Name: Uso de ensayos de entrada viral y análisis de acoplamiento molecular para la identificación de candidatos antivirales contra el coxsackievirus A16 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: Aprende a identificar inhibidores de entrada viral contra coxsackievirus A16 mediante ensayos de tiempo de adición y acoplamiento molecular en células RD. Este protocolo sistemático facilita el descubrimiento de candidatos antivirales.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Los autores están agradecidos al Dr. Joshua Beckham de la Universidad de Texas en Austin por el apoyo técnico con acoplamiento molecular. Este estudio fue apoyado en parte por la financiación del Ministerio de Ciencia y Tecnología de Taiwán (MOST107-2320-B-037-002 a C.-J.L. y L.-T.L.; MOST106-2320-B-038-021 y MOST107-2320-B-038-034-MY3 a L.-T.L.).

NOTA: Todos los cultivos celulares y las infecciones por virus deben llevarse a cabo en campanas de bioseguridad certificadas que sean adecuadas para el nivel de bioseguridad de las muestras que se manipulan. Las dos moléculas pequeñas de ácido quebulágico (CHLA) y punicalagin (PUG), quese observaron para bloquear eficientemente la infección CVA16 9, se utilizan como ejemplos de agentes inhibidores candidatos. Para los principios básicos en técnicas virológicas, propagación de virus, determinación de la sentenciadeda de virus y conceptos de unidades formadoras de placas (PFU) o multiplicidad de infección (MOI), se remite al lector a la referencia10.
1. Cultivo celular, preparación de virus, preparación de compuestos y citotoxicidad compuesta
<ol><li>Las células humanas de rabdomiosarcoma (RD) son células huésped permisivas a la infección CVA1611. Cultivar las células RD en 10 ml del medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) complementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 200 U/ml de penicilina G, 200 g/ml de estreptocina y 0,5 g/ml de anfotericina B en frascos De-75 a 37 oC en una incubadora de CO 2.</li>
	<li>Prepare CVA16 propagando el virus en las células rd y determine el titer viral en PFU/ml. Para el protocolo optimizado, consulte la referencia11.</li>
	<li>Preparar los compuestos y controles de ensayo utilizando sus respectivos disolventes: por ejemplo, disolver CHLA y PUG en dimetilsulfóxido (DMSO). Para todos los pasos de infección, el medio basal consistía en DMEM más 2% FBS y antibióticos. NOTA: La concentración final de DMSO en los tratamientos compuestos de ensayo es igual o inferior al 0,25% en los experimentos; 0.25% DMSO se incluye como un tratamiento de control negativo en los ensayos para la comparación.</li>
	<li>Realizar el ensayo de citotoxicidad de los compuestos de ensayo en las células RD utilizando un reactivo determinante de viabilidad celular como XTT ((2,3-bis[2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenilo]-5-feniloamino)-carbonilo]-2H-tetrazolium hidróxido). Para un protocolo detallado, consulte la referencia12. Determinar las concentraciones de citotoxicidad de los compuestos de ensayo utilizando un software analítico como GraphPad Prism de acuerdo con el protocolo del fabricante. Para el resto del estudio se utilizan concentraciones de fármacos que no influyen significativamente en la viabilidad celular (células viables del 95%) .</li>
</ol>2. Ensayo de tiempo de adición de drogas
<ol><li>
Evaluar la influencia de los medicamentos en las células huésped antes de la infección viral (pretratamiento)
	<ol>
<li>Células de RD de semillas en placas de 12 pocillos a una densidad de sembración de 2 x 105 células/pozo. Incubar durante la noche a 37oC en una incubadora de CO2 al 5% para obtener una monocapa.</li>
		<li>Tratar las células RD con compuestos de ensayo a concentraciones no citotóxicas (determinadas a partir del paso 1.4) en 1 ml de volumen de medios basales durante 1 h o 4 h.</li>
		<li>Lavar las células con 1-2 ml de PBS antes de añadir 50 PFU/pozo de virus en medio basal (el volumen final del inóculo es de 300 ol) durante 1 h. Mece la placa cada 15 minutos.</li>
		<li>Después de la infección, lave las monocapas de nuevo usando PBS, luego superponga con 1 ml de medios basales que contengan 0,8% de metilcelulosa para una mayor incubación a 37 oC en una incubadora deCO2 al 5%.</li>
		<li>Después de 72 h de incubación, retire el medio de superposición y lave los pozos usando 2 ml de PBS.</li>
