Name: Generación de organoides testiculares porcinos con arquitectura específica de Testis utilizando Microwell Culture (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Aprende a generar organoides testiculares porcinos con arquitectura específica de testis mediante cultivo en micropocillos. Este protocolo reproducible permite estudiar la morfogénesis testicular y realizar cribados de toxicidad.

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Este trabajo fue apoyado por NIH/NICHD HD091068-01 a la Dra. Ina Dobrinski.

NOTA: Los testículos de lechones de 1 semana de edad se obtuvieron de una granja comercial de cerdos como subproducto de la castración de cerdos comerciales. El abastecimiento de testículos fue aprobado por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Calgary.
1. Preparación de soluciones enzimáticas para la digestión de los tejidos
NOTA: Se necesitan tres soluciones enzimáticas diferentes, que incluyen dos soluciones diferentes de colagenasa IV (solución A, B) y una solución de desoxirribonucleasa I (DNase I).
<ol><li>Para preparar la solución A, disolver 20 mg de colagenasa IV S(Tabla de Materiales)y 40 mg de colagenasa IV W(Tabla de Materiales)en 25 ml de medio de águila modificado (DMEM) de alta glucosa. A continuación, filtre el esterilizado con un filtro de 0,22 m. Añadir 0,4 ml de suero bovino fetal (FBS) a la solución A para inhibir la actividad de la trippsina.</li>
	<li>Para preparar la solución B, disolver 80 mg de colagenasa IV W(Tabla de Materiales)en 40 ml de DMEM. A continuación, filtre el esterilizado con un filtro de 0,22 m.</li>
	<li>Para preparar la solución de DNase I (7 mg/ml), disolver 70 mg de DNase I en 10 ml de DMEM. A continuación, filtre el esterilizado con un filtro de 0,22 m. NOTA: La concentración enzimática de las soluciones de colagenasa IV descritas aquí, varía de las concentraciones (2 mg/ml) indicadas en el artículo14original. El protocolo actual produce celdas con una viabilidad ligeramente mayor. Sin embargo, las células aisladas por ambos protocolos producen organoides con una arquitectura de tejido idéntica.</li>
</ol>2. Digestión enzimática del tejido Testis
<ol><li>Recoger los testículos en un vaso de precipitados estériles y lavar con solución salina tamponada de fosfato (PBS) que contenga 1% de penicilina/estreptomicina (P/S). Después del lavado, transfiera los testículos a un plato de cultivo de tejido de 100 mm con PBS que contenga 1% de P/S y retire la tunica vaginal y el epidídilo usando tijeras y fórceps autoclavedos. Transfiera los testículos aislados a un nuevo plato de 100 mm y lávelos bien con PBS que contenga 1% P/S.</li>
	<li>Para mantener la esterilidad, utilice otro conjunto de tijeras estériles y fórceps para pelar el parénquima testicular de la tunica albuginea. Corte los testículos a lo largo del eje longitudinal directamente debajo de la túnica. A continuación, pelar los testículos de la túnica usando dos fórceps y colocar en un nuevo plato de 100 mm que contenga 1 mL DMEM con 1% P/S.</li>
	<li>Picar los testículos pelados con tijeras estériles en trozos de tejido de 1-2 mm. Después de cortar, utilice fórceps estériles para eliminar fragmentos blancos de tejido conectivo.</li>
	<li>Transferir las piezas de tejido picado en la solución A y rematar hasta 50 ml con DMEM para obtener una concentración de 0,4 mg/ml para la colagenasa IV S(Tabla de materiales)y una concentración de 0,8 mg/ml para la colagenasa IV W(Tabla de materiales). Colocar la solución A que contiene las piezas de tejido en un baño de agua de 37 oC durante 30 minutos, invertir suavemente los tubos cada 5 minutos y comprobar visualmente la liberación de ADN.<ol>
<li>Añadir 500 l de DNase I si se observa ADN flotante libre. Después de 30 min, centrifugar el tubo a 90 x g con frenos a 25oC durante 1,5 min y desechar el sobrenadante. NOTA: El ADN aparecería como una sustancia turbia. Cuando los tubos se agitan, las piezas de tejido se asientan mientras que el ADN se mantendría a flote.</li>
	</ol></li>
