Name: Aislamiento de las vesículas extracelulares del líquido de lavado broncoalveolar murino utilizando una técnica de centrifugación ultrafiltración (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Aprenda a aislar vesículas extracelulares de lavado broncoalveolar murino mediante centrifugación ultrafiltración. Este método ofrece mayor pureza, eficiencia y escalabilidad comparado con ultracentrifugación tradicional.

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El trabajo es apoyado por las donaciones NHLBI/NIH HL103868 (para PC) y HL137076 (para PC), el americano corazón Asociación subvenciones (para PC) y el Premio de investigación de cáncer de Samuel Oschin integral cáncer Institute (SOCCI) pulmón (para PC). Nos gustaría expresar nuestro gran agradecimiento al Instituto del corazón de Smidt en el Cedars-Sinai Medical Center que nos proporciona una máquina Nanosight para EV nanopartículas análisis de seguimiento.

La utilización de animales y animales todos los procedimientos fueron aprobados por el cuidado de Animal institucionales y comités del uso (IACUC) en el centro médico Cedars-Sinai (CSMC).
1. preparación y murino el lavado broncoalveolar (BALF) de líquido colección
<ol><li>Colección de BALF<ol>
<li>Eutanasia a ratones con un cóctel de ketamina (300 mg/kg) y xilacina (30 mg/kg) vía intraperitoneal seguido por dislocación cervical.</li>
		<li>Inserte un angiocatéter de 22 G en la tráquea. Conecte una jeringa de insulina 1 ml (mL) de fosfato buffer salino de helado Dulbecco estéril (DPBS) e infundir 1 mL de SPD en ambos pulmones a través del angiocatéter.</li>
		<li>Retire lentamente el émbolo de la jeringa para recuperar BALF y dispensar el BALF en un tubo cónico de 50 mL. Mantenga el BALF en hielo.</li>
		<li>Repita los pasos 1.1.2 y 1.1.3 3 x (4 en total en cada ratón). Nota: Aproximadamente 0,8 mL es obtenido generalmente por mililitro de la instilación. También, pueden realizar los siguientes pasos para ratones individuales (es decir, 3 mL de BALF) y agrupación de múltiples muestras BALF permitirá el aislamiento de un lote mayor de EVs para la consistencia en experimentos posteriores.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de BALF<ol>
<li>BALF de la piscina de 25 ratones y dividirla en dos grupos iguales (~ 35 mL por alícuota).</li>
		<li>Centrifugue el BALF x 400 g, a 4 ° C por 5 min, para eliminar las células y otros desechos celulares y recoger el sobrenadante.</li>
		<li>Centrifugar el sobrenadante a 1.500 xg a 4 ° C durante 10 min, para eliminar restos celulares. Recoger el sobrenadante y proceder a las medidas de aislamiento de EV.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. aislamiento de las vesículas extracelulares del líquido de lavado broncoalveolar murino
Nota: En este estudio, EV dos técnicas de aislamiento, es decir, UFC y ultracentrifugación con boyante utilizan para aislar EVs de BALF. El protocolo detallado de cada método se describe a continuación.
<ol><li>
Método de enriquecimiento de centrifugado (UFC) de ultrafiltración Nota: Este método fue modificado del protocolo descrito anteriormente10.<ol>
<li>Filtrar el sobrenadante del paso 1.2.3 a través de un filtro de jeringa estéril 0,2 μm y mantener el filtrado BALF en hielo. Nota: Este es un paso de la exclusión de tamaño por el que sólo vesículas más pequeñas de 200 nm se recogen.</li>
		<li>Equilibrar la unidad de filtro centrífugo de 100 kDa MWCO con DPBS estéril durante 10 minutos, centrifugar la unidad centrífuga a 1.500 x g por 10 min a 4 ° C para descartar la DPBS. PRECAUCIÓN: Una vez que la membrana en el dispositivo de filtro es equilibrada con DPBS, la membrana debe mantenerse húmeda en todo momento hasta que el dispositivo se utiliza.</li>
		<li>Llenar el filtro con 15 mL de muestra de BALF de paso 2.1.1 y centrifugar a 3.000 x g durante 30 min a 4 ° C. Flujo BALF puede desechado o recogido en un separado tubo canónico y almacenado a-80 ° C para su uso futuro.</li>
		<li>Repita el paso 2.1.3 para el restante 0,2 μm filtrado BALF. Nota: Tuvo tres repeticiones de centrifugados para concentrar suficientemente la EVs BALF del volumen original a partir de 35 mL. Esto dio lugar a 1 – 1,5 mL de retenido.</li>
		<li>Lave el retenido con 14 mL de DPBS estéril transfiriendo un suavemente repetidamente. Centrifugue la unidad filtrante a 3.000 x g, a 4 ° C por 30 min, para eliminar la DPBS y concentrar el retentate EV.</li>
		<li>Recoger el servicio voluntario europeo derivado de BALF concentrado desde el dispositivo de filtro por insertar una pipeta en la parte inferior del dispositivo de filtro y retirar la muestra utilizando un movimiento de barrido de lado a lado para asegurar la recuperación total.</li>
		<li>Alícuota del SVE derivados de BALF y almacenarlas a-80 ° C por más partículas cuantificación y caracterización (ver paso 3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ultracentrifugación (UC) con centrifugación de gradiente de densidad boyante (DGC) Nota: El siguiente protocolo fue modificado del protocolo descrito previamente24.<ol>
