Utilizando electroforesis capilar para cuantificar ácidos orgánicos a partir de Tejidos Vegetales: Un caso de prueba del examen Coffea arabica Semillas

Este artículo presenta un método para la detección y cuantificación de ácidos orgánicos a partir de material vegetal utilizando electroforesis capilar zonal libre. Un ejemplo de la aplicación potencial de este método, la determinación de los efectos de una fermentación secundaria en los niveles de ácido orgánicos en semillas de café, se proporciona.

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar los niveles de ácidos orgánicos presentes en los tejidos vegetales. Este método se puede utilizar para responder preguntas de bioquímica y fisiología de las plantas, como el impacto de los estímulos ambientales en el crecimiento de las raíces, el desarrollo de los cultivos y la calidad de los alimentos o bebidas. Las principales ventajas de este método son que la preparación de la muestra es mínima, el método es de alto rendimiento y la electroforesis capilar es más rentable que la espectrometría de masas.

Aunque este método se utiliza para dilucidar las respuestas fisiológicas de las plantas, también se puede aplicar a la ciencia de los alimentos y la calidad de los alimentos, donde los ácidos orgánicos tienen un impacto crítico en el sabor, la seguridad y la estabilidad. Para comenzar, reúna muestras para la extracción de ácido carboxílico de cadena corta, o SCCA. Prepare un gramo de semilla de café a la vez para asegurarse de que quede suficiente muestra después del procesamiento.

Para lograr un tamaño de partícula uniforme para obtener la máxima eficiencia de extracción de SCCA, primero enfríe previamente un mortero con nitrógeno líquido. Añadir la muestra a un pequeño volumen de nitrógeno líquido en el mortero. Con un cucharón, agregue suficiente nitrógeno líquido al mortero para sumergir completamente la muestra.

Agregue muestras difíciles de moler, como semillas de café crudas, al nitrógeno líquido. Deje que se congelen durante 10 a 30 segundos antes de moler. Rompe el tejido en fragmentos más pequeños con un movimiento de trituración vertical.

A continuación, complete la molienda del tejido con un movimiento de molienda circular. Repita los pasos de congelación y molienda dos veces más para que las muestras se muelan un total de tres veces. Por lo general, tres rondas sucesivas de molienda reducirán las muestras a un polvo con una consistencia similar a la harina.

Transfiera el polvo a viales de vidrio o tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. Inicie el procesamiento posterior inmediatamente después de la molienda o almacene las muestras a 80 grados centígrados hasta que las muestras estén listas para la extracción. Ensamblar estándares auténticos para los SCCA de interés para crear soluciones estándar externas e internas para su uso en la determinación de las concentraciones de SCCA.

Para las muestras de café, incluya el ácido cítrico, málico, acético y láctico como ácidos de interés, y el ácido adípico como estándar interno. Cree una solución madre de 10 miligramos por mililitro añadiendo 100 miligramos de estándar a un matraz aforado de 10 mililitros. Llene el matraz volumétrico hasta la línea de 10 mililitros con agua ultrapura para disolver el ácido.

Transfiera cada solución madre a un tubo de vidrio limpio de 15 mililitros, con una tapa revestida de politetrafluoroetileno, y selle con una película plástica de parafina. Las soluciones madre se pueden almacenar en tubos sellados a cuatro grados centígrados durante una semana. Prepare 50 mililitros de la solución de extracción SCCA diluyendo la solución madre estándar interna a 0,05 miligramos por mililitro en agua ultrapura.

Para ello, añada 250 microlitros de la solución madre estándar interna a 49,75 mililitros de agua. A continuación, prepare muestras de curvas estándar para las SCCA de interés. Utilice un mínimo de al menos cinco puntos con concentraciones en el rango de respuesta lineal que abarquen las concentraciones esperadas de SCCA en las muestras.

Divida cada SCCA a la concentración determinada en nuevos tubos de microcentrífuga utilizando agua ultrapura hasta un volumen de un mililitro. Asegúrese de que cada punto de concentración contenga los cuatro patrones de ácido y el patrón interno a la concentración correcta. Retire las muestras que se van a extraer del almacenamiento y colóquelas en hielo.

