Identificación y análisis de los progenitores eritroides ratón usando el CD71/TER119 citometría de flujo ensayo

El objetivo general del siguiente experimento consiste en identificar directamente los precursores de los glóbulos rojos en tejido recién obtenido de ratones. Esto nos permite estudiar sus propiedades moleculares durante los periodos en que el sistema eritropoyético de estos ratones está experimentando cambios. Por ejemplo, durante el desarrollo embrionario o durante la respuesta al estrés hipóxico, primero se aísla el tejido hematopoyético del hígado fetal del ratón o del bazo adulto o de la médula ósea, y luego se disocia en una suspensión de células individuales.

A continuación, las células se marcan con anticuerpos contra los marcadores de superficie celular CD 71 y TER uno 19, y con cualquier otro marcador de interés; por ejemplo, para medir la supervivencia celular o el estado del ciclo celular. La suspensión de células marcadas se analiza entonces mediante un analizador de citometría de flujo, y se identifican subpoblaciones específicas de eritroblastos en distintas etapas de maduración. Estas subpoblaciones específicas pueden purificarse mediante clasificación celular. Posteriormente, puede realizarse un análisis celular y molecular para cada subconjunto de maduración de eritroblastos.

La capacidad de identificar eritroblastos en etapas específicas de maduración directamente en tejidos hematopoyéticos recién aislados nos brinda la oportunidad de estudiar estas células en el contexto fisiológico. Por lo tanto, este método nos permite estudiar eritroblastos en altas cantidades y en diferentes etapas de maduración, respondiendo in vivo. Cuando los ratones se someten a estímulos, aceleran la tasa de eritropoyesis.

Por ejemplo, condiciones hipóxicas que simulan gran altitud o la inyección de la hormona eritropoyetina. Utilizamos citometría de flujo multiparamétrica para identificar eritroblastos dentro de un entorno tisular complejo y estudiar simultáneamente su supervivencia mediante señalización y su estado del ciclo celular. También podemos clasificar eritroblastos en sus etapas específicas de maduración directamente a partir de tejido fresco y explorar sus niveles de expresión génica, estado de la cromatina u otras funciones moleculares.

La eritropoyesis definitiva en el ratón tiene lugar en el bazo y en la médula ósea del ratón adulto. Por lo tanto, estos tejidos se extraerán de un ratón sacrificado. Tras el sacrificio del ratón, obtener sangre mediante punción cardíaca en tubos de recogida de sangre con EDTA o heparina; esta sangre se utilizará posteriormente para el recuento de hematocrito, el recuento de reticulocitos o el análisis de CBC.

Coloque el bazo y el fémur recolectados en tubos separados que contengan tampón de tinción frío. Mantenga los tejidos recolectados sobre hielo si lo desea. Pese el bazo.

Es probable que los ratones que experimentan una respuesta de estrés eritropoyético muestren un aumento significativo en el peso del bazo. Posteriormente, las células del bazo y las células de la médula ósea se preparan a partir de los tejidos recolectados mediante procedimientos demostrados previamente en el embrión de ratón. La eritropoyesis definitiva tiene lugar en el hígado fetal entre los días embrionarios 12,5 y 15,5.

Se preparan ratonas preñadas sincronizadas para obtener células de hígado fetal entre los días 12,5 y 14,5 de gestación. Las ratonas preñadas sincronizadas son sacrificadas y los cuernos uterinos se extraen hacia una placa de Petri que contiene hielo y medio de cultivo frío o tampón de tinción.

Se requiere un microscopio estereoscópico para diseccionar el hígado fetal a partir del día embrionario 12.5 o más joven, con el fin de extraer los embriones del útero. Primero, separe cada embrión individual del cuerno uterino. Luego, extirpe suavemente la pared del útero para liberar el embrión que se encuentra dentro de su saco amniótico.

Retire con cuidado la membrana amniótica. El hígado fetal es el tejido abdominal rojo más grande ubicado debajo de un corazón mucho más pequeño. Para diseccionar el hígado fetal, use pinzas para inmovilizar el embrión a ambos lados del hígado y empuje suavemente el hígado fuera del abdomen hacia el medio.

Transferir suavemente el hígado a un tubo que contenga tampón de tinción fresco. Después de que todos los hígados fetales hayan sido diseccionados y transferidos a un tubo con tampón de tinción fresco, disociar los hígados mecánicamente mediante pipeteo, luego filtrar las células disociadas a través de una malla de nylon de 40 micrones, lavar las células dos veces mediante centrifugación, desechar el sobrenadante y resuspender en tampón de tinción.

Después del segundo lavado, tiña las células con azul de tripano y cuéntelas utilizando un hemocitómetro. Un hígado fetal en E 13.5 tiene alrededor de 10 a la séptima. Suspender las células a una concentración de uno a dos por 10 a la sexta células por muestra de 200 microlitros para análisis citométrico de flujo.

