Aislamiento de las vesículas extracelulares del líquido de lavado broncoalveolar murino utilizando una técnica de centrifugación ultrafiltración
9 de noviembre de 2018
Aquí, describimos a dos protocolos de aislamiento de vesículas extracelulares, ultrafiltración centrifugación y ultracentrifugación con centrifugación gradiente de densidad, para aislar las vesículas extracelulares de muestras de líquidos de lavado broncoalveolar murino. Las vesículas extracelulares derivadas del líquido de lavado broncoalveolar murino por ambos métodos se cuantifica y caracteriza.
Este método puede ayudar a abordar preguntas relacionadas con la eficiencia, el rendimiento de recuperación y la pureza de las vesículas extracelulares derivadas del líquido de lavado broncoalveolar utilizando un enfoque de centrifugación de ultrafiltración. Comparamos directamente esta técnica con una técnica de purificación de gradiente de ultracentrifugación y densidad. La principal ventaja de esta técnica es que es simple, eficiente y adecuada para muestras de pequeño volumen como el líquido de lavado broncoalveolar murino.
Lo que es más importante, proporciona alta pureza y escalabilidad significativamente mayor en comparación con un método de aislamiento de ultracentrifugación. Norman Garrett III, investigador asociado de mi laboratorio. Para comenzar, inserte un angiocatéter calibre 22 en la tráquea de un ratón eutanizado.
Coloque una jeringa de insulina con un mililitro de DPBS estéril con frío helado e incultre un mililitro en ambos pulmones. Retire lentamente el émbolo de la jeringa para recuperar el líquido de lavado broncoalveolar o líquido BAL. Y dispensar el líquido BAL en un tubo cónico sobre hielo.
Después de esto, tire del líquido BAL de 25 ratones y divídalo en dos conjuntos iguales. Centrifugar el líquido BAL a 400 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Recoger el sobrenadante y centrifugarlo a 15.000 veces G a cuatro grados centígrados durante 10 minutos.
A continuación, recoja el sobrenadante y proceda a los pasos de aislamiento EV inmediatamente. En primer lugar, filtre el súper natant a través de un filtro de jeringa estéril de 0,2 micrómetros. Después de esto, equilibre la unidad de filtro centrífuga con DPBS estéril durante 10 minutos.
Luego centrifuga la unidad centrífuga a 15.000 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Llene el filtro con 15 mililitros de líquido BAL. Y centrifugarlo a 3.000 G por 30 minutos a cuatro grados centígrados.
Después de esto, lave el retentate con 14 mililitros de DPBS estériles pipeteando suavemente repetidamente. Centrifugar la unidad de filtro a 3.000 G a cuatro grados centígrados durante 30 minutos para retirar el DPBS y concentrar el retentato. Para recoger los EV derivados del fluido BAL concentrado, inserte una pipeta en la parte inferior de la unidad de filtro y retire la muestra utilizando un movimiento de barrido de lado a lado.
A continuación, aliquot el líquido BAL derivado EV's y almacenarlos en menos 80 grados celsius. Alternativamente, comience transfiriendo el sobrenadante adquirido anterior a un tubo de ultracentrífuga. Y centrifugarlo a 10.000 G por 30 minutos a cuatro grados centígrados.
A continuación, recoger el sobrenadante y centrífuga. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet EV en 200 microlitros de DPBS. Después de esto, mezcle la suspensión EV con 300 microlitros de solución de trabajo 50%iodixanol.
Y transfiéralo a un tubo ultracentrífugo de 15 mililitros. A continuación, agregue la solución de búfer de acuerdo con el protocolo de texto para crear un gradiente de densidad boyante y centrifúelo a 100.000 G durante tres horas y 50 minutos. Recoger el 15% y el 25%fracciones de iodixanol, y diluirlos en DPBS para llevar el volumen hasta 15 mililitros.
Transfiera las fracciones a un nuevo tubo de ultracentrífuga y centrifugar a 100.000 G a cuatro grados centígrados durante 60 minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender los pellets EV en 50 microlitros de DPBS estériles. Para comenzar el análisis de seguimiento de nanopartículas, diluya la muestra EV en un mililitro de DPBS.
Y cargue la muestra en una jeringa de insulina. Después de esto, conecte la jeringa a una bomba de jeringa y mida los números y el tamaño de las partículas. Establezca el nivel de la cámara en 14 y el umbral de detección en uno.