<li>Transfiera el sobrenadante del paso 2.1.1 en un tubo de ultracentrífuga 37 mL y centrifugar la muestra a 10.000 x g por 30 min a 4 ° C utilizando la ultracentrífuga. Recoger el sobrenadante y centrifugue a 100.000 x g, a 4 ° C durante 60 minutos. Mientras que las pelotillas de EV se centrifugaron, se preparan diferentes concentraciones de búferes de gradiente de densidad boyante (tabla 1) para paso 2.2.3.</li>
		<li>Deseche el sobrenadante y resuspender las pelotillas de la EV en 200 μL de DPBS.</li>
		<li>Mezclar la suspensión de la EV con 300 μL de solución de trabajo de 50% iodixanol (tabla 1) y transferir al tubo de ultracentrífuga de 15 mL. Sobre la suspensión de mezcla de 50% EV iodixanol, secuencialmente la siguiente solución tampón en la orden de la parte inferior de la parte superior de la capa: 30% iodixanol (4,5 mL), 25% de iodixanol (3 mL), iodixanol (2,5 mL) de 15% y 5% iodixanol (6 mL). Centrifugar a 100.000 x g, a 4 ° C por min 230. Nota: El gradiente de densidad boyante se basa en el porcentaje de iodixanol escalar con la mayor concentración (50%) en la parte inferior a la menor concentración (5%) en la parte superior. Para generar diferentes concentraciones de iodixanol, varias cantidades de medio de homogeneización (tabla 1) se mezclaron con solución de trabajo (50% iodixanol).</li>
		<li>Recoger la fracción del 15% y 25% y diluir en DPBS estéril para subir el volumen a 15 mL. Transferirlos a un nuevo tubo de ultracentrífuga pequeño y centrifugue a 100.000 x g, a 4 ° C durante 60 minutos.</li>
		<li>Deseche el sobrenadante y resuspender las pelotillas de la EV en 50 μL de DPBS estéril para mayor caracterización.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. cuantificación de vesícula extracelular
Nota: El rendimiento de recuperación derivados de BALF EVs es cuantificado con dos métricas.
<ol><li>Nanopartícula seguimiento medición análisis (NTA)<ol>
<li>Diluir la muestra de EV a 1: 200, 1: 500 en 1 mL de DPBS y carga la muestra en una jeringa de insulina. Conecte una jeringa de muestra a una bomba de jeringa y comience a medir el número de partículas y el tamaño (véase Tabla de materiales).</li>
		<li>Establecer el nivel de la cámara en el 14 y el umbral de detección en 1 para todas las mediciones de la muestra. Cinco mediciones repetitivas con 1.500 fotogramas de 30 s se registraron para cada muestra, con un retraso de 20 s entre lecturas. Combinar y promedio de los datos de concentración final y tamaño informes. Nota: Para la captura precisa de todas las partículas, ajustar el nivel de la cámara como apropiado para visualizar todas las partículas y use similares para todas las mediciones de la muestra en cada experimento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cuantificación de proteína Nota: Ensayo de proteína (BCA) ácido bicinchoninic fue utilizado para medir la concentración de proteína de la EVs derivados de BALF.<ol>
<li>Solubilizar las muestras EV en tampón de lisis de x 1.</li>
		<li>Cuantificar la cantidad de proteína en la EVs BALF derivado según el protocolo estándar BCA con detección colorimétrica midiendo la absorbancia a 560 nm en un lector de placas.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. detección de vesículas extracelulares derivadas de BALF
Nota: Exosomas comúnmente conocido marcador superficial proteínas (TSG101, CD63, CD81, CD9) fueron utilizadas para verificar EV recuperaciones por SDS-PAGE y el immunoblotting y el flujo cytometry análisis.
<ol><li>SDS-PAGE e immunoblotting<ol>
<li>Disolver una cantidad igual de proteínas de EV de cada muestra con una carga de buffer (dodecil sulfato de litio) y 50 mM Ditiotreitol (DTT) en un tubo de 1,6 mL de borrar. Calentar las muestras a 70 ° C durante 10 minutos.</li>
		<li>Cargar las muestras en el paso 4.1.1 en un gel de acrilamida Bis-Tris Plus 4 – 12% y ejecutar electroforesis (150 voltios, 35 mA) durante 35 minutos.</li>
		<li>Transferencia de proteínas a una membrana de nitrocelulosa, usando un método de transferencia en seco.</li>
		<li>Bloquear la membrana con 5% leche desnatada durante 60 min, oscilación en la temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Incubar la membrana con un anticuerpo a un marcador de proteína de la superficie de EV, Tumor susceptibilidad genética 101 (TSG101) a dilución 1: 500 en 5% de BSA en Tris-buffer salina Tween-20 (TBST) a 4 ° C, oscilando durante la noche.</li>
		<li>Al día siguiente, lavar la membrana 3 x 10 min cada uno Lave, en buffer TBST e incubar con anti-conejo IgG, un anticuerpo ligados por la HRP, en dilución de 1:5,000 durante 60 min a TA.</li>