	<li>Añadir la solución B al tubo y recargar hasta 50 ml con DMEM para obtener una concentración de 1,2 mg/ml de colagenasa IV W(Tabla de materiales). Colocar el tubo en un baño de agua de 37oC durante 30 minutos e invertir suavemente el tubo cada 5 min. Añadir 500 l de DNase I si se observa ADN flotante libre.</li>
	<li>Después de 30 min, centrifugar el tubo a 90 x g con frenos a 25oC durante 1,5 min. Después de eso desechar el sobrenadante y lavar una vez con PBS con 1% P/S. NOTA: Los sobrenatantes desechados de la solución A y B contendrán principalmente células intersticiales.</li>
	<li>Recargar el tubo con PBS hasta 50 mL. Recoja cuidadosamente los túbulos de la parte superior y colóquelos en un nuevo tubo de 50 ml. NOTA: Los grandes fragmentos de tejido no digeridos se asientan rápidamente en la parte inferior, mientras que los túbulos seminiferosos digeridos permanecerán en suspensión. No se deben recolectar fragmentos grandes de tejido. Este procedimiento se puede repetir varias veces hasta que la solución en el tubo original esté casi clara y solo queden fragmentos de tejido no digeridos, que se pueden eliminar.</li>
	<li>Centrifugar los túbulos a 90 x g con frenos a 25oC durante 1,5 min y desechar el sobrenadante. Agregue PBS fresco y centrífuga de nuevo. Repita este paso de lavado dos veces.</li>
	<li>Después del último lavado de PBS, retire el sobrenadante y resuspenda los túbulos seminiferosos en 5 ml de PBS. A continuación, añadir 15 ml de 0,25% de ácido trypsin-etilendiaminetetraacético (EDTA) a los túbulos. Colocar el tubo en un baño de agua de 37oC e invertir suavemente cada 2 minutos. Si se observa una gran cantidad de ADN flotante, añadir 500 l de DNase I con 5 ml de DMEM.</li>
	<li>Evaluar la digestión enzimática de los túbulos a células individuales bajo el microscopio (primero después de 5 min, luego cada 2 min). Si se pueden detectar principalmente células individuales, detenga la reacción con 5 ml de FBS y filtre a través de una malla de 70 m y luego a través de una malla de 40 m. NOTA: Se debe tener cuidado de que las tapas de los tubos de 50 ml utilizados para las digestiones (Solución A, B y 0,25% de trippsina-EDTA) estén apretadas correctamente. Si la contaminación en el baño de agua es una preocupación, la película de parafina puede estar envuelta alrededor de la tapa para asegurar la esterilidad.</li>
	<li>Centrifugar las células individuales a 500 x g con frenos a 25oC durante 5 min, resuspender en el medio de enriquecimiento (Dulbecco Modified Eagle Medium F/12 (DMEM/F12) que contiene 5% FBS y 1% P/S) y contar el número de células viables. Esta es la población de células partidas. Arreglar 100 x 103 células y realizar inmunocitoquímica para el marcador de células germinales UCHL1 (Ubiquitin C-Terminal Hydrolase L1) como se describe12 y determinar el porcentaje de células germinales en esta población de células iniciales. NOTA: Marcador de células germinales Leucemia promielocítica proteína de dedo de zinc (PLZF)15 también podría utilizarse como una alternativa adecuada para UCHL1. En la población celular inicial, el rendimiento celular esperado es de alrededor de 700-800 x 109/g de tejido. El porcentaje de células germinales en esta población celular debe ser de 4-5%.</li>
	<li>Colocar alrededor de 20 x 106 de esta población de células de partida en dos platos Petri de 100 mm de unión ultrabaja (10 x 106 células suspendidas en 10 ml de DMEM/F12 que contienen 1% P/S en cada plato) durante 2 días en una incubadora de cultivo de tejido (37 oC , 5% CO2, 21% oxígeno). Realice el enriquecimiento de células germinales con las células restantes. NOTA: Para garantizar una visibilidad óptima y la calidad celular, mientras que el enriquecimiento de células germinales y la cuantificación posterior se lleva a cabo, la población de células de partida se coloca en cultivo en platos de cultivo de tejido de unión ultrabaja durante 2 días.</li>
</ol>3. Enriquecimiento de células germinales
NOTA: El procedimiento descrito anteriormente produce principalmente células Sertoli y células germinales. Diferentes propiedades de adhesión permiten la separación de células Sertoli y células germinales a través de chapado diferencial.
