La inducción de ictus isquémico y la isquemia-reperfusión en ratones con la técnica de oclusión de la arteria Medio y Visualización de un infarto Área

El objetivo general de este procedimiento quirúrgico es inducir de forma oficial y fiable un accidente cerebrovascular isquémico dejando intacta la arteria cerebral externa. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación del accidente cerebrovascular, como el impacto del tratamiento en la gravedad del accidente cerebrovascular. La principal ventaja de esta técnica es que, tras la inducción del ictus, la arteria cerebral externa permanece disponible para infundir el tratamiento directamente en el hemisferio afectado.

Coloque un ratón anestesiado con isoflurano sobre la superficie quirúrgica preparada y coloque un cono nasal para administrar isoflurano mezclado con oxígeno. Asegúrese de que la frecuencia respiratoria esté alrededor de una o dos respiraciones por segundo sin jadear. Además, asegúrese de que el animal no muestre una reacción a la estimulación de los bigotes o al reflejo del pedal.

Aplique una gota de lubricante oftálmico en cada ojo, utilizando un hisopo estéril para evitar que se sequen durante el procedimiento. Después de afeitar el área de la incisión, desinfecte completamente el área de la cirugía con etanol al 70% y una solución a base de clorhexidina. Mantenga al animal sobre una superficie quirúrgica tibia bajo un microscopio estereoscópico.

A continuación, con tijeras quirúrgicas y fórceps, realice una incisión poco profunda en la línea media del cuello desde por encima del esternón hasta por debajo de la mandíbula. Con fórceps, separe cuidadosamente los tejidos grasos y conectivos para exponer la tráquea. Los tejidos deben separarse fácil y naturalmente a ambos lados.

Luego, coloque una almohada u otro objeto redondo de aproximadamente 0.5 centímetros de diámetro debajo de la parte posterior del cuello para extender el cuello y exponer aún más el área para la cirugía. Abra la incisión con un retractor de tejido o ganchos. Luego, en el lado izquierdo de la tráquea, separe con cuidado el tejido conectivo para exponer la arteria carótida común izquierda sin dañar los nervios cercanos y las venas principales.

A continuación, inserte las pinzas curvas debajo del CCA para perforar el tejido conectivo y luego deje que se abran lentamente para liberar el CCA. Separe el CCA del tejido subyacente y exponga la ramificación superior de la arteria cerebral interna y la arteria cerebral externa. Una vez que el CCA esté expuesto, inserte tres segmentos de sutura de nailon debajo del CCA.

Asegúrese de que el CCA no esté retorcido, ya que esto complicaría drásticamente la inserción de la sutura. Luego, en el punto más bajo posible, cierre la sutura inferior con un nudo permanente. Ate la sutura superior justo debajo de la ramificación del ICA y el ECA con un nudo corredizo removible.

A continuación, ate la sutura central con un nudo corredizo extraíble, pero manténgala bien abierta. Luego, usando tijeras de resorte de microdisección, cree un 0,2 milímetro en el CCA entre las suturas inferior y media más cerca de la sutura inferior. Con fórceps, inserte la sutura MCAO en la incisión del CCA, guiándola hacia la sutura superior.

A continuación, apriete suavemente el nudo corredizo de la sutura central en el CCA para que restrinja el flujo sanguíneo alrededor de la sutura MCAO, pero esté lo suficientemente suelto como para permitir que la sutura MCAO se mueva libremente. Ahora deshaga con cuidado la sutura superior, asegurándose de que la sutura MCAO no se salga. Inserte la sutura MCAO un par de milímetros en el ICA y luego vuelva a cerrar la sutura superior con un nudo corredizo como antes.

A continuación, guíe la sutura MCAO hasta el área de oclusión, primero dirigiéndola hacia el ICA más allá del ECA, luego asegurándose de que la sutura permanezca en el ICA, sin pasar por la arteria pterigopalatina. La inserción es exitosa si hay poco reflujo sanguíneo de la incisión CCA y si la marca de nueve milímetros de plata está situada entre la incisión CCA y la bifurcación de la ICA y la ECA. Después de una oclusión exitosa, ate firmemente la sutura media y superior y luego meta las suturas en el área de la incisión.

Después de retirar el retractor o los ganchos de papel y la almohada, limpie el área de sutura con solución salina estéril en un hisopo de algodón. A continuación, cierre la piel con una sutura de nylon. Coloque el ratón en una jaula limpia situada sobre una almohadilla térmica para evitar la hipotermia y permitir el acceso ad libitum al agua y a los alimentos ablandados.

Vigile al animal para detectar signos de accidente cerebrovascular durante al menos cinco a 10 minutos. Dependiendo del protocolo de reperfusión por isquemia, deje la sutura MCAO en su lugar de 30 minutos a 120 minutos o más. Después de anestesiar al animal como antes y retirar las suturas de cierre de la herida, use fórceps y separadores de tejido para reabrir la incisión y exponer el CCA.

A continuación, retire con cuidado la sutura superior y tire suavemente de la sutura MCAO hasta que la parte recubierta de silicona quede situada en el nudo central. Vuelva a hacer la sutura del nudo superior para evitar que la sangre fluya a través de la sutura MCAO. A continuación, deshaga con cuidado el nudo central y tire de la sutura MCAO más allá del nudo superior, manteniéndolo dentro del CCA.

Cierre herméticamente el nudo superior para bloquear el flujo sanguíneo de las arterias. A continuación, extraiga completamente la sutura MCAO y cierre firmemente el nudo central. Cierre la herida y administre los cuidados postoperatorios como antes.

Este esquema muestra el área de oclusión que resulta del procedimiento demostrado en este video en azul. El área de la cirugía se encuentra en la parte inferior de la figura, indicada por la forma ovalada, y la colocación de la sutura se indica con líneas negras. Las siguientes imágenes muestran la posición TTC de las secciones del cerebro.

Esta imagen representa la tinción típica después de una inserción simulada. La imagen es representativa del daño tisular causado por un MCAO de 60 minutos, seguido de 90 minutos de reperfusión. Se observa un mayor daño tisular después de 24 horas de reperfusión, después de un MCAO de 60 minutos.

La tinción inmunofluorescente para el marcador neuronal MAP2 permite visualizar claramente en la imagen de la derecha la pérdida neuronal a partir de 60 minutos de oclusión, seguida de 23 horas de reperfusión. La astrogliosis es visible después de la tinción inmunofluorescente con GFAP. En la imagen de la derecha, la astroglía se concentra en el área adyacente al daño tisular en el cerebro con reperfusión por isquemia, mientras que en el control operado por vergüenza se observa un patrón difuso de tinción.

Al intentar este procedimiento, es importante controlar el bienestar de los animales y el tiempo de oclusión. Después de este procedimiento, se pueden realizar otras técnicas, como el análisis de comportamiento extraño y la inmunofluorescencia, para responder preguntas adicionales sobre la lesión tisular y la recuperación.