+on+delivery+of+phenolic+compounds+from+coffee+and+tea%5BTitle%5D)+AND+%22Physiolgy+%26+Behavior%22%5BJournal%5D)">The influence of beverage composition on delivery of phenolic compounds from coffee and tea.</a> Physiolgy & Behavior. 100 (1), 33-41 (2010).</li>
<li>Majhenič, L., Škerget, M., Knez, Ž <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0308814607001422">Antioxidant and antimicrobial activity of guarana seed extracts.</a> Food Chemistry. 104 (3), 1258-1268 (2007).</li>
<li>Sledz, W., Los, E., Paczek, A., Rischka, J., Motyka, A., Zoledowska, S., Lojkowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibacterial+activity+of+caffeine+against+plant+pathogenic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochimica+Polonica%22%5BJournal%5D)">Antibacterial activity of caffeine against plant pathogenic bacteria.</a> Acta Biochimica Polonica. 62 (3), 605-612 (2015).</li>
<li>Lipton, R. B., Diener, H. C., Robbins, M. S., Garas, S. Y., Patel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caffeine+in+the+management+of+patients+with+headache%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Headache+and+Pain%22%5BJournal%5D)">Caffeine in the management of patients with headache.</a> Journal of Headache and Pain. 18 (1), 1-11 (2017).</li>
<li>De Mejia, E. G., Ramirez-Mares, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+caffeine+and+coffee+on+our+health%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Impact of caffeine and coffee on our health.</a> Trends in Endocrinology & Metabolism. 25 (10), 489-492 (2014).</li>
<li>Uefuji, H., Tatsumi, Y., Morimoto, M., Kaothien-Nakayama, P., Ogita, S., Sano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caffeine+production+in+tobacco+plants+by+simultaneous+expression+of+three+coffee+N-methyltrasferases+and+its+potential+as+a+pest+repellant%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Caffeine production in tobacco plants by simultaneous expression of three coffee N-methyltrasferases and its potential as a pest repellant.</a> Plant Molecular Biology. 59 (2), 221-227 (2005).</li>
<li>Denoeud, F., Carretero-Paulet, L., Dereeper, A., Droc, G., Guyot, R., Pietrella, M., Aury, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+coffee+genome+provides+insight+into+the+convergent+evolution+of+caffeine+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The coffee genome provides insight into the convergent evolution of caffeine biosynthesis.</a> Science. 345 (6201), 1181-1184 (2014).</li>
<li>Kurata, H., Matsumura, S., Furusaki, S. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168945296045888">Light irradiation causes physiological and metabolic changes for purine alkaloid production by a Coffea arabica cell suspension culture.</a> Plant Science. 123 (1-2), 197-203 (1997).</li>
<li>Pech-Kú, R., Muñoz-Sánchez, J. A., Monforte-González, M., Vázquez-Flota, F., Rodas-Junco, B. A., González-Mendoza, V. M., Hernández-Sotomayor, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+aluminum+stress+and+caffeine+biosynthesis+in+suspension+cells+of+Coffea+arabica+L%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inorganic+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Relationship between aluminum stress and caffeine biosynthesis in suspension cells of Coffea arabica L.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 181, 177-182 (2018).</li>
<li>Huang, R., O'Donnell, A. J., Barboline, J. J., Barkman, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergent+evolution+of+caffeine+in+plants+by+co-option+of+exapted+ancestral+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Convergent evolution of caffeine in plants by co-option of exapted ancestral enzymes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (38), 10613-10618 (2016).</li>
<li>Mizuno, K., Okuda, A., Kato, M., Yoneyama, N., Tanaka, H., Ashihara, H., Fujimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+new+dual-functional+caffeine+synthase+gene+encoding+an+enzyme+for+the+conversion+of+7-methylxanthine+to+caffeine+from+coffee+%28Coffea+arabica+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Isolation of a new dual-functional caffeine synthase gene encoding an enzyme for the conversion of 7-methylxanthine to caffeine from coffee (Coffea arabica L.).</a> FEBS letters. 534 (1-3), 75-81 (2003).</li>
<li>Kato, M., Mizuno, K., Fujimura, T., Iwama, M., Irie, M., Crozier, A., Ashihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+caffeine+synthase+from+tea+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of caffeine synthase from tea leaves.</a> Plant Physiology. 120 (2), 579-586 (1999).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Method%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Method. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Kurata, H., Achioku, T., Furusaki, S. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141022998000817">The light/dark cycle operation with an hour-scale period enhances caffeine production by Coffea arabica cells.</a> Enzyme and Microbial Technology. 23 (7-8), 518-523 (1998).</li>
<li>Sartor, R. M., Mazzafera, P. <a target="_blank" href="http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1516-89132000000100009">Caffeine formation by suspension cultures of Coffea dewevrei.</a> Brazilian Archives of Biology Technology. 43 (1), 1-9 (2000).</li>
<li>Koshiro, Y., Zheng, X. Q., Wang, M. L., Nagai, C., Ashihara, H. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168945206000963">Changes in content and biosynthetic activity of caffeine and trigonelline during growth and ripening of Coffea arabica and Coffea canephora fruits.</a> Plant Science. 171 (2), 242-250 (2006).</li>
<li>Schimpl, F. C., Kiyota, E., Mayer, J. L. S., de Carvalho Gonçalves, J. F., da Silva, J. F., Mazzafera, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+biochemical+characterization+of+caffeine+synthase+and+purine+alkaloid+concentration+in+guarana+fruit%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular and biochemical characterization of caffeine synthase and purine alkaloid concentration in guarana fruit.</a> Phytochemistry. 105, 25-36 (2014).</li>
<li>Perrois, C., Strickler, S. R., Mathieu, G., Lepelley, M., Bedon, L., Michaux, S., Privat, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+caffeine+metabolism+in+Coffea+arabica+%28Arabica%29+and+Coffea+canephora+%28Robusta%29%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of caffeine metabolism in Coffea arabica (Arabica) and Coffea canephora (Robusta).</a> Planta. 241 (1), 179-191 (2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí presentamos las condiciones óptimas para evaluar el contenido de cafeína, niveles de actividad y transcripción de CS en una en vitro planta de cultivo de tejidos, tales como suspensiones celulares de C. arabica. Informes anteriores han confirmado que las células manteniendo bajo irradiación de la luz y en presencia de teobromina en el medio de cultivo son los parámetros adecuados para incrementar el nivel de cafeína, lo que es posible evaluar los métodos de separación de la cafeína utilizando croma...

