Un soporte de muestra todo en uno para cristalografía de rayos X macromolecular con dispersión mínima de fondo

Este soporte de muestra se puede utilizar para el cultivo de cristales y la recopilación de datos de difracción de rayos X. Este portacuchillas fue hecho para el uso en placas de 24 pozos que son ampliamente utilizados en la comunidad MX. El aspecto muy importante es que no se necesita manipulación.

Un soporte de muestra con estos aspectos descritos aquí no existía antes. Ver algo siempre es mucho mejor que leer sobre ello. Al ver el vídeo, un usuario potencial puede comprender las características y complejidades del nuevo portacuchillas inmediatamente.

Para empezar, cree una superficie limpia y libre de polvo con un paño húmedo y libre de pelusas. Tome un portacuchillas de su caja y colóquelo suavemente, lámina amarilla hacia arriba, sobre la superficie limpia para evitar daños o perforaciones no deseadas de la lámina COC de la parte posterior. Configure las gotas de cristalización en la lámina amarilla, ya que se haría en las diapositivas de cubierta de uso común.

Coloque las gotas suavemente para evitar cualquier rotura o perforación de la lámina con una pipeta. En los portamuestras de tipo 2 y tipo 3, dos gotas son el máximo recomendado. En un portacuchillas tipo 1, se pueden colocar hasta tres gotas.

Dé la vuelta al portaves y colóquelo en una cavidad pregrasada de una placa de 24 pozos al estilo Linbro. Utilice las ayudas de posicionamiento del portacuchillas para guiarlo a su posición óptima. Asegurar la posición correcta del soporte de la muestra para evitar la evaporación no deseada.

Al colocar la placa de cristalización bajo un microscopio de luz de transmisión, sin o sin polarizadores, monitoree el crecimiento del cristal sin ninguna perturbación del experimento. Realice la crioprotección bajo un microscopio de luz de transmisión. Perfore suavemente la lámina cocta exterior con una cánula fina.

Asegúrese de que la lámina amarilla interior permanezca intacta. La punción debe estar justo al lado de la gota que se va a manipular. Inserte una mecha de papel fina en el orificio perforado.

Empuje con cuidado la mecha hacia adelante hasta que toque la lámina amarilla de poliimida. Mantenga la mecha en contacto con la lámina perforada. La mecha chupará todo el exceso de solución.

El tiempo necesario para la eliminación completa del líquido depende de la viscosidad de las soluciones y de la composición del licor madre. Después de que todo el líquido se aspira, retraiga suavemente la mecha de papel. Recuerde la posición de la gota, ya que puede no ser visible después de la eliminación del licor de la madre.

Tome una pipeta estándar para aplicar un pequeño volumen de solución crio-protectora, utilizando una punta extruida a través del mismo agujero. Para volver a sellar la lámina de COC autocurable, coloque suavemente un dedo protegido en el orificio durante aproximadamente un segundo y deslícelo a través de la punción. La ligera presión en combinación con la temperatura elevada promoverá el respreso de pinchazos que no son demasiado grandes.

Disolver el ligando en licor madre en la concentración deseada en un tubo de reacción. Girar la solución durante 10 minutos a 12.000 veces g para eliminar las partículas insolubles. Utilice una centrífuga con temperatura controlada si es necesario.

Coloque suavemente un máximo de tres microlitros de solución que contenga ligando en el espacio entre la lámina COC y la película de poliimida utilizando una punta de pipeta larga y extruida;retraiga la punta. Para volver a sellar la lámina de COC autocurable, coloque suavemente un dedo protegido en el orificio durante aproximadamente un segundo y deslícelo a través de la punción. Incubar el experimento durante algún tiempo para permitir la difusión a través de la membrana.

El tiempo de remojo depende en gran medida de la viscosidad de la solución difusora y sus componentes. Repita los pasos de remojo del ligando varias veces para empapar posteriormente diferentes ligandos. Para minimizar la dispersión de disolventes, elimine el exceso de solución antes de la recopilación de datos.

Garantice un entorno de línea de haz estable y controlado por humedad con condiciones preestablecidas. Para realizar la recopilación in situ de datos de difracción a temperatura ambiente, levante suavemente la lámina COC transparente en el punto designado utilizando fórceps y despege. Ahora levante suavemente el soporte de muestra de su cavidad e insértelo inmediatamente en una base de soporte magnético pre-preparado.

No se requiere pegamento para este paso. Aplique una presión suave para garantizar el posicionamiento correcto del soporte de la muestra dentro de la base. Para los soportes de muestra con un anillo exterior extraíble, aplique una presión suave aferrándose al anillo exterior y despegarlo en los puntos de rotura designados.

El ejemplo ya está listo para centrar y difracción de datos. Monte el soporte de muestra en un goniómetro de la línea de haz y asegúrese de un posicionamiento correcto del soporte. Dependiendo de la geometría del goniómetro, el soporte de muestra se puede girar hasta 160 grados sin causar sombras durante el experimento de difracción.

Use una mecha de papel y toque suavemente la lámina amarilla de poliimida de la parte posterior para eliminar el exceso de licor de la madre. El ejemplo ya está listo para centrar y difracción de datos. Prepárese para la recopilación de datos de difracción in situ a temperatura criogénica como se hace para la temperatura ambiente, luego sumerja la muestra en nitrógeno líquido y transfiérala a un vial compatible con SPINE.

La geometría de los tipos de soporte de muestra 2 y 3 permite su transferencia a viales de muestra SPINE estándar, que se pueden utilizar para el montaje de muestras asistida por robot. El portacuchillas tipo 1 y tipo 2 han sido diseñados para caber en un pozo de una placa de 24 pozos al estilo Linbro. Cada portacuchillas individual contiene ayudas de posicionamiento a ambos lados de la llanta exterior para garantizar un posicionamiento óptimo en el borde del pozo.

Se utilizó una placa de 24 pozos al estilo Linbro con el portacuchillas tipo 1 para equilibrar una gota a 293 Kelvin contra 500 microlitros de licor madre. Se observaron cristales de 40 a 50 micras después de cinco horas utilizando un microscopio de luz de transmisión con o sin polarizador. Se colocó un portacuchillas con cristales de lisozima de huevo-blanco de gallina en una corriente de aire controlada por humedad en la línea de haz HZB-MX 14.3.

Aquí se muestra una imagen típica de difracción. No se puede detectar dispersión de fondo elevada en la imagen de difracción. Es fundamental que se eviten las contaminaciones de la lámina de poliimida.

Además, es importante que el portacuchillas se coloque con precisión y que la manipulación del cristal se lleve a cabo con cuidado. El portavelas permite el manejo de cristales muy delicados, uno de los pasos más importantes en la cristalografía micromolecular. Su uso disminuye en gran medida la posibilidad de destruir la muestra.