<ol><li>Semilla 20-25 x 106 células de la población celular inicial por plato de cultivo de tejido de 100 mm en un volumen total de 8 ml de medio de enriquecimiento (DMEM/F12 con 5% FBS y 1% P/S) para chapado diferencial. Coloque las células en una incubadora (37 oC, 5% CO2,21% O2) y después de 1,5 h, asegúrese de que la mayoría de las células Sertoli se adhieren a la placa.</li>
	<li>Recoger y combinar el sobrenadante (principalmente que contiene células germinales) de 2 placas a una placa nueva de 100 mm y colocarlo de nuevo en la incubadora. Después de 1 h, vuelva a combinar el sobrenadante de 2 placas con una nueva placa de 100 mm. Vuelva a colocar las placas en la incubadora durante la noche. NOTA: Los sobrenadores combinados contendrán principalmente células germinales. Las células adheridas que se desechan junto con las placas son principalmente células somáticas testiculares como Sertoli y células mioides peritubulares.</li>
	<li>Recoja las células germinales enriquecidas en dos fracciones de la siguiente manera. NOTA: Las células germinales enriquecidas se adhieren de manera diferente, fracción no adherente y fracción ligeramente adherida. Ambas fracciones juntas forman la población de células germinales enriquecida<ol>
<li>Fracción no adherente: recoger el sobrenadante.</li>
		<li>Fracción ligeramente adherente: lavar las placas suavemente con PBS, tratar con 2 ml de dilución de 1:20 de trippsina-EDTA durante 5 min a temperatura ambiente, detener la reacción con 2 ml de medio de enriquecimiento y recoger en el mismo tubo que la fracción no adherente. NOTA: 0.25% Trippsin-EDTA necesita ser diluido con PBS para producir una solución de 1:20 trippsina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cuente el número total de células usando un contador celular, fije 100 x 103 células y realice inmunocitoquímica para el marcador de células germinales UCHL1 como se describe12 y determine el porcentaje de células germinales en esta población celular enriquecida. NOTA: El porcentaje de células germinales en esta población celular debe ser de al menos 60-70%. Dado que la inmunocitoquímica para la cuantificación requeriría 1 día, las células enriquecidas deben colocarse en una placa Petri de 100 mm de unión ultrabaja con DMEM/F12 suplementada con 1% de P/S durante la duración para garantizar una calidad y viabilidad celular óptimas.</li>
</ol>4. Preparación de células para la sembración
<ol><li>Para cosechar la preparación de la célula de inicio, recoja el sobrenadante en un tubo de 50 ml de los platos de 100 mm de fijación ultra baja. Lave las placas vigorosamente con PBS para recoger las células adheridas. No se necesita digestión enzimática. NOTA: Algunas de las células testiculares, principalmente las células Sertoli, pueden adherirse ligeramente a las placas de unión ultra baja.</li>
	<li>Combine la preparación de células iniciales y las células germinales enriquecidas para obtener una preparación de células de trabajo que contenga un 25% de células germinales. Centrífuga a 500 x g con frenos a 25oC durante 5 min, desechar el sobrenadante y resuspender las células en el medio de formación de organoides (DMEM/F12 suplementada con insulina de 10 g/ml, transferrina 5,5 g/ml, selenio 6,7 ng/ml, factor de crecimiento epidérmico de 20 ng/ml, 20 ng/ml , 1% P/S). Ajuste la densidad de celda a 2,4 x 106 por ml. NOTA: Cada pocato de las placas de micropocillos utilizados13 en este protocolo contenía 1.200 micropocillos.</li>
	<li>Utilice la fórmula siguiente para calcular el número de celdas por pozo como se describe a continuación. Número de células por pozo- número de micropozos x número de células a agrupar para cada organoide.</li>
	<li>Para generar organoides a partir de 1.000 células cada una, se sube cada una con (1.200 x 1.000 células cada una) 1,2 x 106 células. Ajuste la densidad celular en la suspensión celular de manera que las células se sembran en un volumen de 0,5 ml de medio. Para organoides formados a partir de 1.000 células cada una, utilice una densidad de 2,4 x 106 células por ml (1,2 x 106 células en 0,5 ml).</li>
</ol>5. Preparación de micropozos para recibir células
NOTA: Para asegurarse de que las células no se adhieren a la superficie del micropozo, tratar con una solución de unión surfactante que está disponible para la compra por el fabricante.