		<li>Lavar la membrana 3 x 10 minutos cada lavado, en buffer TBST. Desarrollo de la membrana con quimioluminiscencia reactivo de detección de anticuerpos HRP y la imagen (véase Tabla de materiales para sistema de imagen).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Citometría de flujo<ol>
<li>Diluir el EVs derivados de BALF en 49 μL de buffer (PBS + EDTA 5 mM + 0,5% BSA, filtrada a través de una membrana de filtro de jeringa de 0.1 μm) la coloración de la Junta.</li>
		<li>Añadir a cada uno de los siguientes anticuerpos en cada muestra individual: 1) anticuerpo de rata anti-ratón CD63 PE (100 ng por reacción); 2) anti-mouse rata PE CD81 (500 ng); 3) anti-mouse rata CD9 FITC (200 ng). Incubar a 4 ° C, oscilación de 60 minutos en la oscuridad.</li>
		<li>Diluir las muestras con 450 μL de filtrado de membrana PEB tampón de tinción y someter las muestras a análisis de citometría de flujo (véase Tabla de materiales)25.</li>
		<li>Ajustar la configuración de citómetro de flujo de la siguiente manera: 1) activado todos los canales de registro hyper (hlog); 2) Coloque el gatillo en SSC en 4; 3) Apague el gatillo secundario. Ejecutar los ejemplos en un entorno de baja velocidad y adquirir por lo menos 10.000 eventos en cada muestra.</li>
		<li>Realizar citometría bajo análisis de los datos en cada muestra utilizando el software de análisis (véase Tabla de materiales).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Fang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+application+of+a+microfluidic+chip+for+immunocapture+and+quantification+of+circulating+exosomes+to+assist+breast+cancer+diagnosis+and+molecular+classification%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Clinical application of a microfluidic chip for immunocapture and quantification of circulating exosomes to assist breast cancer diagnosis and molecular classification.</a> PloS ONE. 12 (4), e0175050(2017).</li>
<li>Cheruvanky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+urinary+exosomal+biomarkers+using+a+nanomembrane+ultrafiltration+concentrator%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator.</a> American Journal Physiology-Renal Physiology. 292 (5), F1657-F1661 (2007).</li>
<li>Kornilov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+ultrafiltration-based+protocol+to+deplete+extracellular+vesicles+from+fetal+bovine+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1422674(2018).</li>
<li>Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+protein%2C+microRNA%2C+and+mRNA+yields+using+different+methods+of+urinary+exosome+isolation+for+the+discovery+of+kidney+disease+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers.</a> Kidney International. 82 (9), 1024-1032 (2012).</li>
<li>Bosch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trehalose+prevents+aggregation+of+exosomes+and+cryodamage%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage.</a> Scientific Reports. 6 (1), 329(2016).</li>
<li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+progenitor+cell-derived+exosomes+prevent+cardiomyocytes+apoptosis+through+exosomal+miR-21+by+targeting+PDCD4%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Cardiac progenitor cell-derived exosomes prevent cardiomyocytes apoptosis through exosomal miR-21 by targeting PDCD4.</a> Cell Death & Disease. 7 (6), e2277(2016).</li>
<li>Agarwal, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental%2C+Systems+and+Computational+Approaches+to+Understanding+the+MicroRNA-Mediated+Reparative+Potential+of+Cardiac+Progenitor+Cell-Derived+Exosomes+From+Pediatric+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Experimental, Systems and Computational Approaches to Understanding the MicroRNA-Mediated Reparative Potential of Cardiac Progenitor Cell-Derived Exosomes From Pediatric Patients.</a> Circulation Research. 120 (4), 701-712 (2017).</li>
<li>Merchant, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfiltration+isolation+of+human+urinary+exosomes+for+characterization+by+MS%5BTitle%5D)+AND+%22PROTEOMICS+-+Clinical+Applications%22%5BJournal%5D)">Microfiltration isolation of human urinary exosomes for characterization by MS.</a> PROTEOMICS - Clinical Applications. 4 (1), 84-96 (2010).</li>
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<li>Betsuyaku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+Granule+Proteins+in+Bronchoalveolar+Lavage+Fluid+from+Subjects+with+Subclinical+Emphysema%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neutrophil Granule Proteins in Bronchoalveolar Lavage Fluid from Subjects with Subclinical Emphysema.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 159 (6), 1985-1991 (1999).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En las últimas décadas, los científicos han desentrañando los significados de EVs en la homeostasis celular. Más importante aún, EVs desempeñan un papel importante en muchos procesos de la enfermedad mediante la modulación de las células vecinas y distantes a través de sus bioactivos carga moléculas1,21,22,26,27 , 28 ,</...