La cafeína es un metabolito secundario que es biosynthesized por plantas del género Coffea1. Este alcaloide pertenece a la familia de metilxantinas y es considerada como una defensa química de la planta porque puede actuar contra los efectos adversos de agentes patógenos y herbívoros2,3. Además, este metabolito es responsable de las propiedades estimulantes de la bebida de café, que es consumido en todo el mundo4,5. Debido a sus propiedades, diversos grupos de investigación están interesados en el estudio de la vía biosintética y catabolismo de cafeína6,7. Actualmente, cultivos de vegetales en vitro de la célula y tejidos sirven como una alternativa para evaluar la acumulación de cafeína en diferentes estrategias bióticos y abióticos8,9.
Biosíntesis de la cafeína implica la liberación hidrolítica de 7-metilxantina de la nucleósido ribosa correspondiente seguido de orden N-metilaciones en las posiciones 3 y 1. Una específico S- adenosil metionina (SAM)-dependiente N-metiltransferasa (NMT) cataliza la metilación en la posición 7, considerando que la teobromina sintasa (TS) y CS están implicados en las metilaciones 3 y 1, respectivamente, produciendo teobromina y cafeína. El estudio de genes que codifican distintos territorios no metropolitanos ha permitido entender el mecanismo que regula la producción de cafeína10,11. CS, que tiene N -methyltransferase actividad, cataliza los dos últimos pasos de la vía biosintética del cafeína11. En plántulas de cafeto, se ha demostrado que la radiación de la luz puede aumentar actividad de la CS, que se traduce en un aumento en la biosíntesis de la cafeína. Recientemente, demostró que el mantenimiento de suspensiones celulares de C. arabica L. bajo irradiación de la luz es la condición óptima para la evaluación de los efectos que producen los factores de estrés abióticos que afectan la vía biosintética del cafeína8. La información obtenida en estos estudios puede tener aplicaciones en la biología ingeniería y sistemas metabólica para maximizar el estudio de la vía biosintética de la cafeína en estos sistemas in vitro .
Dadas las ventajas de obtener un modelo adecuado para el estudio de la biosíntesis de la cafeína, hemos optimizado las condiciones de extracción de la cafeína en suspensiones celulares de C. arabica L. También fue posible desarrollar un protocolo útil para el estudio de la actividad enzimática así como los pasos metodológicos para evaluar el nivel de las transcripciones del gene del synthase del cafeína de Coffea 1 (ECC1) codificación de esta enzima. Adjunto, Divulgamos un protocolo para extraer y cuantificar cafeína en suspensiones celulares de C. Arábica por cromatografía en capa fina y densitometría (TLC-densitometría).

