Open Source de análisis de contenidos de alta Utilizando microscopía de fluorescencia automatizado de imágenes por vida

El objetivo general de este procedimiento es demostrar cómo implementar la microscopía de imágenes de por vida de fluorescencia dependiente en el tiempo, o FLIM, en un flujo de trabajo automatizado de placas de múltiples pocillos utilizando software de código abierto e instrumentación básica. Esta metodología se puede aplicar a lecturas basadas en FLIM en una serie de celdas fijas o vivas. Y es particularmente útil para leer el procesamiento de señales celulares o las interacciones de proteínas.

Las principales ventajas de esta técnica son que FLIM proporciona lecturas cuantitativas sólidas y puede proporcionar una fracción de población de interacción en una sola medición. La aplicación de técnicas de análisis global a miles de células en cientos de campos de visión, nos permite utilizar lecturas de transferencia de energía de resina o FRET. Y aprovechando, por ejemplo, los cambios de vida útil hasta unos 20 picosegundos.

Sunil Kumar, nuestro investigador asociado, e Ian Munro, nuestro desarrollador de software, demostrarán el procedimiento con Frederik Görlitz. Comience iniciando el micromanager y abra el complemento openFLIM-HCA. En la pestaña Control FLIM, seleccione el archivo de calibración del cuadro de retardo y abra los archivos de calibración.

Seleccione el archivo de calibración para la combinación específica de la unidad generadora de retardo y la tasa de repetición láser de interés. En el menú de archivos, seleccione establecer carpeta base y seleccione la carpeta donde se guardarán los datos. Después de confirmar que se han establecido todos los parámetros apropiados, configure manualmente un ancho de puerta de cuatro nanosegundos en la caja de control del intensificador óptico cerrado para todo el experimento.

Para adquirir datos de imagen de la función de respuesta del instrumento, coloque manualmente un bloque de haz en el casete del cubo de filtro antes del objetivo para evitar el escape de cualquier luz láser e incline el bloque de haz para minimizar cualquier reflexión hacia el marco del microscopio. En la pestaña de control de trayectoria de luz, configure los filtros de excitación, dicroicos y de emisión en la unidad de disco giratorio, de modo que se pueda obtener una imagen de la fracción de luz de excitación dispersada desde el disco Nipkow giratorio sin saturar el sistema durante un tiempo mínimo de integración de la cámara de 200 milisegundos. En la pestaña de control FLIM, utilice la función de búsqueda de punto máximo en todo el rango de retrasos cubiertos por el cuadro de retardo rápido programable.

A continuación, compruebe el seguimiento de salida mostrado. Y configure los tiempos de retardo del curso, de modo que el perfil completo de la función de respuesta del instrumento esté dentro del rango de escaneo del cuadro de retardo rápido. Ajuste los parámetros de densidad neutra y tiempo de exposición.

Así como la acumulación de fotogramas, de modo que la cámara no esté saturada en la puerta de tiempo de brillo y el tiempo de integración efectivo no sea inferior a 200 milisegundos. En el menú de control FLIM, seleccione la casilla de retardo rápido y establezca pasos de retardo de 25 picosegundos en todo el rango de retardo. A continuación, seleccione rellenar retrasos y haga clic en ajustar imagen FLIM para adquirir una imagen de la función de respuesta del instrumento.

Y espere hasta que se complete la adquisición. En el menú de control de la trayectoria de luz, seleccione la densidad neutra y haga clic en bloqueado para bloquear el láser. Abra el menú de control FLIM y seleccione el cuadro de retardo rápido para reducir el número de pasos de retardo aumentando el valor en el cuadro de incremento.

A continuación, haga clic en ajustar imagen FLIM para adquirir una imagen de cámara de fondo. Para adquirir datos de troquel de referencia, vaya a la pestaña de control XYZ e introduzca el pocillo H4 en el cuadro de diálogo Ir al pozo. A continuación, vaya a la pestaña de control de trayectoria de luz y seleccione los filtros de excitación, dicroicos y de emisión adecuados para obtener imágenes de la proteína fluorescente turquesa M utilizando la función de búsqueda de punto máximo en todo el rango de la caja de retardo rápido.

A continuación, establezca los parámetros adecuados para adquirir los datos del troquel de referencia y una imagen de fondo correspondiente, como se acaba de demostrar. Para adquirir los datos FLIM de una muestra de placa de pocillos múltiples, vaya al menú de adquisición secuenciada de HCA de configuración. Seleccione la pestaña Posiciones XYZ y defina qué pocillos se deben fotografiar y el número de campos de visión que se adquirirán por pozo.