Exosomas son el subconjunto más pequeño de los vehículos eléctricos, 50-200 nm de diámetro y tienen múltiples funciones biológicas a través de una amplia gama de señalización de procesos1,2,3,4,5. Gobiernan la homeostasis celular y el tejido sobre todo facilitando la comunicación intercelular a través de moléculas de carga tales como lípidos, proteínas y ácidos nucleicos6,7,8,9 . Un paso crítico en la investigación EV es el proceso de aislamiento. Ultracentrifugación diferencial (UC), con o sin centrifugación de gradiente de densidad (DGC), se considera el enfoque de patrón oro, pero este método tiene limitaciones importantes, incluidos los porcentajes de recuperación de EV ineficientes y escalabilidad baja10 , 11 , 12, restringir su mejor utilización para muestras de volumen más grandes, tales como muestras de la célula cultura exosomas sobrenadante o alta producción. Las ventajas y desventajas de otros métodos, como la exclusión del tamaño por ultrafiltración o cromatografía de inmunoafinidad aislamiento por granos o columnas y microfluídica, están bien descritas, y se han desarrollado modernos procedimientos suplementarios para superar y minimizar limitaciones técnicas en cada enfoque11,12,13,14,15. Otros han demostrado que una centrifugación ultrafiltración (UFC) con una membrana nanoporosa en la unidad de filtración es una técnica alternativa que proporciona pureza comparable a una UC método16,17,18. Esta técnica podría considerarse como uno de los métodos de aislamiento alternativos.
Lavado broncoalveolar (BALF) contiene EVs que poseen numerosas funciones biológicas en diferentes afecciones respiratorias19,20,21,22. Estudio de EVs BALF derivados conlleva algunos problemas debido a la invasividad del procedimiento de broncoscopia en los seres humanos, así como una cantidad limitada de recuperación de líquido de lavado. En animales de laboratorio pequeños tales como ratones, sólo unos pocos mililitros pueden recuperarse en afecciones pulmonares normales, mucho menos en los pulmones inflamados o fibrótica23. Por lo tanto, recoger una cantidad suficiente de BALF para aislamiento de EV por una ultracentrifugación diferencial para aplicaciones posteriores puede no ser factible. Sin embargo, aislando poblaciones EV correcto es un factor crucial para el estudio de las funciones biológicas de la EV. El delicado equilibrio entre la eficiencia y eficacia continúa siendo un desafío en métodos de aislamiento de EV bien establecidos.
En este estudio, demostramos que un enfoque de ultrafiltración centrífugo, utilizando una unidad de filtro del 100 kDa peso molecular (MWCO) de corte nanomembrane, es conveniente para pequeño volumen de muestra biológica como BALF. Esta técnica es simple, eficaz y proporciona escalabilidad para apoyar el estudio de los vehículos eléctricos derivados de BALF y alta pureza.