		<li>Fijar los pozos usando 0.5 mL de 37% formaldehído durante 15 min.</li>
		<li>Retire el sobrenadante y lávelo de nuevo con PBS.</li>
		<li>Mancha los pozos con 0,5 ml de solución violeta cristalina al 0,5%. A continuación, retire la solución de manchas en 2 minutos y lave los pozos con una corriente suave de agua antes de secar al aire.</li>
		<li>Cuente las placas virales colocando la placa en una caja de luz blanca. Calcular el porcentaje (%) CVA16 infección de la siguiente manera: (Media de virus de placa + droga / Media de virus de placa + control DMSO) - 100%.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Evaluar el efecto de la adición de los fármacos y el virus simultáneamente (co-adición)
	<ol>
<li>Células de RD de semillas en placas de 12 pocillos a una densidad de sembración de 2 x 105 células/pozo. Incubar durante la noche a 37oC en una incubadora de CO2 al 5% para obtener una monocapa.</li>
		<li>Tratar las células RD con los compuestos de ensayo a las concentraciones adecuadas y 50 PFU/pozo de CVA16 (el volumen final del inóculo es de 300 ol) simultáneamente durante 1 h. Mecer la placa cada 15 minutos.</li>
		<li>Lavar las células con 1 ml de PBS y luego superponer con 1-2 ml de medios basales que contengan 0,8% de metilcelulosa para una mayor incubación a 37 oC en una incubadora de CO2 al 5%.</li>
		<li>Mancha las placas virales con cristal violeta después de 72 h después de la infección y determinar el% de la infección CVA16 como se describió anteriormente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Evaluar el efecto del tratamiento farmacológico después de la entrada viral (post-infección)
	<ol>
<li>Células de RD de semillas en placas de 12 pocillos a una densidad de sembración de 2 x 105 células/pozo. Incubar durante la noche a 37oC en una incubadora de CO2 al 5% para obtener una monocapa.</li>
		<li>Inocular las células RD con 50 PFU/pozo de CVA16 (el volumen final del inóculo es de 300 ol) durante 1 h. Mece la placa cada 15 minutos.</li>
		<li>Lavar los pozos con 1-2 ml de PBS y superponer las células con medios basales que contengan 0,8% de metilcelulosa y las concentraciones adecuadas de compuestos de ensayo.</li>
		<li>Manchas placas virales con violeta cristalina y cuentan después de 72 h después de la infección y determinan el% de las incubaciones de infección CVA16 descritas anteriormente. NOTA: Realice todos los lavados DE PBS suavemente para evitar levantar las células.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Ensayo de enlace basado en citometría de flujo
<ol><li>Células de RD de semillas en placas de 12 pocillos a una densidad de sembración de 2 x 105 células/pozo. Incubar durante la noche a 37oC en una incubadora de CO2 al 5% para lograr una monocapa.</li>
	<li>Enfríe previamente la monocapa celular a 4oC durante 1 h.</li>
	<li>Infectar las células de RD con CVA16 (MOI a 100) en presencia y ausencia de los compuestos de ensayo durante 3 h a 4 oC. NOTA: Realizar la inoculación viral sobre el hielo y la incubación subsiguiente en un refrigerador de 4oC para mantener la temperatura a 4oC, lo que permite la unión viral pero no la entrada.</li>
	<li>Retire el inóculo del virus y lávelo una vez con 1-2 ml de PBS helado.</li>
	<li>Levante las células agregando 1 ml de tampón de disociación helada a los pozos en hielo durante 3 minutos, antes de recoger las células y resuspenderlas en tampometría de citometría de flujo de frío y hielo (1x PBS más 2% FBS).</li>
	<li>Lave las células dos veces con el tampón de citometría de flujo frío y fije las células con 0,5 ml de paraformaldehído al 4% durante 20 minutos sobre hielo.</li>
	<li>Lavar las células usando PBS para eliminar cualquier virus no enlazado o débilmente unido, y luego manchar las células con 1 ml de anticuerpo anti-VP1 (1:2,000; diluido en PBS que contiene 3% de BSA) en hielo durante 1 h, seguido de la incubación con un IgG secundario conjugado con el propio Ratón Conjugado Alexa 488 (1:250; diluido en PBS que contiene 3% de BSA) sobre hielo durante 1 h. Realizar lavados de PBS (3 veces) después de cada tratamiento con anticuerpos.</li>
	<li>Resuspenda las células en 0,5 ml del tampón de citometría de flujo frío y realice análisis de citometría de flujo en un citometro de flujo utilizando procedimientos estándar. Presente los datos en histogramas utilizando el software asociado y el quantitado para la representación del gráfico de barras.</li>
