Open Source de análisis de contenidos de alta Utilizando microscopía de fluorescencia automatizado de imágenes por vida

El objetivo general de este procedimiento es demostrar cómo implementar la microscopía de imágenes de vida media de fluorescencia con compuerta temporal, o FLIM, en un flujo de trabajo automatizado de placas de múltiples pocillos utilizando software de código abierto e instrumentación básica. Esta metodología puede aplicarse a lecturas basadas en FLIM en una serie de células fijas o vivas. Y es particularmente útil para evaluar el procesamiento de señales celulares o las interacciones entre proteínas.

Las principales ventajas de esta técnica son que el FLIM proporciona lecturas cuantitativas robustas y puede ofrecer la fracción de población de interacción en una sola medición. Al aplicar técnicas de análisis global a miles de células en cientos de campos de visión, podemos utilizar lecturas de transferencia de energía por resonancia de Foster, o FRET. Y aprovechando, por ejemplo, cambios en el tiempo de vida hasta aproximadamente 20 picosegundos.

El procedimiento será demostrado por Sunil Kumar, nuestro investigador asociado, e Ian Munro, nuestro desarrollador de software, junto con Frederik Gorlitz. Comience por iniciar Micromanager y abra el complemento openFLIM-HCA. En la pestaña de control de FLIM, seleccione el archivo de calibración del cuadro de retardo y abra los archivos de calibración.

Seleccione el archivo de calibración para la combinación específica de la unidad generadora de retardos y la frecuencia de repetición del láser de interés. En el menú de archivo, seleccione establecer carpeta base y elija la carpeta donde se guardarán los datos. Después de confirmar que todos los parámetros adecuados han sido configurados, establezca manualmente un ancho de compuerta de cuatro nanosegundos en la caja de control del intensificador óptico compuertado para todo el experimento.

Para adquirir datos de imagen de la función de respuesta del instrumento, coloque manualmente un bloque de haz en la casete del cubo de filtros antes del objetivo para evitar la salida de cualquier luz láser y oriente el bloque de haz para minimizar cualquier reflexión de vuelta hacia el armazón del microscopio. En la pestaña de control de trayectoria de luz, configure los filtros de excitación, dicróico y de emisión en la unidad de disco giratorio, de tal manera que se pueda obtener una imagen de la fracción de luz de excitación dispersada desde el disco Nipkow giratorio sin saturar el sistema durante un tiempo mínimo de integración de la cámara de 200 milisegundos. En la pestaña de control de FLIM, utilice la función de búsqueda del punto máximo sobre todo el rango de retardos cubierto por la caja de retardo rápido programable.

Luego, verifique el trazo de salida mostrado. Y ajuste los tiempos de retardo del curso, de modo que todo el perfil de la función de respuesta del instrumento quede dentro del rango de escaneo del caja de retardo rápido. Ajuste los parámetros de densidad neutra y tiempo de exposición.

Además de la acumulación de cuadros, asegúrese de que la cámara no se sature en la ventana temporal de brillo y de que el tiempo efectivo de integración no sea inferior a 200 milisegundos. En el menú de control de FLIM, seleccione el cuadro de retardo rápido y configure pasos de retardo de 25 picosegundos a lo largo del rango completo de retardo. A continuación, seleccione rellenar retardos y haga clic en capturar imagen FLIM para adquirir una imagen de la función de respuesta del instrumento.

Y espere hasta que finalice la adquisición. En el menú de control de la trayectoria de luz, seleccione densidad neutra y haga clic en bloqueado para bloquear el láser. Abra el menú de control de FLIM y seleccione el cuadro de retardo rápido para reducir el número de pasos de retardo aumentando el valor en el cuadro de incremento.

Luego, haga clic en capturar imagen FLIM para adquirir una imagen de fondo de la cámara. Para adquirir los datos de referencia del dieléctrico, vaya a la pestaña de control XYZ e ingrese el pocillo H4 en el cuadro de diálogo ir al pocillo. A continuación, vaya a la pestaña de control de la trayectoria de la luz y seleccione los filtros de excitación, dicróico y emisión adecuados para la imagen de la proteína fluorescente M turquoise utilizando la función encontrar punto máximo en todo el rango del cuadro de retardo rápido.

Luego, configure los parámetros adecuados para adquirir los datos de referencia del die y una imagen de fondo correspondiente, tal como se acaba de demostrar. Para adquirir los datos de FLIM de una muestra en placa de múltiples pocillos, vaya al menú de adquisición secuenciada de HCA. Seleccione la pestaña de posiciones XYZ y establezca qué pocillos deben ser imagenados y el número de campos de visión que se adquirirán por pocillo.