<table><tbody><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amicon Filtros centrífugos Ultra-15 Ultracel-100K</td><td>Sigma-Millipore, St. Louis, MO</td><td>UFC910024</td><td></td></tr> solución <tr><td>salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS)</td><td>Corning Cellgro, Manassas, VA</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma-Millipore, St. Louis, MO</td><td>EMD8550</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Productos de investigación Internacional, Prospecto, IL</td><td>75277-39-3</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Corning Cellgro, Manassas, VA</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma-Millipore, St. Louis, MO</td><td>S3014-1KG</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep</td><td>Sigma-Millipore, St. Louis, MO</td><td>MKCD9753</td><td>Medio de gradiente de densidad</td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>VetOne, Boise, ID</td><td>13985-702-10</td><td></td></tr><tr><td>Xilacina</td><td>Akorn Animal Health, Lake Forest, IL</td><td>59399-110-20</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa 1 mL</td><td>BD Jeringa, Franklin Lakes, NJ</td><td>309656</td><td></td></tr><tr><td>Angiocatéter 20 G</td><td>Jeringa BD, Franklin Lakes, NJ</td><td>381703</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga 15 mL</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>89039-666</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga 50 mL</td><td>Corning Cellgro, Manassas, VA</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>Ensayo de proteínas de ácido bicinchónico (BCA)</td><td>Pierce, Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo TSG101 anti-ratón para conejos</td><td>AbCam, Cambridge, MA</td><td>AB125011</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo PE-CD63 anti-ratón para ratas</td><td>Biolegend, San Diego, CA</td><td>143904</td><td></td></tr><tr><td>CD81</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD9</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-conejo, anticuerpo ligado a HRP</td><td>Tecnología de señalización celular, Danvers, MA</td><td>7074S</td><td></td></tr><tr><td>4x LDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x Agente reductor (Bolt)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x Tampón de lisis (Bolt)</td><td>Tecnología de señalización celular, Danvers, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bolt 4-12% Bis-Tris Plus gel de acrilamida</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>NW04120</td><td></td></tr><tr><td>iBlot 2 Mini pilas de nitrocelulosa</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>IB23002</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo de detección de anticuerpos HRP quimioluminiscente HyGLO</td><td>Denville Scientific, Holliston, MA</td><td>E2400</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de ultracentrífuga 17 mL</td><td>Beckman Coulter, Pasadena, CA</td><td>337986</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de ultracentrífuga 38,5 mL</td><td>Beckman Coulter, Pasadena, CA</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de jeringa Corning SFCA 0.2 y micro; m pore</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>09-754-13</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td>Centrifuge Eppendorf, Hamburgo, Alemania-Ultracentrífuga Beckman Coulter, Pasadena, CA-Nanosight (NS300)Malvern, Worcestershire, Reino Unido-Para medir la distribución del tamaño de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> partícula y <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> concentración de partículas</td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer 10 citómetro de flujo</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania-iBlot</td> Aparato <td>de</td><td></td></tr> <tr><td>transferencia</td><td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA-Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ChemiDoc MP Imaging System</td><td>Bio-Rad, Hercules, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo v. 10</td><td></td><td></td><td>Software de análisis</td></tr></tbody></table>