<table><tbody><tr><td>Murashige & Skoog Mezcla de sales basales</td><td>Laboratorios de Fitotecnología</td><td>M524</td><td>Tamaño del paquete: 50 L <fuerte>Reactivo (mg/L) </fuerte> Nitrato de amonio (1650) Ácido bórico (6.2) Cloruro de calcio, anhidro (322.2) Cloruro de cobalto&bull; H2O (0.025) Sulfato cúprico&toro; 5H2O (0.025) Na2EDTA&bull; 2H2O (37.26) Sulfato ferroso&toro; 7H2O (27.8) Sulfato de magnesio, anhidro (180.7) Sulfato de manganeso&bull; H2O (16.9) Ácido molibdico (sal sódica)&bull; 2H2O (0,25) Yoduro de potasio (0,83) Nitrato de potasio (1900) Fosfato de potasio, monobásico (170) Sulfato de zinc&bull; 7H2O (8.6) <fuerte>Suplementado con </fuerte> mioinositol (100) tiamina (10) cisteína (25) sacarosa (30000) ácido 2,4-diclorofenoxiacético (3) 6-bencilamina purina (1)</td></tr><tr><td>Cafeína</td><td>SIGMA</td><td>C0750-5G</td><td>STANDARD-5g</td></tr><tr><td>Teobromina</td><td>SIGMA</td><td>T4500</td><td>20 g</td></tr><tr><td>CAMAG TLC Scanner-4</td><td>CAMAG</td><td>27.62</td><td></td></tr><tr><td>WinCATS Software Administrador de cromatografía plana</td><td>CAMAG</td><td>1.4.10</td><td>Software</td></tr><tr><td>Alcohol isoamílico (24:1)</td><td>SIGMA</td><td>C-0549</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Ciclohexano</td><td>JALMEX</td><td>C4375-13</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Acetona</td><td>J.T. BAKER</td> 900643 <td></td><td>4 L</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>J.T. BAKER</td><td>9093-03</td><td>4 L</td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>JALMEX</td><td>C-4425-15</td><td>3.5 L</td></tr><tr><td>TLC gel de sílice 60 F254</td><td>Merck</td><td>1.05554.0001</td><td>Placa TLC</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>M6250</td><td>SIGMA</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>(+)-L-ascorbato de sodio</td><td>A4034</td><td>SIGMA</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>SIGMA</td><td>T6066</td><td>1 Kg</td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico 36.5-38%</td><td>J.T. Baker</td><td>9535-05 Kit de ensayo de</td> proteínas Pierce BCA de <td>2,5 L</td></tr><tr><td>Kit</td>de <td>232227</td><td></td><td>termocientífico</td></tr><tr><td>Metilo [3H]-S-adenosil metionina</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET155</td><td>Actividad específica de 15 Ci/mmol</td></tr><tr><td>Viales de centelleo líquido</td><td>SIGMA</td><td>Z253081</td><td></td></tr><tr><td>Baño/circulador termostático</td><td>Cole Parmer</td><td>60714</td><td></td></tr><tr><td>Tubo</td> <td>de microcentrífugaEppendorf</td><td></td><td>Tubo de 1,5 mL</td></tr><tr><td>Viales criogénicos</td><td>Heathrow Scientific</td><td>HS23202A</td><td>2</td></tr><tr><td>mL Centrífuga 5804</td><td>Eppendorf</td><td>5804 000925</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Thermolyne</td><td>LR 5947</td><td></td></tr><tr><td>Mortero de porcelana</td><td>Fisherbrand</td><td>FB961B</td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro</td><td>Whatman</td><td>Z274844</td><td>Medio</td></tr> <tr><td>de porosidadPicofuge</td><td>Stratagene</td><td>400550</td><td>2000 x g</td></tr><tr><td>Balanza analítica</td><td>Y</td><td>HR-120</td><td>Modelo HR-120</td></tr><tr><td>Contador de centelleo</td><td>Beckman Coulter</td><td>6500</td><td></td></tr><tr><td>Gel sistema de fotodocumentación</td><td>Bio-Rad</td><td>Chemic XRS</td><td>Modelo Chemic XRS</td></tr><tr><td>Lámpara UV compacta</td><td>UVP</td><td>95002112</td><td>UVGL-25</td></tr><tr><td>Scienceware HDPE Embudo Buchner</td><td>SIGMA</td><td>2419907</td><td>Tipo 37600</td></tr><tr><td>mezclador TRIzol reactivo</td><td>Thermo scientific</td><td>15596-018</td><td>200 mL</td></tr><tr><td>ReverdAid Transcriptasa inversa</td><td>Thermo scientific</td><td>#EP0441</td><td>10000 U</td></tr><tr><td>Oligo (dT)18 primer</td><td>Thermo scientific</td><td>#S0131</td><td>100 &micro; M</td></tr><tr><td>DNasa I, sin RNasa</td><td>Thermo scientific</td><td>#EN0525</td><td>1000 U</td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>Thermo scientific</td><td>EN0525</td><td>1,25 mL</td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético</td><td>Thermo scientific</td><td>EN0525</td><td>1 mL</td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>Thermo scientific</td><td>R0191</td><td>R0191</td></tr><tr><td>SYBR Green qPCR Master Mix (2X)</td><td>Thermo scientific</td><td>K0251</td><td>Para 200 reacciones de 25 &micro; L</td></tr><tr><td>PikoReal</td><td>Thermo scientific</td><td>2.2</td><td>Software</td></tr><tr><td>Fenol, pH 8.0, equilibrado, Grado de biología molecular, Ultrapuro</td><td>USB</td><td>J75829</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Alcohol isopropílico</td><td>Karal</td><td>2040</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Alcohol etílico</td><td>SIGMA</td><td>64175</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Pirocarbonato de dietilo</td><td>SIGMA</td><td>D5758</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Rotador de laboratorio</td><td>LW Científico</td><td>Mod. LW210</td><td></td></tr></tbody></table>

