Aislamiento de glomérulos y en Vivo de etiquetado de proteínas de la superficie celular Glomerular

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la nefrología sobre el papel del tráfico de proteínas de superficie celular en la enfermedad renal proteluica y no protegica. Las principales ventajas de esta técnica son que facilita el estudio del tráfico de proteínas superficiales celulares in-vivo y que se puede analizar más de una proteína por experimento. Aunque este método puede proporcionar información sobre el tráfico de superficies de células glomerulares, también se puede aplicar a otros sistemas de órganos que se perfunden y son accesibles mediante técnicas de aislamiento.

Comience por confirmar la falta de respuesta al pellizco del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo y desinfectar el lado ventral del ratón anestesiado con 70%isopropílico. Haz un corte medio a través de la piel desde la pelvis hasta el esternón y usa pinzas para eliminar la piel de la fascia abdominal. Corta la piel a ambos lados de la línea media abdominal y haz un medio a través de la capa muscular abdominal desde la vejiga hasta el xifoide.

Utilice las tijeras y fórceps para dividir los músculos en cuatro cuadrantes y utilizar dos abrazaderas quirúrgicas para asegurar los dos cuadrantes superiores hacia el cuello de los animales. Coloque al animal bajo un microscopio diseccionado y use un intercambio estéril para dejar de lado los órganos viscerales. Usando tijeras finas, corte el ligamento frénico hepático.

Usando pinzas quirúrgicas finas, coloque una sutura alrededor de la arteria mesentérica hepática branial de las arterias renales. Y alrededor de la aorta, proximal a las arterias renales, en la glándula suprarrenal. Libera la aorta distal de la fascia, la grasa y otros tejidos.

A continuación, sujetar la vena cava y la aorta a la altura de la bifurcación y colocar otra sutura alrededor de la aorta distal de las arterias renales. Utilice pinzas para apretar la sutura aórtica proximal, atenuando el flujo sanguíneo y cortando una pequeña mitad del diámetro de la aorta en la aorta, distal a las arterias renales. Inserte un catéter de 10 centímetros unido a una jeringa de 10 mililitros que contenga cinco mililitros de PBS fríos más calcio y magnesio en la aorta.

Y arregla el catéter con las ligaduras preparadas. Luego comience a perfundir los riñones a un flujo de dos mililitros por minuto. Usar tijeras finas para cortar un agujero en la vena renal en las arterias renales y apretar la sutura alrededor de las arterias hepáticas y mesentéricas.

Después de que todo el volumen de PBS se ha entregado reemplazar el perfusato con cinco mililitros de PBS helado más calcio y magnesio complementado con 0,5 miligramos por mililitro de biotina para el etiquetado de superficie. Continúe perfundiendo los riñones a un caudal de dos mililitros por minuto. Cuando se haya entregado todo el volumen, adjunte al catéter una jeringa que contenga cinco mililitros de PBS helado más calcio y magnesio suplementados con 100 mililitros de glicina.

Apagar los glomérulos con los cinco mililitros de la solución de glicina a un caudal de dos mililitros por minuto. Luego perfunde los riñones con cinco mililitros de PBS helado más calcio y magnesio complementados con 200 microlitros de cuentas magnéticas por mililitro a un caudal de dos mililitros por minuto. La embolización de los glomérulos con las cuentas magnéticas marrones será visible en la superficie renal.

Cuando se hayan entregado todas las cuentas, retire la cápsula de los riñones y recoja los riñones en el hilum. Coloque los riñones en un plato de cultivo celular de 10 centímetros que contenga 15 mililitros de PBS más calcio y magnesio. Utilice una nueva hoja de doble filo para cortar los riñones en las piezas más pequeñas posibles.

Transfiera el tejido a un tubo de dos mililitros que contenga un mililitro de colagenasa A durante 30 minutos a 37 grados centígrados, mezclando suavemente la solución de tejido antes y después de la digestión con una punta de pipeta de 1000 microlitros modificada. Al final de la incubación, filtre el tejido digerido a través de un colador celular de 100 micras. Usa un rascador celular y PBS helado más calcio y magnesio para triturar el tejido restante a través del colador celular.

Lleve el volumen final de la suspensión renal de una sola célula hasta 50 mililitros con PBS frío fresco más calcio y magnesio y recoja las células renales por centrifugación. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet con algo menos de 1,5 mililitros de PBS helado más calcio y magnesio mientras vórtice y transfiera la suspensión glomerular a un nuevo tubo de dos mililitros. Para lavar los glomérulos, coloque el tubo en un imán para agregar los glomérulos.

Después de un minuto, utilice una pipeta de 1000 microlitrotro para quitar el sobrenadante. Y retire el tubo del imán. Añadir un mililitro de PBS más calcio y magnesio a los tejidos.

Pipetear los glomérulos una vez y vórtice las células. Vuelva a colocar el tubo en el imán y lave los glomérulos de nuevo como se acaba de demostrar. Hasta que una pureza de la muestra haya alcanzado al menos el 90% mediante el análisis del microscopio de luz en un aumento de 40 a 100 X.

A continuación, recoger el perla magnética purificada glomérulos por centrifugación. Para lograr una pureza superior al 95%, los glomérulos necesitaban lavarse a fondo como se demostró. La perfusión de biotina facilita el etiquetado de los lazos capilares en los riñones de ratón perfundidos no controlados.

La precipitación inmune de la fracción de biotina de los extractos glomerulares revela que las proteínas transmembranas glomerulares nefrina y podocalíxina son inmunoprecipitadas con la biotina pero no con la fracción de control. La tinción de la fracción inmunoprecipitada con estreptavidina confirma aún más la presencia de nefrina ladada de biotina en la biotina perfundida pero no en animales perfundidos de control. La cadherina endotelial vascular de la proteína endotelial y la molécula de adhesión intracelular dos también son inmunoprecipitadas dentro de la fracción de biotina.

En la fase temprana de la nefritis nefrotóxica se observa una expresión reducida de nefrina superficial celular en animales nefritis nefrotóxicos en comparación con los controles. De hecho, el análisis densitomético muestra una reducción significativa de la nefrina con cordones de biotina en animales nefroticos nefritis en comparación con los controladores. El análisis cuantitativo de la relación total de nefrina a actina no revela diferencias significativas entre los ratones con nefritis nefrotica y de control.

Además, se observan cantidades iguales de podocitos en nefritis nefrotóxica y animales de control. En nefritis nefrotóxica tardía, los animales nefríticos nefréticos nefrotóxicos presentan una recuperación de la expresión de nefrina sin diferencias significativas en la nefrina de la superficie celular medida entre ratones nefríticos nefricos de control y nefréticos nefroticos nefrotóxicos y una reducción total general de la nefrítica en animales nefrípticos nefrotíxicos. Además, el número de podocitos disminuye en comparación con los animales de control.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener las jeringas libres de burbujas durante su conexión con el fin de evitar la embolia de aire de los glomérulos y trabajar bajo condiciones de frío helado una vez que la perfusión renal ha comenzado. Siguiendo este procedimiento se pueden realizar otros métodos como el aislamiento del ARN y la proteína de los glomérulos para responder preguntas adicionales sobre la expresión de proteínas o las interacciones en riñones sanos y enfermos.