aislamiento de las vesículas extracelulares del líquido de lavado broncoalveolar murino utilizando una técnica de centrifugación ultrafiltración

Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique

Las vesículas extracelulares (EVs) son recién descubiertos componentes subcelulares que desempeñan papeles importantes en muchos biológico funciones de señalización durante los Estados fisiológicos y patológicos. El aislamiento de los vehículos eléctricos continúa siendo un desafío importante en este campo, debido a las limitaciones intrínsecas a cada técnica. La ultracentrifugación diferencial con el método de centrifugación del gradiente de densidad es un enfoque utilizado y se considera que el procedimiento estándar de oro para el aislamiento de EV. Sin embargo, este procedimiento requiere mucho tiempo, mano de obra intensiva y generalmente resulta en baja escalabilidad, que puede no ser adecuado para muestras de pequeño volumen como el lavado broncoalveolar. Demostramos que un método de aislamiento de centrifugación ultrafiltración es simple y tiempo y mano de obra eficiente todavía proporciona un rendimiento de alta recuperación y pureza. Proponemos que este método de aislamiento podría ser una alternativa adecuada para el aislamiento de EV, particularmente para pequeño volumen de especímenes biológicos.

Realizamos aislamiento de EV de ratón BALF utilizando métodos de aislamiento de UFC y UC-DGC en el mismo día. El método UFC requiere aproximadamente 2.5-3 h, mientras que la técnica de la UC-DGC requiere 8 horas de tiempo de procesamiento. Esto no incluye los amortiguadores y los reactivo tiempo de preparación. Cabe señalar que algunas de las tareas pueden realizarse en los períodos de tiempo de centrifugación. Sin embargo, todo el procedimiento duró casi un día entero para la técnica de ...

Aquí, describimos a dos protocolos de aislamiento de vesículas extracelulares, ultrafiltración centrifugación y ultracentrifugación con centrifugación gradiente de densidad, para aislar las vesículas extracelulares de muestras de líquidos de lavado broncoalveolar murino. Las vesículas extracelulares derivadas del líquido de lavado broncoalveolar murino por ambos métodos se cuantifica y caracteriza.

Aislamiento de las vesículas extracelulares del líquido de lavado broncoalveolar murino utilizando una técnica de centrifugación ultrafiltración

Extracellular vesicles (EVs) are newly discovered subcellular components that play important roles in many biological signaling functions during ...