</ol>4. Ensayo de inactivación viral
<ol><li>
Realice el ensayo de inactivación viral como se describió anteriormente12 utilizando las siguientes condiciones: - Concentración inicial de 106 PFU/ml de CVA16. - Monocapas de células RD en placas de 12 pocillos a partir de una densidad de sembrado de 2 x 105 células/pozo. - 50 veces la dilución para la valoración de los compuestos de la droga resultando en una concentración final del virus de 50 PFU/bueno. - Lavar los pasos con 1-2 ml de PBS. - Medios superpuestos que contienen 0,8% de metilcelulosa.</li>
	<li>Realizar la lectura final de la infección viral utilizando la tinción violeta cristalina de las placas virales procedimiento como se detalló anteriormente.</li>
</ol>5. Análisis de acoplamiento molecular
<ol><li>Descargar moléculas 3D de compuestos de prueba de PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/). Si las moléculas no tienen una estructura 3D cargada, descargue las estructuras 2D o utilice la secuencia de cuerdas SMILES y transforme en moléculas 3D a través de un programa molecular (por ejemplo, CORINA).</li>
	<li>Descargue la unidad de ensamblaje biológico viral de RCSB Protein Data Bank (https://www.rcsb.org/) y prepare el modelo de estructura viral utilizando un programa de biocomputación (por ejemplo, UCSF Quimera). Por ejemplo, en el caso de la estructura de cristal de virión madura CVA16 (PDB: 5C4W)3, eliminar disolventes del archivo PDB, reemplazar las cadenas laterales incompletas utilizando datos de la Biblioteca Rotamer Dunbrach 2010, y añadir hidrógenos y cargas a la estructura como previamente reportado13. Los objetivos de acoplamiento pueden ser cualquier proteína viral relevante para el análisis previsto con información de ensamblaje biológico (Banco de Datos de Proteínas).</li>
	<li>
Acople compuestos de prueba en la unidad de virus preparada utilizando, por ejemplo, ucSF Quimera, y analice los archivos de salida con un software de visualización (por ejemplo, Autodock Vina, PyMol):
	<ol>
<li>Cargue el archivo compuesto de prueba en UCSF Quimera como el 'ligand' y realice el acoplamiento ciego seleccionando toda la proteína viral preparada como el 'receptor'. Utilice el ratón del ordenador o el trackpad para cambiar el tamaño del volumen de búsqueda a todo el 'receptor'. En 'Opciones avanzadas', permita que el número de modos de enlace sea al máximo. Los marcos de acoplamiento se clasificarán automáticamente de mayor a menor energía de enlace.</li>
		<li>(Opcional) Además del acoplamiento a ciegas, limite el sitio de acoplamiento a la proteína viral en regiones de interés derivadas de los resultados de acoplamiento ciego utilizando el ratón o el trackpad de nuevo para reducir el volumen de búsqueda (por ejemplo, 100 x 100 x 100 o). Este paso ayuda a confirmar los resultados de acoplamiento ciego y aumenta la especificidad.</li>
		<li>Utilice un sistema de gráficos moleculares (por ejemplo, PyMol) para analizar las posiciones de los modos de enlace cargando el archivo de acoplamiento. Encuentra contactos polares desde el compuesto hasta la proteína viral seleccionando el 'ligand' e identificando los contactos polares con la opción 'a cualquier átomo'; examinar los resultados.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Legay, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatal+coxsackievirus+A-16+pneumonitis+in+adult%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Fatal coxsackievirus A-16 pneumonitis in adult.</a> Emerging Infectious Diseases. 13, 1084-1086 (2007).</li>
<li>Wang, C. Y., Li Lu,, Wu, F., H, M., Lee, C. Y., Huang, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatal+coxsackievirus+A16+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Infectious+Disease+Journal%22%5BJournal%5D)">Fatal coxsackievirus A16 infection.</a> Pediatric Infectious Disease Journal. 23, 275-276 (2004).</li>
<li>Ren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+coxsackievirus+A16+capsids+with+native+antigenicity%3A+implications+for+particle+expansion%2C+receptor+binding%2C+and+immunogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Structures of coxsackievirus A16 capsids with native antigenicity: implications for particle expansion, receptor binding, and immunogenicity.</a> Journal of Virology. 89, 10500-10511 (2015).</li>
