Utilizando electroforesis capilar para cuantificar ácidos orgánicos a partir de Tejidos Vegetales: Un caso de prueba del examen

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar los niveles de ácidos orgánicos presentes en tejidos vegetales. Este método puede utilizarse para responder preguntas en bioquímica y fisiología vegetal, como el impacto de estímulos ambientales sobre el crecimiento radicular, el desarrollo de cultivos y la calidad de alimentos o bebidas. Las principales ventajas de este método son que la preparación de la muestra es mínima, el método tiene alta capacidad de procesamiento y la electroforesis capilar es más rentable que la espectrometría de masas.

Aunque este método se utiliza para esclarecer las respuestas fisiológicas de las plantas, también puede aplicarse a la ciencia de los alimentos y a la calidad alimentaria, donde los ácidos orgánicos afectan críticamente el sabor, la seguridad y la estabilidad. Para comenzar, reúna muestras para la extracción de ácidos carboxílicos de cadena corta, o SCCA. Prepare un gramo de semilla de café a la vez para asegurar que quede suficiente muestra después del procesamiento.

Para obtener un tamaño de partícula uniforme que maximice la eficiencia de extracción de SCCA, primero enfríe previamente un mortero y un pistilo con nitrógeno líquido. Añada la muestra a un pequeño volumen de nitrógeno líquido en el mortero. Con una cuchara, añada suficiente nitrógeno líquido al mortero para sumergir completamente la muestra.

Agregue muestras difíciles de moler, como semillas crudas de café, al nitrógeno líquido. Deje que se congelen durante 10 a 30 segundos antes de molerlas. Rompa el tejido en fragmentos más pequeños utilizando un movimiento vertical de trituración.

Luego, complete la trituración del tejido utilizando un movimiento de molienda circular. Repita los pasos de congelación y molienda otras dos veces para que las muestras sean molidas un total de tres veces. Por lo general, tres rondas sucesivas de molienda reducirán las muestras a un polvo con una consistencia similar a la de la harina.

Transfiera el polvo a viales de vidrio o tubos microcentrífugos de 1,5 ml. Inicie inmediatamente el procesamiento posterior al molido o almacene las muestras a 80 grados Celsius hasta que estén listas para la extracción. Prepare estándares auténticos para los ácidos carboxílicos de cadena corta (SCCA) de interés para crear soluciones estándar externas e internas que se utilizarán para determinar las concentraciones de SCCA.

Para muestras de café, incluya ácido cítrico, málico, acético y láctico como ácidos de interés, y ácido adípico como estándar interno. Prepare una solución stock de 10 miligramos por mililitro añadiendo 100 miligramos del estándar a un matraz aforado de 10 mililitros. Llene el matraz aforado hasta la marca de 10 mililitros con agua ultrapura para disolver el ácido.

Transfiera cada solución stock a un tubo de vidrio limpio de 15 mililitros, con tapa revestida de politetrafluoroetileno, y selle con película de parafina plástica. Las soluciones stock se pueden almacenar en tubos sellados a cuatro grados Celsius durante una semana. Prepare 50 mililitros de la solución de extracción SCCA diluyendo la solución stock del estándar interno hasta 0,05 miligramos por mililitro en agua ultra pura.

Haga esto agregando 250 microlitros de la solución stock del patrón interno a 49,75 mililitros de agua. A continuación, prepare muestras para la curva patrón de los SCCA de interés. Utilice un mínimo de al menos cinco puntos con concentraciones dentro del rango de respuesta lineal que abarquen las concentraciones esperadas de SCCA en las muestras.

Diluya cada SCCA hasta la concentración determinada en nuevos tubos microcentrífugos utilizando agua ultrapura hasta un volumen de un mililitro. Asegúrese de que cada punto de concentración contenga los cuatro patrones ácidos y el patrón interno en la concentración correcta. Retire las muestras que se van a extraer del almacenamiento y colóquelas sobre hielo.

Pese 100 miligramos de muestra para la extracción de SCCA. Mida una cantidad de muestra lo más cercana posible a la masa objetivo, para reducir la variabilidad. Después de pesar cada muestra, transfiera el tejido a un tubo microcentrífugo limpio de 1,5 mililitros.