Este método puede ayudar a abordar preguntas relacionadas con la eficiencia, el rendimiento de recuperación y la pureza de las vesículas extracelulares derivadas del líquido de lavado broncoalveolar utilizando un enfoque de centrifugación de ultrafiltración. Comparamos directamente esta técnica con una técnica de purificación de gradiente de ultracentrifugación y densidad. La principal ventaja de esta técnica es que es simple, eficiente y adecuada para muestras de pequeño volumen como el líquido de lavado broncoalveolar murino.Lo que es más importante, proporciona alta pureza y escalabilidad significativamente mayor en comparación con un método de aislamiento de ultracentrifugación. Norman Garrett III, investigador asociado de mi laboratorio. Para comenzar, inserte un angiocatéter calibre 22 en la tráquea de un ratón eutanizado.Coloque una jeringa de insulina con un mililitro de DPBS estéril con frío helado e incultre un mililitro en ambos pulmones. Retire lentamente el émbolo de la jeringa para recuperar el líquido de lavado broncoalveolar o líquido BAL. Y dispensar el líquido BAL en un tubo cónico sobre hielo.Después de esto, tire del líquido BAL de 25 ratones y divídalo en dos conjuntos iguales. Centrifugar el líquido BAL a 400 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Recoger el sobrenadante y centrifugarlo a 15.000 veces G a cuatro grados centígrados durante 10 minutos.A continuación, recoja el sobrenadante y proceda a los pasos de aislamiento EV inmediatamente. En primer lugar, filtre el súper natant a través de un filtro de jeringa estéril de 0,2 micrómetros. Después de esto, equilibre la unidad de filtro centrífuga con DPBS estéril durante 10 minutos.Luego centrifuga la unidad centrífuga a 15.000 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Llene el filtro con 15 mililitros de líquido BAL. Y centrifugarlo a 3.000 G por 30 minutos a cuatro grados centígrados.Después de esto, lave el retentate con 14 mililitros de DPBS estériles pipeteando suavemente repetidamente. Centrifugar la unidad de filtro a 3.000 G a cuatro grados centígrados durante 30 minutos para retirar el DPBS y concentrar el retentato. Para recoger los EV derivados del fluido BAL concentrado, inserte una pipeta en la parte inferior de la unidad de filtro y retire la muestra utilizando un movimiento de barrido de lado a lado.A continuación, aliquot el líquido BAL derivado EV's y almacenarlos en menos 80 grados celsius. Alternativamente, comience transfiriendo el sobrenadante adquirido anterior a un tubo de ultracentrífuga. Y centrifugarlo a 10.000 G por 30 minutos a cuatro grados centígrados.A continuación, recoger el sobrenadante y centrífuga. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet EV en 200 microlitros de DPBS. Después de esto, mezcle la suspensión EV con 300 microlitros de solución de trabajo 50%iodixanol.Y transfiéralo a un tubo ultracentrífugo de 15 mililitros. A continuación, agregue la solución de búfer de acuerdo con el protocolo de texto para crear un gradiente de densidad boyante y centrifúelo a 100.000 G durante tres horas y 50 minutos. Recoger el 15% y el 25%fracciones de iodixanol, y diluirlos en DPBS para llevar el volumen hasta 15 mililitros.Transfiera las fracciones a un nuevo tubo de ultracentrífuga y centrifugar a 100.000 G a cuatro grados centígrados durante 60 minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender los pellets EV en 50 microlitros de DPBS estériles. Para comenzar el análisis de seguimiento de nanopartículas, diluya la muestra EV en un mililitro de DPBS.Y cargue la muestra en una jeringa de insulina. Después de esto, conecte la jeringa a una bomba de jeringa y mida los números y el tamaño de las partículas. Establezca el nivel de la cámara en 14 y el umbral de detección en uno.A continuación, utilice un lector de placas para cuantificar la cantidad de proteína en la muestra EV mediante la detección colorimétrica. Disolver una cantidad igual de proteína EV de cada muestra con un tampón de carga de hinchazón y TDT. A continuación, caliente las muestras a 70 grados centígrados durante 10 minutos.Cargue las muestras en un gel de acrilamida Bis-Tris Plus y ejecute la electroforesis durante 35 minutos. A continuación, transfiera las proteínas a una membrana de nitrocelulosa utilizando un método de transferencia en seco. Después de esto, bloquear la membrana con cinco por ciento de leche desnatada durante 60 minutos con suave balanceo.Incubar la membrana con un anticuerpo a un marcador de proteína superficial EV a cuatro grados centígrados con un suave balanceo durante la noche. Desarrollar la membrana incubando la membrana con anticuerpo de enlace HRP durante 60 minutos a temperatura ambiente. Lave la membrana durante 10 minutos con el tampón TBST tres veces.Por último, desarrolle la membrana con reactivo quimiominiscente de detección de anticuerpos HRP antes de proceder a la toma de imágenes. Para comenzar la citometría de flujo, diluir los EV derivados del fluido BAL en 49 microlitros de tampón de tinción PEB. Luego agregue tres anticuerpos a cada una de las muestras, antes de incubar las muestras a cuatro grados centígrados con balanceo durante 60 minutos en la oscuridad.Por último, diluir las muestras con 40 microlitros de tampón de tinción PEB filtrada por membrana y realizar análisis de citometría de flujo. En este protocolo, los EV fueron aislados del fluido BAL del ratón usando un método UFC y UC-DGC. Los EV derivados del fluido BAL de ratones normales aislados por el método UFC mostraban tamaños más pequeños y una distribución de tamaño más uniforme que las uc-DGC-EV.La técnica UFC también tuvo un recuento total de partículas significativamente mayor en comparación con la técnica UC-DGC. La recuperación total de proteínas medida en miligramos de UFC-EV también fue mayor que la de la UC-DGC-EV, lo que indica que la técnica de UFC es más eficiente en tiempo y esfuerzo. Finalmente, los EV derivados del fluido BAL también se caracterizaron aún más a través de la citometría de flujo.Los UFC-EV y UC-DGC-EV expresaron CD63, CD9 y CD81. Al intentar este procedimiento, es importante recordar rehidratar la membrana de la unidad de ultrafiltración con DPBS. Una vez que la membrana está hidratada, la unidad debe mantenerse húmeda en todo momento hasta que se utilice.Recuperar el retentato de vesícula extracelular de la unidad de filtro puede ser un desafío. Asegúrese de que la punta de la pipeta esté barrida de lado a lado para recuperar la mayor parte de los EV de la unidad de filtro. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del aislamiento de vesícula extracelular exploraran las funciones biológicas del lavado broncoalveolar derivado de vesículas extracelulares derivadas tanto en condiciones normales como patológicas en animales pequeños.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Fuente: Watson, D. C., et.al. Aislamiento y purificación escalables de vesículas extracelulares de Escherichia coli y otras bacterias. J. Vis. Exp. (2021)Este video demuestra el aislamiento y la concentración de vesículas extracelulares (EV) derivadas de la membrana externa de bacterias modificadas genéticamente. El proceso consiste en cultivar las bacterias para liberar vehículos eléctricos, seguido de pasos secuenciales de centrifugación y filtración para eliminar células y desechos.