<li>Nishimura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+P-selectin+glycoprotein+ligand-1+is+a+functional+receptor+for+enterovirus+71%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human P-selectin glycoprotein ligand-1 is a functional receptor for enterovirus 71.</a> Nature Medicine. 15, 794-797 (2009).</li>
<li>Yamayoshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scavenger+receptor+B2+is+a+cellular+receptor+for+enterovirus+71%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Scavenger receptor B2 is a cellular receptor for enterovirus 71.</a> Nature Medicine. 15, 798-801 (2009).</li>
<li>Yamayoshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+SCARB2-dependent+infection+by+coxsackievirus+A7%2C+A14%2C+and+A16+and+enterovirus+71%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Human SCARB2-dependent infection by coxsackievirus A7, A14, and A16 and enterovirus 71.</a> Journal of Virology. 86, 5686-5696 (2012).</li>
<li>Lin, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrolyzable+tannins+%28chebulagic+acid+and+punicalagin%29+target+viral+glycoprotein-glycosaminoglycan+interactions+to+inhibit+herpes+simplex+virus+1+entry+and+cell-to-cell+spread%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Hydrolyzable tannins (chebulagic acid and punicalagin) target viral glycoprotein-glycosaminoglycan interactions to inhibit herpes simplex virus 1 entry and cell-to-cell spread.</a> Journal of Virology. 85, 4386-4398 (2011).</li>
<li>Lin, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad-spectrum+antiviral+activity+of+chebulagic+acid+and+punicalagin+against+viruses+that+use+glycosaminoglycans+for+entry%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Broad-spectrum antiviral activity of chebulagic acid and punicalagin against viruses that use glycosaminoglycans for entry.</a> BMC Microbiology. 13, 187(2013).</li>
<li>Lin, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecules+targeting+coxsackievirus+A16+capsid+inactivate+viral+particles+and+prevent+viral+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Microbes+%26+Infections%22%5BJournal%5D)">Small molecules targeting coxsackievirus A16 capsid inactivate viral particles and prevent viral binding.</a> Emerging Microbes & Infections. 7, 162(2018).</li>
<li>Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFlint%2C+SJ+%22Principles+of+Virology%22">Principles of Virology</a>. , 3rd edn, ASM Press. (2008).</li>
<li>Velu, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BPR-3P0128+inhibits+RNA-dependent+RNA+polymerase+elongation+and+VPg+uridylylation+activities+of+Enterovirus+71%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">BPR-3P0128 inhibits RNA-dependent RNA polymerase elongation and VPg uridylylation activities of Enterovirus 71.</a> Antiviral Research. 112, 18-25 (2014).</li>
<li>Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J., Wang, C. K., Lin, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+Viral+Entry+Assays+for+the+Identification+and+Evaluation+of+Antiviral+Compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds.</a> Journal of Visualized Experiments. , e53124(2015).</li>
<li>Lang, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DOCK+6%3A+combining+techniques+to+model+RNA-small+molecule+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">DOCK 6: combining techniques to model RNA-small molecule complexes.</a> RNA. 15, 1219-1230 (2009).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coxsackievirus+A16+utilizes+cell+surface+heparan+sulfate+glycosaminoglycans+as+its+attachment+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Microbes+%26+Infections%22%5BJournal%5D)">Coxsackievirus A16 utilizes cell surface heparan sulfate glycosaminoglycans as its attachment receptor.</a> Emerging Microbes & Infections. 6, 65(2017).</li>
<li>Waterhouse, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SWISS-MODEL%3A+homology+modelling+of+protein+structures+and+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">SWISS-MODEL: homology modelling of protein structures and complexes.</a> Nucleic Acids Research. 46, W296-W303 (2018).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen conflicto de intereses.