Pesar 100 miligramos de muestra para la extracción de SCCA. Mida una cantidad de muestra lo más cerca posible de la masa objetivo para reducir la variabilidad. Después de pesar cada muestra, transfiera el tejido a un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 mililitros.

Realice un seguimiento de la masa de cada muestra medida, ya que las cantidades de SCCA detectadas se normalizarán utilizando la masa de la muestra. Después de pesar todas las muestras, agregue un mililitro de solución de exacción a cada uno de los tubos de muestra. Mantenga la misma relación entre la solución de extracción y la masa de tejido en todas las extracciones.

Mezcle bien mediante vórtice durante 10 segundos. Deje reposar las muestras a temperatura ambiente durante una hora. Durante esta hora, mezcle cada tubo cada 15 minutos mediante vórtice durante 10 segundos.

Después de una hora de extracción, mezcle las muestras por última vez y transfiera los tubos de muestra a una microcentrífuga. Centrifugar las muestras a cuatro grados centígrados, 10.000 veces G durante 10 minutos, para precipitar el material sólido. Para filtrar las muestras, prepare filtros de disco montados en jeringas, asegurándose de que cada filtro esté correctamente conectado a la jeringa.

Prepare una jeringa equipada con un filtro de disco para cada muestra que se vaya a analizar, incluidas las muestras de curva estándar. Filtre los sobrenadantes directamente en un tubo de microcentrífuga limpio. Después de filtrar, cierre el tubo que contiene el filtrado y deseche el aparato de filtro de jeringa.

Transfiera un mililitro de muestra a cada vial de electroforesis capilar, o CE, teniendo cuidado de evitar salpicar la muestra en el cuello del vial. Después de transferir la muestra, coloque un tapón CE en cada vial. Configure la ejecución de detección SCCA como se describe en el protocolo de texto.

Cargue los viales que contienen los puntos de curva estándar y los viales que contienen las muestras que se van a analizar en la bandeja de muestras de entrada, como se describe en las instrucciones del fabricante. Observe la posición de cada vial para la programación del muestreador automático. Después del acondicionamiento como se describe en el protocolo de texto, inicie la separación de muestras abriendo el menú Control en el software y seleccionando Ejecutar secuencia.

Supervise la matriz de fotodiodos, o las bandejas PDA, para garantizar una separación adecuada. Observe el primer trazo y asegúrese de que tenga una línea de base plana, y resuelva limpiamente los picos de ácido individuales. Para integrar picos de muestra, abra el primer archivo y establezca los pasos de integración automática para excluir los primeros tres minutos de la ejecución.

En el mismo menú, establezca los criterios de selección de picos en un ancho de pico mínimo de 50 unidades y un área de pico de 100 unidades, para proporcionar un nivel moderadamente alto de selectividad, separando los picos ácidos del ruido de fondo en la traza. Realice el análisis de datos como se describe en el protocolo de texto. Aquí se muestra una comparación de trazas de PDA que resaltan una muestra sobrecargada.

A medida que aumenta la concentración de analito, la geometría de los picos individuales puede comenzar a volverse asimétrica. Con 0,05 miligramos por mililitro, el ácido acético presenta un pico bilateralmente simétrico bien definido. A medida que la concentración de ácido acético aumenta a 0,07 o 0,10 miligramos por mililitro, el pico se vuelve asimétrico y se forma una cola de pico.

Este pico de cola es una buena indicación de que la muestra está sobrecargada. Aquí se muestran ejemplos de trazas de PDA que muestran ácidos orgánicos en muestras de café verde. Las muestras de café verde se diluyeron 1:10 antes de cargarlas en viales CE.

Los ácidos de interés incluyen el ácido acético, el ácido cítrico, el ácido láctico, el ácido málico y el estándar interno, el ácido adípico. Al intentar este procedimiento, es importante recordar moler las muestras hasta obtener una consistencia uniforme y pipetear las muestras con cuidado, para maximizar la reproducibilidad y minimizar el error experimental. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo cuantificar ácidos orgánicos a partir de muestras de plantas mediante electroforesis capilar o CE. Debería ser capaz de moler muestras de plantas, extraer ácidos orgánicos y preparar extractos de plantas para el análisis de CE posterior.