Identificación y análisis de los progenitores eritroides ratón usando el CD71/TER119 citometría de flujo ensayo

El objetivo general del siguiente experimento es identificar precursores de glóbulos rojos directamente en tejido recién recolectado en ratones. Esto nos permite estudiar sus propiedades moleculares en momentos en los que el sistema eritropoyético de estos ratones está en proceso de cambio. Por ejemplo, durante el desarrollo embrionario o durante la respuesta al estrés hipóxico, primero se aísla tejido hematopoyético del hígado fetal de ratón o del bazo o médula ósea adulto y se disocia en una suspensión de una sola célula.

A continuación, las células se marcan con anticuerpos contra los marcadores de superficie celular CD 71 y TER one 19, y con cualquier otro marcador de interés, por ejemplo, para medir la supervivencia celular o el estado del ciclo celular, la suspensión celular marcada se analiza utilizando un analizador de citometría de flujo y se identifican subconjuntos específicos de eritroblastos en distintas etapas de maduración. Estos subconjuntos específicos se pueden purificar mediante la clasificación de células. Posteriormente, se pueden llevar a cabo análisis celulares y moleculares para cada subconjunto de maduración de eritroblastos.

La capacidad de identificar eritroblastos en etapas específicas de maduración directamente en tejidos hematopoyéticos recién aislados nos da la oportunidad de estudiar las células de la corteza fisiológica. Por lo tanto, este método nos permite estudiar eritroblastos altos de diferentes etapas de maduración, que responden in vivo. Cuando los ratones se someten a estímulos, aceleran la caja eritropoyética.

Por ejemplo, condiciones hipóxicas que imitan la gran altitud o la inyección de la hormona eritropoyetina. Utilizamos la citometría de flujo multiparamétrica para identificar un bulto dentro de un entorno tisular complejo y, al mismo tiempo, estudiar su señalización, supervivencia y estado del ciclo celular. También podemos clasificar los eritroblastos en sus etapas específicas de maduración directamente a partir de tejido fresco y explorar sus niveles de expresión génica, estado de la cromatina u otras funciones moleculares.

La eritropoyesis definitiva del ratón tiene lugar en el bazo y la médula ósea del ratón adulto. Por lo tanto, estos tejidos se extraerán de un ratón sacrificado. Después de la eutanasia del ratón, extraiga sangre por punción cardíaca en tubos de recolección de sangre con EDTA o heparina, esta sangre se utilizará posteriormente para el recuento de hematocrito, el recuento de reticulocitos o el análisis de hemograma.

Coloque el bazo y el fémur extraídos en tubos separados que contengan tinción fría. Búfer. Mantenga los pañuelos recolectados en hielo si lo desea. Pesa el bazo.

Es probable que los ratones que experimentan una respuesta de estrés eritropoyético muestren un aumento significativo en el peso del bazo. Posteriormente, las células del bazo y las células de la médula ósea se preparan a partir de los tejidos recolectados mediante procedimientos demostrados previamente en el embrión de ratón. La eritropoyesis definitiva tiene lugar en el hígado fetal entre los días embrionarios 12,5 y 15,5.

Los ratones hembra preñados cronometrados se preparan para obtener células hepáticas fetales en los días 12,5 a 14,5 de embarazo. Las ratas hembras preñadas cronometradas se sacrifican y los cuernos uterinos se extraen en una placa de Petri que contiene hielo. Medio de cultivo en frío o tampón de tinción.

Se requiere un microscopio de disección para diseccionar el hígado fetal desde el día embrionario 12.5 o menos para extraer embriones del útero. Primero separa cada cuenta del cuerno. A continuación, extirpa suavemente la pared del útero para liberar el embrión que se encuentra dentro de su saco amniótico.

Despegue suavemente la membrana amniótica. El hígado fetal es el tejido abdominal rojo más grande ubicado debajo de un corazón mucho más pequeño. Para diseccionar el hígado fetal, use fórceps para inmovilizar el embrión a ambos lados del hígado y empuje suavemente el hígado fuera del abdomen hacia el medio.

Transfirió suavemente el hígado a un tubo que contenía tampón de tinción fresco. Después de todo, los hígados fetales han sido diseccionados y transferidos a un tubo que contiene tinción fresca. El tampón disocia los hígados mecánicamente mediante pipeteo, luego filtra las células disociadas a través de una pantalla de malla de nailon de 40 micras y lava las celdas dos veces por centrifugación, descartando el sobrenadante y el resus suspendidos en el tampón de tinción.

Después del segundo lavado, tiña las células con azul trian y cuenta con un hemocímetro. Un hígado fetal en E 13.5 tiene alrededor de 10 a la séptima. Las células resuspenden las células en una o dos veces 10 a la sexta célula por muestra de 200 microlitros para el análisis de citometría de flujo.