En este informe, describimos los protocolos que son útiles para la identificación de candidatos antivirales que se dirigen a la entrada viral, en particular contra el CVA16 no envuelto. Los ensayos están diseñados de manera sectización de los primeros eventos durante la entrada viral, lo que es útil para aclarar el mecanismo o mecanismos de acción y los posibles objetivos de la actividad antiviral de los agentes de prueba. El "ensayo de tiempo de adición de fármacos" permite determinar ampliamente el objetivo potencial d...

La enfermedad de manos, pies y boca (HFMD) es una enfermedad más comúnmente causada por el coxsackievirus A16 (CVA16) y el enterovirus 71 (EV71) en niños pequeños. Recientemente en toda la región de Asia y el Pacífico, ha habido un repunte significativo en la HFMD inducida por CVA16. Si bien los síntomas pueden ser leves, pueden ocurrir complicaciones graves que afectan el cerebro y el corazón, con una posible letal1,2. En la actualidad, no hay terapias antivirales autorizadas ni vacunas disponibles para CVA16, por lo que es urgente desarrollar estrategias antivirales para frenar futuros brotes y las complicaciones asociadas.
CVA16 es un virus no envuelto que tiene una cápside icosahedral ensamblado a partir de pentámeros que contienen 4 proteínas estructurales, a saber, VP1, VP2, VP3 y VP4. Rodear cada eje de cinco veces en el pentamer es una región 'canyon' que se muestra como una depresión y se destaca por su papel en la unión de receptores3. En la parte inferior de este cañón se encuentra un bolsillo hidrófobo en la región de VP1 que contiene un ligando graso natural llamado esfingosina (SPH). Se ha sugerido que los receptores celulares, como el ligando de glicoproteína p -1 (PSGL-1) y el receptor carroñero de la clase B miembro 2 (SCARB2), desempeñen un papel en la unión viral desplazando este ligando que resulta en cambios conformacionales en la posterior expulsión del genoma viral en la célula huésped4,5,6. La identificación de posibles inhibidores que bloquean los sucesivos eventos en el proceso de entrada viral podría proporcionar posibles estrategias terapéuticas contra la infección por CVA16.
Los pasos en el ciclo de vida del virus se pueden diseccionar a través de enfoques experimentales como objetivos para ayudar a identificar agentes antivirales específicos del modo. Un análisis de tiempo de adición de fármacos examina el efecto del tratamiento farmacológico en diferentes momentos durante la infección viral, incluyendo la preentrada (agregada antes de la infección por el virus), la entrada (agregada simultánea a la infección por el virus) y la infección por virus)7. El impacto se puede evaluar utilizando un ensayo de placa estándar cuantificando el número de placas virales formadas en cada una de las condiciones del tratamiento. El ensayo de unión viral basado en citometría de flujo determina si el medicamento evita la unión viral a las células huésped. Esto se logra cambiando la temperatura de 37 oC, a la que se producen la mayoría de las infecciones por virus humanos, a 4 oC, donde los viriones son capaces de unirse a la superficie de la célula huésped pero no pueden entrar en las células7. Las partículas del virus unido a la membrana celular se cuantifican a través de la inmunomancha contra los antígenos virales y se evalúan mediante citometría de flujo. El ensayo de inactivación viral, por otro lado, ayuda a evaluar posibles interacciones físicas del fármaco con partículas de virus libres, ya sea protegiendo o neutralizando los viriones, o causando agregaciones o cambios de conformación que los hacen inactivos para interacciones posteriores con la superficie de la célula huésped durante la infección8,9. En este experimento, el inóculo viral se permite incubar primero con el fármaco antes de ser diluido para valorar la droga antes de infectar a la monocapa de la célula huésped y realizar un ensayo de placa estándar8. Por último, el acoplamiento molecular es una poderosa herramienta para predecir posibles sitios de interacción farmacológica en la superficie del virión, incluidas las glicoproteínas virales de los virus envueltos y las proteínas cápside virales de virus no envueltos, mediante el uso de virus computacionales Algoritmos. Esto ayuda a identificar mecanísticamente los objetivos del modo de acción de la droga y proporcionar información útil que puede ser validada aún más por ensayos posteriores.
Recientemente empleamos los métodos descritos anteriormente para identificar compuestos antivirales que bloquearon eficientemente la infección por el CVA169no envuelto. En este documento, se describen y discuten los protocolos detallados que se utilizaron.