Seleccione un campo de visión representativo que contenga la muestra que se va a imaginar y ajuste el filtro de densidad neutra óptimo en el tiempo de integración de la cámara para alcanzar el 75 % del rango dinámico de la cámara de lectura. En la pestaña de control XYZ, seleccione el control de enfoque de retorno en el cuadro de diálogo de enfoque automático y enfoque manualmente el microscopio sobre las células o estructuras de interés. Establezca el rango de búsqueda del enfoque automático en 2000 micrómetros y presione Intro.

Luego, haga clic en AF ahora para iniciar el procedimiento de enfoque automático. Aparecerá un valor de desplazamiento en el campo de enfoque automático de desplazamiento de enfoque. Ingrese este valor de desplazamiento en la ventana de desplazamiento de AF y haga clic en AF ahora dos veces para repetir el procedimiento de enfoque automático.

Los valores de compensación ahora deben establecerse en cero, lo que indica un funcionamiento correcto del sistema de enfoque automático. A continuación, en la pestaña de control FLIM, seleccione la función de autogating para asegurar una muestra logarítmica de los puntos de retardo. Establezca el número de cuadros acumulados en un valor que produzca el tiempo total deseado de adquisición de datos.

Luego, en el cuadro de diálogo de adquisición de FLIM, haga clic en el botón iniciar secuencia HCA para ejecutar la adquisición de la placa multipocillo de FLIM y adquirir una imagen de fondo de la cámara, tal como se acaba de demostrar. Aquí se muestra un ensayo representativo de transferencia de resonancia de energía por fluorescencia (FRET) mediante FLIM, utilizando el sistema modelo de FRET expresado en cocélulas y una placa multipocillo, con ejemplos de imágenes de vida media de fluorescencia adquiridas automáticamente que muestran campos típicos de visión visibles en cada pocillo. En este experimento, los pocillos con control negativo presentaron las vidas medias más largas, y las vidas medias del donador mostraron los constructos de FRET más bajos con las longitudes de enlazador más cortas.

En general, la vida media promedio, calculada sobre todos los campos de visión en cada pocillo, varió a lo largo de las placas de múltiples pocillos. El promedio del perfil de decaimiento de la intensidad de fluorescencia del donador sobre todas las células capturadas en el pocillo A1, junto con el ajuste a un modelo de decaimiento monoexponencial y la función de respuesta del instrumento, ilustra que el modelo de ajuste es válido. Un análisis adicional de la vida media de fluorescencia promedio para cada columna de la placa de múltiples pocillos, obtenido a partir de un ajuste monoexponencial por píxel, demuestra que la vida media disminuye en los constructos FRET con longitudes de enlazador más cortas, simulando un experimento con diferentes eficiencias FRET.

En este experimento, los datos de FLIM de un ensayo FRET sobre la acción de diferentes inhibidores en la oligomerización de proteínas se ajustaron a un modelo de decaimiento exponencial simple. El mapa de placas de tiempo de vida de fluorescencia ilustra el tiempo de vida medio por pocillo, promediado en ocho campos de visión. Un conjunto pequeño, que imagina cuatro campos de visión por pocillo, mientras que nuestro ensayo de FLIM puede completarse en aproximadamente dos horas y media, incluyendo el tiempo para adquirir la función de respuesta del instrumento, los datos de referencia del colorante y para ejecutar el análisis en FLIM Fit.

Al realizar un ensayo de FLIM, es importante recordar adquirir la función de respuesta del instrumento y los datos de referencia dieléctrica junto con sus imágenes de fondo, para tener toda la información necesaria para analizar los datos de FLIM. Utilizando nuestro software de código abierto, FLIM fit, también es posible ajustar estos datos a modelos de decaimiento más complejos. Por ejemplo, permitiendo la determinación de la fracción de población de FRET.

Nuestra tecnología FLIM HCA está ayudando a investigadores en la comunidad de descubrimiento de fármacos a realizar mediciones robustas de FRET. En el futuro, esperamos que esta tecnología permita medir constantes de disociación en ensayos basados en células. Asimismo, esperamos que este artículo en video y la información en nuestra Wiki ayuden a otros investigadores a construir sus propios instrumentos de FLIM HCA y aplicarlos a FRET y a otros ensayos.

No olvide que trabajar con láseres puede ser peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como encerrar todos los haces láser, al utilizar este tipo de instrumentación.