extracción de cafeína, la actividad enzimática y la expresión del gen de la sintasa de cafeína de suspensiones celulares de plantas

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Cafeína (1,3,7-trimetilxantina) es un alcaloide de purinas presente en bebidas populares como el café y té. Este metabolito secundario es considerado como una defensa química ya que tiene actividad antimicrobiana y es considerado un insecticida natural. La cafeína también puede producir efectos negativos alelopáticos que impiden el crecimiento de las plantas circundantes. Además, personas de todo el mundo consuman cafeína por sus efectos analgésicos y estimulantes. Debido al interés en las aplicaciones tecnológicas de la cafeína, ha crecido la investigación sobre la vía biosintética de este compuesto. Estos estudios se han centrado principalmente en la comprensión de los mecanismos bioquímicos y moleculares que regulan la biosíntesis de la cafeína. Cultivo de tejidos in vitro se ha convertido en un sistema útil para el estudio de este camino biosintético. Este artículo describe un protocolo paso a paso para la cuantificación de cafeína y de medición de los niveles de transcripción del gen (ECC1) codificación cafeína sintasa (CS) en suspensiones celulares de C. arabica L., así como su actividad.

Extractos de cafeína obtenidos mediante el proceso aquí presentado fueron analizados por TLC-densitometría sometiendo las muestras para la placa de cromatografía de acuerdo con el esquema mostrado en la figura 1. Para cuantificar los niveles de cafeína en los extractos de la célula, una curva con diferentes concentraciones del estándar comercial para este compuesto fue utilizado (figura 2A). Se analizó el patrón de absorción de l...

Este protocolo describe una metodología eficiente para la extracción y cuantificación de cafeína en suspensiones celulares de C. arabica L. y un proceso experimental para la evaluación de la actividad enzimática de la cafeína sintasa con el nivel de expresión de el gen que codifica esta enzima.

Extracción de cafeína, la actividad enzimática y la expresión del gen de la sintasa de cafeína de suspensiones celulares de plantas

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la química analítica, la bioquímica y la biotecnología. Por ejemplo, ¿cuáles son los cambios que se producen en la biosíntesis de cafeína. La principal ventaja de esta técnica, es que se puede aplicar a modelos de plantas invitro que produce cafeína.Para comenzar, agregue 10 mililitros de acetona a las células liofilizadas, y selle el matraz antes de mezclarlo con el mezclador de vórtice durante 30 segundos. A continuación, mezcle la muestra a 100 rpm con un rotador durante cinco horas a temperatura ambiente. Después de esto, vuelva a suspender la muestra con 25 microlitros de acetona.En primer lugar, aplicar un microlitro del extracto de cafeína previamente preparado en las placas de gel de sílice. A continuación, desarrollar el TLC en la cámara de cromatografía con 10 mililitros de la fase móvil, acetona de ciclohexano. Visualice las bandas de cafeína en longitud de onda corta ultravioleta, con una lámpara UV compacta.Después de esto, cuantificar los niveles de cafeína por densitometría a 273 nanómetros. Con papel de filtro, filtre al vacío la suspensión celular previamente preparada. A continuación, utilice un

caffeine-extraction-enzymatic-activity-gene-expression-caffeine

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Ensayo β-amiloide toxicidad con un transgénico C. elegans Modelo

Se describe un método de bajo costo, de alto rendimiento para la detección de hongos en la actividad...