<table><tbody><tr><td>4% Paraformaldehído</td><td>Sigma</td><td>AL-158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488-conjugado anti-ratón IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Anfotericina B</td><td>GIBCO</td><td>15290-018</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-VP1</td><td>Anticuerpo Merck-Millipore</td><td>MAB979</td><td>Anti-Enterovirus 71, reacción cruzada con Coxsackie A16, clon 422-8D-4C-4D</td></tr><tr><td>Citómetro Beckman Coulter</td><td>Beckman Coulter</td><td>FC500</td><td></td></tr><tr><td>Corina</td><td>Molecular Networks GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cristal violeta</td><td>Sigma</td><td>C3886-100G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>11995-040</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehído</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prisma</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sal sódica de heparina</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensayo de toxicología in vitro, basado en XTT</td><td>Sigma</td><td>TOX2</td><td></td></tr><tr><td>Metilcelulosa</td><td>Sigma</td><td>M0512-100G</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4</td><td>GIBCO</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>GIBCO</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>PyMol</td><td>Schr&ouml; Dinger</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UCSF Chimera</td><td>Universidad de California, San Francisco</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

uso de ensayos de entrada viral y análisis de acoplamiento molecular para la identificación de candidatos antivirales contra el coxsackievirus a16

Use of Viral Entry Assays and Molecular Docking Analysis for the Identification of Antiviral Candidates against Coxsackievirus A16

Los ensayos antivirales que examinan mecanísticamente la entrada viral son pertinentes para discernir en qué paso los agentes evaluados son más eficaces y permiten la identificación de los inhibidores de entrada viralcandidatos. Aquí, presentamos los enfoques experimentales para la identificación de moléculas pequeñas capaces de bloquear la infección por el coxsackievirus No envuelto A16 (CVA16) a través de la orientación a las partículas del virus o pasos específicos en la entrada viral temprana. Los ensayos incluyen el análisis de tiempo de adición de fármacos, el ensayo de unión viral basado en citometría de flujo y el ensayo de inactivación viral. También presentamos un protocolo de acoplamiento molecular que utiliza proteínas cápside de virus para predecir posibles residuos dirigidos por los compuestos antivirales. Estos ensayos deben ayudar en la identificación de agentes antivirales candidatos que actúan sobre la entrada viral. Las instrucciones futuras pueden explorar estos posibles inhibidores para el desarrollo de fármacos adicionales.

El ensayo de tiempo de adición de fármacos está indicado en la Figura 1 y muestra la influencia del tratamiento utilizando las moléculas pequeñas CHLA y PUG en la infección CVA16, ya sea la entrada previral (pretratamiento), durante la entrada viral (adición co-similar) o la entrada postviral ( post-infección). Ambas moléculas pequeñas sólo produjeron un impacto marginal contra la infectividad CVA16, ya sea en el pretratamiento de las células huésped antes de...

El objetivo del protocolo es ilustrar los diferentes ensayos relacionados con la entrada viral que se pueden utilizar para identificar los inhibidores de entrada viralcandidatos.

Uso de ensayos de entrada viral y análisis de acoplamiento molecular para la identificación de candidatos antivirales contra el coxsackievirus A16

Antiviral assays that mechanistically examine viral entry are pertinent to discern at which step the evaluated agents are most effective, and allow for ...