A continuación, utilice un lector de placas para cuantificar la cantidad de proteína en la muestra EV mediante la detección colorimétrica. Disolver una cantidad igual de proteína EV de cada muestra con un tampón de carga de hinchazón y TDT. A continuación, caliente las muestras a 70 grados centígrados durante 10 minutos.
Cargue las muestras en un gel de acrilamida Bis-Tris Plus y ejecute la electroforesis durante 35 minutos. A continuación, transfiera las proteínas a una membrana de nitrocelulosa utilizando un método de transferencia en seco. Después de esto, bloquear la membrana con cinco por ciento de leche desnatada durante 60 minutos con suave balanceo.
Incubar la membrana con un anticuerpo a un marcador de proteína superficial EV a cuatro grados centígrados con un suave balanceo durante la noche. Desarrollar la membrana incubando la membrana con anticuerpo de enlace HRP durante 60 minutos a temperatura ambiente. Lave la membrana durante 10 minutos con el tampón TBST tres veces.
Por último, desarrolle la membrana con reactivo quimiominiscente de detección de anticuerpos HRP antes de proceder a la toma de imágenes. Para comenzar la citometría de flujo, diluir los EV derivados del fluido BAL en 49 microlitros de tampón de tinción PEB. Luego agregue tres anticuerpos a cada una de las muestras, antes de incubar las muestras a cuatro grados centígrados con balanceo durante 60 minutos en la oscuridad.
Por último, diluir las muestras con 40 microlitros de tampón de tinción PEB filtrada por membrana y realizar análisis de citometría de flujo. En este protocolo, los EV fueron aislados del fluido BAL del ratón usando un método UFC y UC-DGC. Los EV derivados del fluido BAL de ratones normales aislados por el método UFC mostraban tamaños más pequeños y una distribución de tamaño más uniforme que las uc-DGC-EV.
La técnica UFC también tuvo un recuento total de partículas significativamente mayor en comparación con la técnica UC-DGC. La recuperación total de proteínas medida en miligramos de UFC-EV también fue mayor que la de la UC-DGC-EV, lo que indica que la técnica de UFC es más eficiente en tiempo y esfuerzo. Finalmente, los EV derivados del fluido BAL también se caracterizaron aún más a través de la citometría de flujo.
Los UFC-EV y UC-DGC-EV expresaron CD63, CD9 y CD81. Al intentar este procedimiento, es importante recordar rehidratar la membrana de la unidad de ultrafiltración con DPBS. Una vez que la membrana está hidratada, la unidad debe mantenerse húmeda en todo momento hasta que se utilice.
Recuperar el retentato de vesícula extracelular de la unidad de filtro puede ser un desafío. Asegúrese de que la punta de la pipeta esté barrida de lado a lado para recuperar la mayor parte de los EV de la unidad de filtro. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del aislamiento de vesícula extracelular exploraran las funciones biológicas del lavado broncoalveolar derivado de vesículas extracelulares derivadas tanto en condiciones normales como patológicas en animales pequeños.
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Descripción general
Este artículo describe dos protocolos para aislar vesículas extracelulares del líquido de lavado broncoalveolar de ratón: centrifugación con ultrafiltración y ultracentrifugación con centrifugación en gradiente de densidad. Ambos métodos se comparan en términos de eficiencia, rendimiento de recuperación y pureza.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Investigación sobre vesículas extracelulares
Antecedentes
- Las vesículas extracelulares desempeñan un papel crucial en la comunicación intercelular.
- Los métodos de aislamiento afectan la calidad y el rendimiento de las vesículas.
- El líquido de lavado broncoalveolar es una fuente valiosa para el estudio de vesículas extracelulares relacionadas con el pulmón.
- El análisis comparativo de las técnicas de aislamiento puede mejorar los resultados de la investigación.
Objetivo del estudio
- Evaluar la eficiencia y escalabilidad de la centrifugación por ultrafiltración.
- Compararla con los métodos tradicionales de ultracentrifugación.
- Evaluar la pureza de las vesículas extracelulares aisladas.
Métodos Utilizados
- Ultracentrifugación con gradiente de densidad para comparación.
- Ultracentrifugación con gradiente de densidad para comparación.
- Cuantificación y caracterización de vesículas aisladas.
- Uso de muestras de líquido de lavado broncoalveolar de ratón.
Resultados principales
- La centrifugación por ultrafiltración proporciona una mayor pureza de vesículas extracelulares.