Seleccione un campo de visión representativo que contenga la muestra que se va a fotografiar y configure el filtro de densidad neutra óptimo en el tiempo de integración de la cámara para alcanzar el 75% del rango dinámico de la cámara de lectura. En la pestaña Control XYZ, seleccione el control de retorno de enfoque en el cuadro de diálogo de enfoque automático y enfoque manualmente el microscopio en las células o estructuras de interés. Establezca el rango de búsqueda de enfoque automático en 2000 micrómetros y presione enter.

A continuación, haga clic en AF ahora para iniciar el procedimiento de enfoque automático. Aparecerá un valor de desplazamiento en el campo de enfoque automático de desplazamiento de enfoque. Introduzca este valor de desplazamiento en la ventana Desplazamiento AF y haga clic en AF ahora dos veces para repetir el procedimiento de enfoque automático.

Los valores de desplazamiento ahora deben establecerse en cero, lo que indica un funcionamiento correcto del sistema de enfoque automático. A continuación, en la pestaña de control FLIM, seleccione la función de compuerta automática para garantizar un muestreo logarítmico de los puntos de retardo. Establezca acumular fotogramas en un valor que produzca el tiempo total de adquisición de datos deseado.

A continuación, en el cuadro de diálogo Adquisición de FLIM, haga clic en el botón Iniciar secuencia de HCA para ejecutar la adquisición de placas de pocillos múltiples FLIM y adquirir una imagen de cámara de fondo como se acaba de demostrar. Aquí se muestra un ensayo representativo de trastes FLIM utilizando el sistema de trastes modelo expresado en coceldas y una placa de pocillos múltiples, con ejemplos de las imágenes de vida útil de fluorescencia adquiridas automáticamente de campos de visión típicos aparentes en cada pocillo. En este experimento, los pocillos de control negativo presentaron los tiempos de vida más largos, y los tiempos de vida de los donantes exhibieron las construcciones de trastes más bajas con las longitudes de enlace más cortas.

En general, el tiempo de vida promedio promediado en todos los campos de visión de cada pozo varió a través de las placas de pocillos múltiples. El promedio del perfil de desintegración de la intensidad de fluorescencia del donante en todas las células fotografiadas en el pocillo A1 junto con el ajuste a un modelo de desintegración monoexponencial y la función de respuesta del instrumento, ilustra que el modelo de ajuste es válido. Un análisis más detallado de la vida media de la fluorescencia para cada columna de la placa de pocillos múltiples, obtenida a partir de un ajuste exponencial mono píxel, demuestra las disminuciones de la vida útil en las construcciones de trastes con longitudes de enlazador más cortas, simulando un experimento con diferentes eficiencias de trastes.

En este experimento, los datos FLIM de un ensayo de traste de la acción de diferentes inhibidores sobre la oligomerización de proteínas se ajustaron con un único modelo de decaimiento exponencial. El mapa de la placa de fluorescencia ilustra el tiempo de vida medio por pocillo promediado en ocho campos de visión. Un pequeño conjunto, con imágenes de cuatro campos de visión por pozo, mientras que nuestro ensayo FLIM se puede completar en aproximadamente dos horas y media, incluido el tiempo para adquirir la función de respuesta del instrumento, los datos del troquel de referencia y para ejecutar el análisis en ajuste FLIM.

Al realizar un ensayo FLIM, es importante recordar adquirir la función de respuesta del instrumento y los datos del troquel de referencia junto con sus imágenes de fondo para que tenga toda la información necesaria para analizar los datos FLIM. Con nuestro software de código abierto, FLIM fit, también es posible ajustar estos datos en modelos de decaimiento más complejos. Por ejemplo, permitiendo la determinación de la fracción de población de trastes.

Nuestra tecnología FLIM HCA está ayudando a los investigadores de la comunidad de descubrimiento de fármacos a realizar mediciones sólidas de la fricción. En el futuro, esperamos que esta tecnología permita medir las constantes de disociación en ensayos basados en células. Esperamos que este documento de video, así como la información de nuestra Wiki, ayude a otros investigadores a construir su propia instrumentación FLIM HCA y aplicarla a los trastes y a otros ensayos.

No olvide que trabajar con láseres puede ser peligroso y que siempre se deben tomar precauciones como encerrar todos los rayos láser al usar dicha instrumentación.