Este protocolo puede ayudar en el descubrimiento de moléculas pequeñas antivirales potenciales a través de un enfoque basado en mecanismos. El ensayo de tiempo de adición determina en qué paso de la infección la molécula pequeña exhibe su actividad antiviral. El acoplamiento molecular predice la interacción entre la molécula pequeña y las proteínas virales.Para evaluar la influencia de los fármacos en las células huésped antes de la infección viral, las células de RD de semillas en placas de 12 pozos a dos veces 10 a las quintas células por densidad de revestimiento de pozo. Incubar las células a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono del 5% durante la noche. A la mañana siguiente, tratar cada pozo de la monocapa RD con un compuesto de prueba de interés, en triplicado, a concentraciones no tóxicas en un mililitro de medio basal durante una o cuatro horas.Al final de la incubación del tratamiento, lavar las células con un mililitro de PBS antes de añadir 50 unidades de virus formadoras de placas en 300 microlitros de medio basal por pozo durante una hora, con balanceo cada 15 minutos. Al final de la incubación de la infección, lavar las células con PBS y superponer las células con un mililitro de medio basal fresco que contiene 0.8%metilcelulosa. Después de 72 horas en la incubadora de cultivo celular, lavar cada pozo con dos mililitros de PBS y fijar las células con 0,5 mililitros de 37%formaldehído por pozo durante 15 minutos.Al final de la fijación, lavar los pozos con PBS y manchar las células con 0,5 mililitros de 0,5% de solución violeta cristalina por pozo. Después de dos minutos, lave los pozos con una corriente suave de agua y deje que la placa se seque al aire. A continuación, coloque la placa sobre una caja de luz blanca para contar y calcule el porcentaje de células infectadas por coxsackievirus de acuerdo con la fórmula.Para el análisis de acoplamiento molecular, descargue moléculas 3D de los compuestos de prueba de PubChem. Si una molécula no tiene una estructura 3D cargada, descargue la estructura 2D o utilice la secuencia de cadenas SMILE para transformar la estructura en una molécula 3D a través de un programa molecular adecuado. A continuación, descargue una unidad de ensamblaje biológico viral de RCSB Protein Data Bank.Utilizando un programa de biocódica adecuado, elimine los disolventes del archivo Protein Data Bank, reemplace las cadenas laterales incompletas utilizando datos de la biblioteca de rotadores Dunbrack 2010 y agregue hidrógenos y cargas a la estructura como se informó anteriormente. Para acoplar los compuestos de prueba en la unidad de virus preparada, cargue el archivo compuesto de prueba en la Quimera de la Universidad de California en San Francisco como ligando y seleccione toda la proteína viral preparada como receptor para realizar el acoplamiento ciego. Para un acoplamiento adicional, limite el sitio de acoplamiento a la proteína viral a regiones de interés derivadas de los resultados de acoplamiento ciego reduciendo aún más el volumen de búsqueda.A continuación, cargue el archivo de acoplamiento en un sistema de gráficos moleculares adecuado para analizar las posiciones del modo de enlace. Seleccione el ligando para encontrar contactos polares desde el compuesto a la proteína viral, identificando los contactos polares con la opción de a cualquier átomo. Ambas moléculas pequeñas probadas en este experimento representativo, sólo produjeron un impacto marginal contra la infectividad del coxsackievirus A16, ya sea en el pretratamiento de las células huésped antes de la infección viral o en el tratamiento posterior a la infección.Por el contrario, las moléculas derogaron eficientemente la infección en más del 80% en el tratamiento de co-adición, lo que sugiere que los dos compuestos son los más eficaces cuando están presentes simultáneamente con las partículas del virus en la superficie de la célula huésped durante la infección. El análisis de unión basado en la citometría de flujo confirma que los dos taninos previnieron la entrada de infectividad del coxsackievirus A16 al impedir la unión de partículas virales a las células huésped. El acoplamiento molecular de los taninos indica que ambos se prevé que se adhi inicien en la región del cañón del pentámero del coxsackievirus, justo por encima de la entrada de bolsillo que contiene el factor de bolsillo y desempeña un papel importante para mediar en la unión al coxsackievirus y la entrada en la célula huésped.En estas proyecciones superficiales, se pueden observar los residuos únicos predichos a partir de los contactos polares de las pequeñas moléculas alrededor de la entrada de bolsillo, con asparagina-85, lisina-257, y asparagina-417 en común entre los dos taninos. Para el acoplamiento molecular, la topología de la proteína viral debe tenerse en cuenta al clasificar los marcos de unión. Experimentos adicionales podrían incluir la prueba de la actividad antiviral del compuesto en virus recombinantes, con mutaciones en los aminoácidos descubiertos para validar su importancia a la eficacia del fármaco.

use-viral-entry-assays-molecular-docking-analysis-for-identification

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video muestra el ensayo de inactivación viral, mostrando la evaluación del impacto de los agentes antivirales en las partículas virales.

Evaluación de la eficacia de un compuesto de prueba antiviral a través de un ensayo de inactivación viral

Este video muestra un ensayo de fijación viral para la detección de compuestos antivirales. Utilizando el virus de la hepatitis C modificado genéticamente y la luciferasa, evalúa los efectos inhibitorios sobre la adhesión viral, como lo indica la menor intensidad de luz en los pocillos tratados conjuntamente en comparación con los pocillos tratados con el virus solo.