- Este método es más escalable para muestras de pequeño volumen.
- La eficiencia y el rendimiento de recuperación mejoran significativamente.
- Una comparación directa resalta las ventajas frente a los métodos tradicionales.
Conclusiones
- La centrifugación por ultrafiltración es una alternativa viable para el aislamiento de vesículas extracelulares.
- Ofrece simplicidad y eficiencia para los investigadores.
- Estudios futuros pueden ampliar las aplicaciones de este método.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El aislamiento eficiente y escalable de vesículas extracelulares (EVs) a partir de muestras biológicas de pequeño volumen representa un cuello de botella crítico en la investigación inicial de enfermedades respiratorias y biomarcadores. La técnica de centrifugación con ultrafiltración (UFC) permite obtener un mayor rendimiento y pureza de EVs a partir del líquido de lavado broncoalveolar de ratón, favoreciendo caracterizaciones posteriores sólidas y estudios traslacionales. Esta capacidad mejora la confianza predictiva y acelera las decisiones en carteras de proyectos dentro de las líneas de I+D centradas en enfermedades respiratorias y vesículas extracelulares.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite el aislamiento de alto rendimiento de EVs para estudios basados en hipótesis sobre vías de señalización pulmonar.
- Mejora la reducción del riesgo biológico al proporcionar poblaciones de EVs más puras para la interrogación mecanicista.
- Apoya la validación funcional de objetivos mediante la recuperación reproducible de EVs a partir de muestras de pequeño volumen.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Facilita la preparación de muestras estandarizadas de EV para ensayos cuantitativos posteriores.
- Mejora la reproducibilidad del ensayo al minimizar la pérdida de muestra y la contaminación.
- Incrementa la escalabilidad y el rendimiento para flujos de trabajo de cribado utilizando material biológico limitado.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Permite la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al apoyar estudios de biomarcadores en vesículas extracelulares (EV) en modelos murinos relevantes para la enfermedad.
- Proporciona un aislamiento confiable de EV para la investigación traslacional sobre la fisiopatología pulmonar.
- Reduce el riesgo de avanzar candidatos de biomarcadores basados en EV mediante una calidad de muestra consistente.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método UFC se integra en la interfaz entre el descubrimiento temprano y la investigación preclínica, permitiendo el aislamiento robusto de EV para análisis moleculares, proteómicos y funcionales posteriores.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis y el análisis de vías al proporcionar EVs de alta pureza a partir de muestras de pequeño volumen.
- Selección: Proporciona preparaciones cuantitativas y reproducibles de EVs para el desarrollo de ensayos y la evaluación de compuestos.
- Análisis: Permite la medición precisa del número de partículas de EVs, la distribución de tamaño y el contenido proteico para estudios comparativos.
- Investigación Traducional: Se alinea con el descubrimiento y la validación de biomarcadores en modelos murinos de enfermedades pulmonares.
- Reutilización Empresarial: Ofrece un flujo de trabajo escalable y estandarizado para el aislamiento de EVs adaptable a diversos programas de investigación en vesículas extracelulares y enfermedades respiratorias.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en los estudios basados en EV.
- Valor operativo: Optimiza el aislamiento de EV con una estandarización, reproducibilidad y escalabilidad mejoradas.
- Valor estratégico: Permite tomar decisiones más informadas de avance/no avance y un desarrollo más eficiente en términos de capital de activos relacionados con EV.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de programas de biomarcadores respiratorios y de EV.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el aislamiento de vesículas extracelulares (EV) y técnicas analíticas posteriores, como el seguimiento de nanopartículas y la citometría de flujo.
- Necesita acceso a unidades de ultrafiltración, centrífugas e instrumentos para la cuantificación de proteínas.
- Exige la estandarización entre equipos de los protocolos de manejo y procesamiento de muestras.
- Adaptable a otros fluidos biológicos de pequeño volumen con optimización del protocolo.
- El manejo cuidadoso de la membrana y la recuperación de la muestra son fundamentales para maximizar el rendimiento y la pureza de las EV.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:04
Title
1:15
Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid (BALF) Collection and Preparation
2:21
Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid
4:56
Extracellular Vesicle Quantification
5:35
Detection of BALF-derived Extracellular Vesicles
7:16
Results: UFC Method Demonstrates Higher Total Particle Counts and Protein Recover
8:25
Conclusion