Aislamiento y enriquecimiento de vesículas extracelulares derivadas de la membrana externa de bacterias

Source: DeMarino, C., et al. Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus. J. Vis. Exp. (2019)The video demonstrates the separation of EVs from virions and other contaminants by density gradient centrifugation, followed by capture and concentration with hydrogel nanoparticles. Washed fractions are then ready for downstream identification of those enriched in EVs.

Separation and Enrichment of Extracellular Vesicles in the Presence of Virions

Este es un protocolo para aislar las vesículas extracelulares del tejido (EV) del hígado. El protocolo describe un proceso de dos pasos que implica perfusión de colagenasa seguido de ultracentrifugación diferencial para aislar los vehículos eléctricos de tejido hepático.

Aislamiento de las vesículas extracelulares de tejido del hígado

Este protocolo aísla las vesículas extracelulares (EV) lejos de los viriones con alta eficiencia y rendimiento mediante la incorporación de precipitación EV, ultracentrifugación de gradiente de densidad y captura de partículas para permitir un flujo de trabajo simplificado y una reducción del inicio requisitos de volumen, lo que resulta en preparaciones reproducibles para su uso en todas las investigaciones de vehículos eléctrico.

Purificación de preparaciones de vesícula extracelular de alto rendimiento lejos del virus

Este protocolo demuestra cómo aislar pequeñas vesículas extracelulares de células madre mesenquimales derivadas del cordón umbilical humano (hUC-MSC-sEV) con un entorno de laboratorio simple. La distribución del tamaño, la concentración de proteínas, los marcadores de sEV y la morfología de los hUC-MSC-sEV aislados se caracterizan por el análisis de seguimiento de nanopartículas, el ensayo de proteínas BCA, el western blot y el microscopio electrónico de transmisión, respectivamente.

Un método simple de filtración de sobremesa para aislar pequeñas vesículas extracelulares de células madre mesenquimales humanas

Este estudio describe un método para aislar y purificar vesículas extracelulares bacterianas (BEV) enriquecidas a partir de heces humanas mediante centrifugación en gradiente de densidad (DGC), identifica las características físicas de los BEV a partir de la morfología, el tamaño de partícula y la concentración, y discute las posibles aplicaciones del enfoque DGC en la investigación clínica y científica.

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Las vesículas extracelulares son muy prometedoras para las aplicaciones biomédicas, pero los métodos de aislamiento actuales requieren mucho tiempo y no son prácticos para el uso clínico. En este estudio, presentamos un dispositivo microfluídico que permite el aislamiento directo de vesículas extracelulares de grandes volúmenes de biofluidos de forma continua y con pasos mínimos.

Aislamiento en un solo paso de vesículas extracelulares a partir de muestras de gran volumen con un dispositivo microfluídico A4F bifurcado

Este artículo describe una metodología para el aislamiento, caracterización y cuantificación de vesículas extracelulares (EV) derivadas del plasma humano y presenta un flujo de trabajo para el análisis sin etiquetas del proteoma EV utilizando cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS).

Aislamiento, caracterización y análisis proteómico de vesículas extracelulares derivadas del plasma para el descubrimiento de biomarcadores cardiovasculares

Este protocolo está diseñado para acelerar y permitir el aislamiento efectivo de vesículas extracelulares de la leche materna humana con alta pureza.

Aislamiento rápido de vesículas extracelulares derivadas de la leche materna humana

Este protocolo describe el aislamiento de pequeñas vesículas extracelulares del músculo esquelético murino y la médula ósea mediante digestión enzimática y cromatografía de exclusión de tamaño, permitiendo la recuperación reproducible de fracciones enriquecidas con vesículas de tejidos estructuralmente complejos y de bajo rendimiento para análisis molecular posteriores.

Aislamiento de pequeñas vesículas extracelulares del músculo esquelético murino y médula ósea mediante cromatografía de exclusión de tamaño

Aprenda a aislar vesículas extracelulares de lavado broncoalveolar murino mediante centrifugación ultrafiltración. Este método ofrece mayor pureza, eficiencia y escalabilidad comparado con ultracentrifugación tradicional.

Aislamiento de las vesículas extracelulares del líquido de lavado broncoalveolar murino utilizando una técnica de centrifugación ultrafiltración (Video) | JoVE Journal

Aislamiento de las vesículas extracelulares del líquido de lavado broncoalveolar murino utilizando una técnica de centrifugación ultrafiltración

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