Un ensayo de unión viral para la detección de compuestos antivirales

Este video muestra un ensayo para evaluar agentes antivirales que se dirigen a pasos específicos de la entrada viral en las células huésped y la fusión con el endosoma. Las células se incuban a baja temperatura y luego se infectan con el VHC. La baja temperatura permite la unión viral a las células huésped, pero inhibe la internalización a través de la endocitosis. Se añade el compuesto antiviral de prueba y las células se incuban a temperatura fisiológica. Este cambio a una temperatura más...

Un ensayo para evaluar el efecto de los compuestos de prueba en la entrada y fusión viral en las células huésped

Tres ensayos, incluyendo el efecto citopático (CPE) a base de ensayo, ensayo de dosis-respuesta y (TOA) ensayo de tiempo-de-Adición se han desarrollado, optimizado, validado y utilizado para identificar nuevos antivirales contra el virus de la lengua azul (BTV), así como para determinar el posible mecanismo de acción-de-(Ministerio de Agricultura) de antivirales recientemente identificados.

Los ensayos para la identificación de nuevos antivirales contra la fiebre catarral ovina Virus

En ensayos in vitro para medir la replicación del virus se han mejorado en gran medida por el desarrollo de virus de ARN recombinantes que expresan luciferasa u otras enzimas capaces de bioluminiscencia. A continuación te detallamos una tubería de cribado de alto rendimiento que combina dichas cepas recombinantes de virus del sarampión y chikungunya para aislar a los antivirales de amplio espectro de bibliotecas químicas.

Screening de alto rendimiento para los de amplio espectro químico Inhibidores de Virus ARN

Aquí, presentamos un protocolo que examina pasos específicos de la entrada viral para identificar y evaluar nuevos agentes antivirales.

Ensayos pronta entrada virales para la identificación y evaluación de compuestos antivirales

El primer paso en el ciclo de vida del arenavirus es la unión de las partículas virales a las células huésped. Presentamos un ensayo cuantitativo basado en (q)RT-PCR para la detección y cuantificación ultrasensibles de eventos de adhesión de arenavirus.

Ensayo muy sensible para la medición del Adjunto de células arenavirus

Aquí, presentamos los protocolos para identificar inmunomoduladores 1) virus-codificado que promueven la replicación de arbovirus y host 2) eucariotas factores que limitan la replicación de arbovirus. Estos métodos basados en fluorescencia y luminiscencia permiten a los investigadores obtener rápidamente lecturas cuantitativas de la replicación de arbovirus en análisis simplistas con proporciones bajas de señal a ruido.

Infecciones del arbovirus como herramientas de detección para la identificación de factores antivirales inmunomoduladores y anfitrión Viral

Presentamos un protocolo general para identificar tramos cortos de secuencias de proteínas homolopégicos de patógenos de host (SSHHPS) incrustadas en la poliproteína viral. SSHHPS son reconocidos por proteasas virales y dirigen la destrucción dirigida de proteínas huésped específicas por varios virus del Grupo IV.

Análisis de SSHHPS Viral del Grupo IV utilizando métodos In Vitro y In Silico

El presente protocolo describe nuevas herramientas para ensayos de unión a SPR para examinar la unión CV-N a HA, glicoproteína S, glicanos de tipo híbrido relacionados y oligosacáridos con alto contenido de manosa. SPR se utiliza para determinar el KD para la unión de CV-N dimérico o monomérico a estos glicanos.

Ingeniería de agentes antivirales a través de la resonancia de plasmones de superficie

Este artículo describe la metodología para generar partículas pseudotipadas de SARS-CoV-2 utilizando un sistema reportero luciferasa y su uso para identificar inhibidores de entrada. Estos protocolos se demuestran utilizando dos inhibidores de entrada diferentes, una proteína de fusión humana recombinante ACE2-Fc y el compuesto de pequeña molécula arbidolo.

Procedimientos para la identificación de inhibidores de entrada del SARS-CoV-2 como posibles antivirales utilizando pseudovirus basados en MLV

Aprende a identificar inhibidores de entrada viral contra coxsackievirus A16 mediante ensayos de tiempo de adición y acoplamiento molecular en células RD. Este protocolo sistemático facilita el descubrimiento de candidatos antivirales.

Uso de ensayos de entrada viral y análisis de acoplamiento molecular para la identificación de candidatos antivirales contra el coxsackievirus A16 (Video) | JoVE Journal

Uso de ensayos de entrada viral y análisis de acoplamiento molecular para la identificación de candidatos antivirales contra el coxsackievirus A16

Explorar más videos