A los efectos de este protocolo de vídeo, la tinción de anticuerpos para la citometría de flujo se demostrará solo en las células hepáticas fetales. Para comenzar este procedimiento, prepare una premezcla de tinción de anticuerpos primarios que contenga lo siguiente, IgG de conejo purificada para bloquear los receptores FC en células de ratón CD 71 FETR one 19 PE y un anticuerpo dirigido rápidamente a la proteína de la superficie celular. Mezcle suavemente la solución de anticuerpos invirtiendo el tubo dos o tres veces, agregue 200 microlitros de la tinción de anticuerpos primarios premezclada a la muestra de células hepáticas fetales previamente preparada y pipetee hacia arriba y hacia abajo suavemente para resuspender las células.

A continuación, prepare estas seis muestras de células de control. Una muestra sin teñir en la que las células se dejan en tampón de tinción para proporcionar la autofluorescencia de fondo de las células, un solo color para cada anticuerpo o color utilizado en el protocolo para corregir la superposición espectral entre los canales, que en este experimento son TUR uno 19 PE CD 71 fz rápido, biotina y estreptavidina A PC y siete A A DA fluorescencia menos un control para biotina rápida, que proporciona el verdadero fondo para ese canal donde las células se tiñen con todos los colores o anticuerpos del protocolo, excepto la biotina rápida. Incubar la muestra y los controles pertinentes en la tinción de anticuerpos primarios en hielo durante 45 minutos a una hora en la oscuridad.

Al final de la incubación, lave las células agregando tres mililitros de tampón de tinción a cada tubo de muestra y centrifugue durante tres a cinco minutos a aproximadamente 400 veces la gravedad a cuatro grados centígrados. A continuación, aplique el estreptococo ávido en una PC e incube los tubos en hielo durante 30 a 45 minutos. Al finalizar la incubación, lave las células como para la primera tinción de anticuerpos.

Finalmente, vuelva a suspender las células en una solución de tinción que contenga la célula impermeable, colorante de ADN siete a d para excluir las células muertas. Las muestras ya están listas para el análisis por citometría de flujo. El aspecto más difícil de este procedimiento es el análisis correcto de los eventos citométricos de flujo, lo que permite la identificación confiable de los subconjuntos de eritroblastos.

Requiere una configuración cuidadosa de la máquina para todas las muestras de control correctas, una compensación cuidadosa para la superposición espectral y la posterior compuerta que excluya las células muertas, los agregados y los eventos muy pequeños. Al inicio del análisis de datos. La muestra sin teñir y las muestras de control de color individuales se utilizan para configurar la compensación de la superposición espectral para cada combinación de colores.

En este ejemplo, mostraremos cómo se derrama la fluorescencia fit e en el canal PE y cómo se corrige esta superposición espectral después de la compensación. En primer lugar, utilizando el control sin tinción, definimos una región E positiva y una región PE negativa. A continuación, utilizando el control de color único fit E, podemos visualizar el desbordamiento espectral en el canal PE.

Después de la compensación digital con el software FlowJo, se minimiza la señal E de ajuste de desbordamiento en el canal PE. Una vez compensadas, las células muertas, los agregados y los eventos pequeños se pueden eliminar. Los agregados y los dobletes de celdas se eliminan trazando la altura de dispersión hacia adelante frente al área de dispersión hacia adelante y seleccionando los eventos dentro de una puerta diagonal estrecha.

Las células muertas se eliminan seleccionando las células que son negativas para la muerte del ADN impermeable de la célula Dapi A. La puerta de células viables negativas DAPI también excluye eventos muy pequeños, como núcleos o desechos, que tienen una dispersión directa muy baja. A continuación, mostraremos la estrategia de activación de las células hepáticas fetales.

Las células recién recolectadas se marcaron para CD 71 TUR one 19, y un cóctel de anticuerpos marcados con ZI dirigidos a marcadores de linaje no eritroides. En este ejemplo, las muestras ya han sido compensadas por la superposición espectral y luego se han restringido para excluir agregados, celdas muertas y eventos muy pequeños. Utilizamos la muestra FMO que contiene todos los colores excepto la tinción de fitzy positiva para el linaje para trazar un histograma de Fitzy y definir la puerta de la célula negativa del linaje, a continuación aplicamos esta puerta a la muestra de células hepáticas fetales que se tiñó con marcadores de linaje conjugados ZI.

Las celdas negativas de linaje se seleccionan y se trazan con CD 71 en el eje Y y TER uno 19. En el eje A, las celdas ahora están listas para dividirse en subconjuntos S cero a S cinco. El subconjunto S cero agotado de Lin contiene en gran medida células con potencial CFUE antes del inicio de la dependencia de EPO.