Cribado de alto rendimiento de la actividad endoglucanasa por hongos en Escherichia coli</em

Fuente: Rufián, J. S., et al. Análisis unicelular de la expresión de genes de Pseudomonas syringae en el tejido vegetal. J. Vis. Exp. (2022).Este vídeo demuestra un método para analizar la expresión génica en bacterias patógenas extraídas de plantas a nivel unicelular utilizando un factor de transcripción marcado con fluorescencia. La imagen confocal revela heterogeneidad en la expresión génica de virulencia, destacando la diversidad funcional dentro de una población bacteriana clonal.

Análisis de una sola célula de la expresión génica de patógenos extraídos por plantas

El reloj circadiano regula alrededor de un tercio del transcriptoma de Arabidopsis, pero el porcentaje de genes que se alimentan de nuevo en la hora normal permanece desconocida. Aquí visualizamos un método para evaluar rápidamente los fenotipos circadianos en cualquier línea mutante de Arabidopsis utilizando imágenes luminiscentes de un reportero circadiano transitoriamente expresada en protoplastos.

Análisis rápido de los fenotipos circadianos en Arabidopsis protoplastos transfectadas con un reloj luminiscentes Reportero

Este artículo presenta un método para la detección y cuantificación de ácidos orgánicos a partir de material vegetal utilizando electroforesis capilar zonal libre. Un ejemplo de la aplicación potencial de este método, la determinación de los efectos de una fermentación secundaria en los niveles de ácido orgánicos en semillas de café, se proporciona.

Utilizando electroforesis capilar para cuantificar ácidos orgánicos a partir de Tejidos Vegetales: Un caso de prueba del examen<em&gt; Coffea arabica</em&gt; Semillas

Competencia metabólica de los sistemas in vitro es un requisito clave para la biotransformación y la disposición de fármacos y sustancias tóxicas. En este protocolo, se describe la aplicación de sondas metabólicos de referencia para evaluar la fase I metabolismo en cultivos celulares.

La espectrometría de masa y enfoques basados ​​en luminogénico para caracterizar la fase I metabólico de Competencia<em&gt; In Vitro</em&gt; Cultivos Celulares

Este trabajo presenta un protocolo para establecer un cultivo de suspensión celular derivado del té (Camellia sinensis L.) hojas que se pueden utilizar para estudiar el metabolismo de los compuestos externos que pueden ser tomados por toda la planta, como insecticidas.

Estudio sobre el metabolismo de seis insecticidas sistémicos en un cultivo de suspensión celular recién establecido derivado del té (Camellia Sinensis L.) Hojas

Aquí presentamos protocolos fáciles de usar para producir y purificar metabolitos diterpenoides a través de la expresión combinatoria de enzimas biosintéticas en Escherichia coli o Nicotiana benthamiana,seguido según el producto cromatográfico Purificación. Los metabolitos resultantes son adecuados para diversos estudios, incluyendo caracterización de la estructura molecular, estudios funcionales enzimáticos y ensayos de bioactividad.

Un enfoque personalizable para la producción enzimática y la purificación de productos naturales diterpenoides

Aquí, se presenta un método para expresar y purificar S100A12 (calgranulina C). Se describe un protocolo para medir su actividad antimicrobiana contra el patógeno humano H. pylori .

Expresión, purificación y actividad antimicrobiana de S100A12

Se presenta un protocolo para la extracción completa de lípidos, metabolitos y proteínas de tejidos biológicos utilizando una muestra.

Un método de extracción fraccionada simple para el análisis comprensivo de metabolitos, lípidos y proteínas a partir de una sola muestra

Aprende a extraer y cuantificar cafeína en suspensiones celulares de C. arabica L. y evalúa la actividad enzimática de la sintasa de cafeína. Este método facilita el estudio de la biosíntesis de metabolitos secundarios en plantas.

Extracción de cafeína, la actividad enzimática y la expresión del gen de la sintasa de cafeína de suspensiones celulares de plantas (Video) | JoVE Journal

Extracción de cafeína, la actividad enzimática y la expresión del gen de la sintasa de cafeína de suspensiones celulares de plantas

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