Para los fines de este protocolo en video, la tinción con anticuerpos para citometría de flujo se demostrará únicamente en células de hígado fetal. Para comenzar este procedimiento, prepare una mezcla previa de tinción con anticuerpo primario que contenga lo siguiente: IgG de conejo purificada para bloquear los receptores Fc en células de ratón, CD 71 FETR uno 19 PE y un anticuerpo dirigido contra la proteína de superficie celular fast. Mezcle suavemente la solución de anticuerpos invirtiendo el tubo de dos a tres veces, agregue 200 microlitros de la mezcla previa de tinción con anticuerpo primario a la muestra de células de hígado fetal previamente preparada y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para resuspender las células.

A continuación, prepare estas seis muestras celulares de control. Una muestra sin teñir en la que las células se dejan en tampón de tinción para proporcionar la autofluorescencia de fondo de las células, un color individual para cada anticuerpo o color utilizado en el protocolo para corregir la superposición espectral entre canales, que en este experimento son TUR uno 19 PE CD 71 fz fast, biotina y estreptavidina A PC y siete A A DA, y un control de fluorescencia menos uno para fast biotina, que proporciona el fondo verdadero para ese canal, en el que las células se tiñen con todos los colores o anticuerpos del protocolo excepto fast biotina. Incube la muestra y los controles relevantes con la tinción de anticuerpo primario en hielo durante 45 minutos a una hora en la oscuridad.

Al final de la incubación, lave las células agregando tres mililitros de tampón de tinción a cada tubo de muestra y centrifugue durante tres a cinco minutos a aproximadamente 400 ×g a cuatro grados celsius. A continuación, agregue la estreptavidina en un PC e incube los tubos en hielo durante 30 a 45 minutos. Al finalizar la incubación, lave las células como en la tinción con el primer anticuerpo.

Finalmente, reponga en suspensión las células en la solución de tinción que contiene el colorante de ADN, impermeable a las células, seven a a d, para excluir las células muertas. Las muestras ya están listas para el análisis por citometría de flujo. El aspecto más difícil de este procedimiento es el análisis adecuado de la selección de eventos en citometría de flujo, que permite la identificación confiable de subpoblaciones de eritroblastos.

Requiere una configuración cuidadosa del equipo, todas las muestras de control correctas, una compensación cuidadosa para la superposición espectral y un posterior gating que excluya células muertas, agregados y eventos muy pequeños. Al comienzo del análisis de datos, la muestra no teñida y las muestras de control de un solo color se utilizan para configurar la compensación de la superposición espectral para cada combinación de colores.

En este ejemplo, mostraremos cómo la fluorescencia de fit E se derrama en el canal PE y cómo se corrige esta superposición espectral tras la compensación. Primero, utilizando el control no teñido, definimos una región positiva para fit E y negativa para PE. A continuación, utilizando el control de color único de fit E, podemos visualizar el desbordamiento espectral en el canal PE.

Tras la compensación digital con el software FlowJo, se minimiza la señal de desbordamiento del fito E en el canal PE. Una vez compensadas, se pueden eliminar las células muertas, los agregados y los eventos pequeños. Los agregados y los dobletes celulares se eliminan graficando la altura del dispersión hacia adelante frente al área de la dispersión hacia adelante y seleccionando los eventos dentro de una puerta diagonal estrecha.

Las células muertas se eliminan seleccionando aquellas células que son negativas para DAPI, un colorante de ADN impermeable a las células. La puerta para células viables negativas para DAPI también excluye eventos muy pequeños, como núcleos o restos celulares, que presentan una dispersión directa muy baja. A continuación, mostraremos la estrategia de selección para células de hígado fetal.

Las células recién recolectadas se marcaron con CD71 TUR uno 19 y un cóctel de anticuerpos marcados con ZI dirigidos contra marcadores de linaje no eritroide. En este ejemplo, las muestras ya han sido compensadas por superposición espectral y luego seleccionadas para excluir agregados, células muertas y eventos muy pequeños. Utilizamos la muestra FMO que contiene todos los colores excepto la tinción de fitzi positiva para el linaje, para trazar un histograma de fitzi y definir la puerta de células negativas para el linaje; a continuación, aplicamos esta puerta a la muestra de células de hígado fetal teñida con marcadores de linaje conjugados con ZI.

Se seleccionan las células negativas para linaje y se grafican con CD71 en el eje Y y TER119. En el eje A, las células ahora están listas para ser divididas en los subconjuntos S0 a S5. El subconjunto S0, empobrecido en linaje, contiene principalmente células con potencial CFUE antes del inicio de la dependencia de EPO.