Registre la masa de cada muestra medida, ya que las cantidades de SCCAs detectadas se normalizarán utilizando la masa de la muestra. Después de pesar todas las muestras, agregue un mililitro de solución de extracción a cada uno de los tubos de muestra. Mantenga la proporción de solución de extracción respecto a la masa del tejido constante en todas las extracciones.

Mezcle bien mediante vortex durante 10 segundos. Deje que las muestras reposen a temperatura ambiente durante una hora. Durante esta hora, mezcle cada tubo cada 15 minutos mediante vortex durante 10 segundos.

Después de una hora de extracción, mezcle las muestras una última vez y transfiera los tubos de muestra a una microcentrífuga. Centrifugue las muestras a cuatro grados Celsius, 10,000 veces G durante 10 minutos, para precipitar el material sólido. Para filtrar las muestras, prepare filtros de disco montados en jeringa, asegurándose de que cada filtro esté correctamente sujeto a la jeringa.

Prepare una jeringa equipada con un filtro de disco para cada muestra que se analizará, incluyendo las muestras de la curva patrón. Filtre los sobrenadantes directamente en un tubo limpio de microcentrifugado. Después de filtrar, cierre el tubo que contiene el filtrado y deseche el dispositivo de filtro de jeringa.

Transfiera un mililitro de muestra a cada vial de electroforesis capilar, o CE, teniendo cuidado de evitar salpicar la muestra en el cuello del vial. Después de transferir la muestra, coloque una tapa de CE en cada vial. Configure la corrida de detección de SCCA como se describe en el protocolo escrito.

Cargue los viales que contienen los puntos de la curva patrón y los viales que contienen las muestras a analizar en la bandeja de entrada de muestras, tal como se describe en las instrucciones del fabricante. Anote la posición de cada vial para la programación del auto-muestreador. Después de la acondicionamiento descrito en el protocolo escrito, inicie la separación de las muestras abriendo el menú Control en el software y seleccionando Ejecutar Secuencia.

Monitoree la matriz de fotodiodos, o bandejas PDA, para asegurar una separación adecuada. Observe la primera traza y asegúrese de que tenga una línea base plana y resuelva nítidamente los picos individuales de ácidos. Para integrar los picos de la muestra, abra el primer archivo y configure los pasos de integración automática para excluir los primeros tres minutos del análisis.

En el mismo menú, establezca los criterios de selección de picos en un ancho mínimo de pico de 50 unidades y un área de pico de 100 unidades, para proporcionar un nivel moderadamente alto de selectividad, separando los picos ácidos del ruido de fondo en el trazado. Realice el análisis de datos según se describe en el protocolo del texto. Aquí se muestra una comparación de trazados de DAD que resaltan una muestra sobrecargada.

Al aumentar la concentración del analito, la geometría individual de los picos puede comenzar a volverse asimétrica. A 0,05 miligramos por mililitro, el ácido acético presenta un pico bien definido y bilateralmente simétrico. A medida que la concentración de ácido acético aumenta a 0,07 o 0,10 miligramos por mililitro, el pico se vuelve asimétrico y se forma una cola del pico.

Este alargamiento de la cola del pico es una buena indicación de que la muestra está sobrecargada. Aquí se muestran trazas de PDA de ejemplo que muestran ácidos orgánicos en muestras de café verde. Las muestras de café verde se diluyeron 1:10 antes de cargarlas en los viales de CE.

Los ácidos de interés incluyen el ácido acético, el ácido cítrico, el ácido láctico, el ácido málico y el estándar interno, el ácido adípico. Al realizar este procedimiento, es importante recordar moler las muestras hasta lograr una consistencia uniforme y pipetearlas con cuidado, para maximizar la reproducibilidad y minimizar el error experimental. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cuantificar ácidos orgánicos a partir de muestras vegetales utilizando electroforesis capilar, o CE. Debería ser capaz de moler muestras vegetales, extraer ácidos orgánicos y preparar extractos vegetales para análisis posteriores mediante CE.