El subconjunto S one contiene células CFUE dependientes de EPO en gran parte en la fase S del ciclo celular. Las células del subconjunto S, dos han perdido el potencial de formación de colonias y están comenzando a expresar hemoglobina, las células del subconjunto S3 son en gran parte basófilas, los subconjuntos S cuatro y S cinco contienen eritroblastos tardíos. Aquí se muestra la estrategia de análisis después de la adquisición de datos de las células del bazo procesadas y marcadas con anticuerpos dirigidos a CD 71 y TER one 19, así como el histograma rápido del receptor de muerte.

Uno muestra todos los eventos adquiridos donde la puerta diagonal representa eventos que probablemente sean celdas individuales, excluyendo dobletes o agregados más grandes. Las celdas de esta puerta se analizan más a fondo en el histograma dos aquí. Se excluyen los eventos muy pequeños, probablemente núcleos o escombros.

Las células controladas se muestran en el histograma tres, donde las células DAPI positivas que probablemente sean células apoptóticas permeables a la membrana se excluyen del análisis posterior. El histograma cuatro muestra la población resultante de células viables del bazo. El pro eGate contiene CD 71 TER de alta una, 19 celdas intermedias tur R una 19 celdas de alta altura se analizan más a fondo en el histograma cinco.

Aquí, las células altas CD 71 se subdividen en eritroblastos de área grande menos maduros, a y eritroblastos A B más pequeños y maduros. El subconjunto de eritroblastos más maduro es ARI C. La expresión de proteínas de la superficie celular puede medirse simultáneamente para cada uno de estos subconjuntos añadiendo los anticuerpos relevantes al mismo tiempo que TER R one 19 y CD 71. El histograma de tinción seis muestra la expresión rápida del receptor de muerte en la superficie celular, específicamente en el subconjunto A del área en ratones en estado basal y ratones inyectados con una dosis única de E ppo.

Los resultados indican que la EPO suprime la expresión rápida en el área. La expresión in vivo de una población de proteínas intracelulares o el estado del ciclo celular también se puede medir para las células de cada subconjunto. En este análisis representativo del ciclo celular, los ratones fueron inyectados intraperitonealmente con BRDU y la médula ósea se extrajo de 30 a 60 minutos después.

Además de ser teñidas para CD 71 y TER one 19, las células fueron teñidas para la incorporación de BRDU en su replicación D-N-A-B-R-D-U, las células positivas están en la fase S del ciclo. Las celdas de interfaz son BRDU negativas y pueden resolverse en fases G uno o G dos M. Usando el ADN, se pueden clasificar siete celdas A, A, D de cada uno de los subconjuntos PRO E, área A, A, A B y A EC.

Aquí se muestran en preparaciones de citosina, mostrando una maduración secuencial con disminución del tamaño de las células, condensación nuclear y aumento de la coloración marrón, lo que refleja la expresión de hemoglobina. Por último, se muestra un análisis representativo del ciclo celular del subconjunto S3 en el hígado fetal E 13.5. A los ratones preñados se les inyectó BRDU.

Los hígados fetales se recolectaron entre 30 y 60 minutos después con perma fija y se tiñeron con anticuerpos contra CD 71, TER one 19 y BRDU. Se analiza el estado del ciclo celular de las células S3 donde se encuentran las células de fase S. BRDU positivo y el contenido de ADN se cuantifica mediante tinción para el colorante de ADN siete A a d.

El enfoque citométrico que describimos permite la investigación simultánea de las funciones celulares, como la expresión de marcadores de superficie celular y otras proteínas, la supervivencia celular, la señalización celular mediante anticuerpos fosso específicos y el estado del ciclo celular. Por lo tanto, nos permite investigar las respuestas moleculares de los eritroblastos, una etapa de maduración diferente a una amplia gama de estímulos o el efecto de mutaciones genéticas. Cabe señalar que los subconjuntos de maduración de citometría de flujo se definen en términos de expresión de marcadores de superficie celular y dispersión directa.

Descubrimos que, en general, las células de cada subconjunto corresponden a un estadio morfológico de eritroblasto similar en una amplia variedad de modelos de ratón. Sin embargo, se recomienda verificar esto al examinar un nuevo modelo de ratón. Al clasificar las células de cada subconjunto y examinar su morfología, las células de cada subconjunto también se pueden clasificar para el análisis de ARN o transcriptoma: los experimentos de clasificación utilizan bajas presiones de clasificación y narices anchas para minimizar el estrés absoluto en las células.

También recomendamos comprobar la pureza y viabilidad de las células después de cada experimento de clasificación. Por último, al detectar un cambio en la frecuencia de un subconjunto dado, es importante determinar si esto se debe a un cambio real en el número de celdas de ese subconjunto o si se debe a cambios en otros subconjuntos. Por lo tanto, además de medir las frecuencias de los subconjuntos, siempre es necesario medir también el número absoluto de celdas en cada subconjunto.