El subconjunto S1 contiene células CFUE dependientes de EPO, principalmente en fase S del ciclo celular. Las células del subconjunto S2 han perdido el potencial formador de colonias y están comenzando a expresar hemoglobina. Las células del subconjunto S3 son fundamentalmente eritroblastos basófilos. Los subconjuntos S4 y S5 contienen eritroblastos tardíos. Aquí se muestra la estrategia de análisis tras la adquisición de datos a partir de células de bazo procesadas y marcadas con anticuerpos dirigidos contra CD71 y TER119, así como el histograma del receptor de muerte rápido.

Uno muestra todos los eventos adquiridos donde la puerta diagonal representa eventos que probablemente sean células individuales, excluyendo dobletes o agregados más grandes. Las células en esta puerta se analizan más adelante en el histograma dos aquí. Se excluyen eventos muy pequeños, probablemente núcleos o restos celulares.

Las células seleccionadas se muestran en el histograma tres, donde se excluyen de análisis posteriores las células positivas para DAPI, que probablemente sean células apoptóticas con membrana permeable. El histograma cuatro muestra la población resultante de células esplénicas viables. El pro eGate contiene células CD71 altas, TER119 intermedias, y las células TUR119 altas se analizan posteriormente en el histograma cinco.

Aquí, las células CD71 altas se subdividen en eritroblastos menos maduros de área grande y eritroblastos A B más pequeños y maduros. El subconjunto de eritroblastos más maduro es ARI C. La expresión de proteínas de superficie celular puede medirse simultáneamente para cada uno de estos subconjuntos mediante la adición de los anticuerpos relevantes al mismo tiempo que TER R one 19 y CD71. El histograma de tinción seis muestra la expresión en la superficie celular del receptor de muerte fast, específicamente en el subconjunto A, en ratones en estado basal y en ratones inyectados con una sola dosis de E ppo.

Los resultados indican que la EPO suprime la expresión rápida en la zona. También puede medirse la expresión in vivo de proteínas intracelulares o el estado del ciclo celular para las células en cada subconjunto. En este análisis representativo del ciclo celular, se inyectó BRDU por vía intraperitoneal en ratones y se obtuvo la médula ósea entre 30 y 60 minutos después.

Además de ser teñidas para CD71 y TER119, las células fueron marcadas para la incorporación de BrdU en su ADN; las células positivas para BrdU se encuentran en la fase S del ciclo. Las células en interfase son negativas para BrdU y pueden resolverse en las fases G1 o G2/M. Utilizando el DNAD7, las células AAD pueden ser ordenadas (sorteadas) a partir de cada uno de los subconjuntos PRO, E, área AA, B y AEC.

Aquí se muestran en preparaciones de citosinas que evidencian una maduración secuencial con reducción del tamaño celular, condensación nuclear y aumento de la coloración parda que refleja la expresión de hemoglobina. Finalmente, se muestra aquí un análisis representativo del ciclo celular del subconjunto S3 en hígado fetal de E 13,5. Se inyectó BRDU en ratones preñados.

Los hígados fetales se recolectaron 30 a 60 minutos después, se fijaron, se permeabilizaron y se tiñeron con anticuerpos contra CD71, TER119 y BrdU. Se analiza el estado del ciclo celular de las células S3, donde las células en fase S son positivas para BrdU y el contenido de ADN se cuantifica tiñendo con el colorante de ADN 7-AAD.

El enfoque citométrico que describimos permite la investigación simultánea de funciones celulares, como la expresión de marcadores de superficie celular y otras proteínas, la supervivencia celular, la señalización celular mediante anticuerpos específicos para fosfo y el estado del ciclo celular. Por lo tanto, nos permite investigar las respuestas moleculares de eritroblastos, en distintas etapas de maduración, frente a una amplia gama de estímulos o el efecto de mutaciones genéticas. Cabe señalar que los subconjuntos de maduración por citometría de flujo se definen en función de la expresión de marcadores de superficie celular y la dispersión hacia adelante.

Descubrimos que, en general, las células de cada subconjunto corresponden a una etapa eritroblástica morfológicamente similar en una amplia variedad de modelos de ratón. Sin embargo, recomendamos verificar esto al examinar un nuevo modelo de ratón. Mediante la separación de células de cada subconjunto y el análisis de su morfología, las células de cada subconjunto también pueden separarse para análisis de ARN o transcriptoma; los experimentos de separación deben utilizar presiones bajas y boquillas anchas para minimizar el estrés cortante sobre las células.

También recomendamos verificar la pureza y viabilidad celular tras cada experimento de clasificación. Finalmente, al detectar un cambio en la frecuencia de un subconjunto determinado, es importante determinar si esto se debe a un cambio real en el número de células en ese subconjunto o si se debe a cambios en otros subconjuntos. Por lo tanto, además de medir las frecuencias de los subconjuntos, siempre es necesario medir también el número absoluto de células en cada subconjunto.