<ol><li>Añadir 0,5 ml de solución de enrlado a cada poca. Asegúrese de que no haya burbujas de aire atrapadas en el pozo. Para eliminar las burbujas de aire, si las hay, centrifugar la placa a 2.000 x g con frenos a 25oC durante 2 min.</li>
	<li>Observe la placa bajo un microscopio invertido de bajo aumento, para verificar que las burbujas se han eliminado de los micropocillos. Si se observan burbujas atrapadas, vuelva a centrifugar a 2.000 x g con frenos a 25 oC durante 2 min para eliminar las burbujas restantes.</li>
	<li>Cubra la placa con la tapa e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Una vez finalizado el tratamiento, retire la solución de enjuague y lave inmediatamente la placa con agua estéril o PBS. Asegúrese de que la placa no se seque después del tratamiento con la solución de acuñación.</li>
</ol>6. Generación de organoides testiculares
<ol><li>Añadir 0,5 ml de medio de formación de organoides (sin células) a cada pocal y centrifugar a 2.000 x g con frenos a 25oC durante 2 min para eliminar las burbujas de aire atrapadas. Observe el pozo bajo un microscopio invertido de baja magnificación para verificar que las burbujas de aire se han eliminado. Si se observan burbujas atrapadas, vuelva a centrifugar a 2.000 x g con frenos a 25 oC durante 2 min para eliminar las burbujas restantes.</li>
	<li>Agregue 0,5 ml de la suspensión de la celda de trabajo y mezcle suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Centrífuga a 500 x g con frenos a 25oC durante 5 min. Utilice un microscopio invertido para verificar que las células se han agrupado dentro de los microrpozos.</li>
	<li>Transfiera la placa a una incubadora de cultivo celular y al cultivo durante 5 días. Cambia la mitad del medio cada dos días.<ol>
<li>Para cambiar el medio sin perder ningún organoide, toque la punta de la pipeta a la pared del pozo y baje suavemente para tocar el menisco y dibujar lentamente el medio. Asegúrese de seguir el menisco a medida que cae. Para añadir un medio fresco, toque la punta de la pipeta a la pared del pozo en el mismo lado que la retirada media y agregue el medio fresco suavemente contra la pared del pozo, lo que le permite fluir lentamente por la pared.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para recuperar los organoides, pipetee suavemente el medio hacia arriba y hacia abajo usando una pipeta de boca ancha. Esto permitiría que los organoides salieran de los micropozos.</li>
	<li>Recoger los organoides, lavar con PBS, fijar y realizar inmunocitoquímica para marcador de células germinales (UCH-L1), marcador de células Sertoli (PROTEÍNA de unión DE GATA 4-GATA4), marcador de células mioides peritubulares (-Smooth Muscle Actin-SMA) y marcador celular de Leydig (Citocromo) P450-CYP450) como se describe12 y visualizar bajo un microscopio confocal.</li>
</ol>

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5%28%2Bve%29+stem+cells+drive+self-renewal+in+the+stomach+and+build+long-lived+gastric+units+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro.</a> Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).</li>
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<li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li>
<li>Takebe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularized+and+functional+human+liver+from+an+iPSC-derived+organ+bud+transplant%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant.</a> Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).</li>
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<li>Pendergraft, S. S., Sadri-Ardekani, H., Atala, A., Bishop, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+testicular+organoid%3A+a+novel+tool+for+the+study+of+human+spermatogenesis+and+gonadotoxicity+in+vitrodagger%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional testicular organoid: a novel tool for the study of human spermatogenesis and gonadotoxicity in vitrodagger.</a> Biology of Reproduction. 96 (3), 720-732 (2017).</li>
<li>Strange, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+testicular+organoid+system+as+a+novel+tool+to+study+Zika+virus+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Microbes+%26+Infections%22%5BJournal%5D)">Human testicular organoid system as a novel tool to study Zika virus pathogenesis.</a> Emerging Microbes & Infections. 7 (1), 82-82 (2018).</li>
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<li>Oatley, J. M., Brinster, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+germline+stem+cell+niche+unit+in+mammalian+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The germline stem cell niche unit in mammalian testes.</a> Physiological Reviews. 92 (2), 577-595 (2012).</li>
<li>Chen, L. Y., Willis, W. D., Eddy, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+Gdnf+Gene+in+peritubular+myoid+cells+disrupts+undifferentiated+spermatogonial+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Targeting the Gdnf Gene in peritubular myoid cells disrupts undifferentiated spermatogonial cell development.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 113 (7), 1829-1834 (2016).</li>
</ol>

El Dr. Ungrin tiene un interés financiero en la tecnología AggreWell como inventor.

Hemos establecido un método sencillo que permite la generación consistente y repetible de grandes cantidades de organoides testiculares con arquitectura tisular que es similar a testis in vivo12. Mientras que el enfoque se desarrolló utilizando células testis porcinas, es más ampliamente aplicable también al ratón, primate no humano y testículo s-humano12. Se han notificado varios métodos diferentes para producir organoides testiculares8,<...

En los últimos años, ha habido un resurgimiento del interés en los organoides tridimensionales (3D). Diferentes órganos como intestino1, estómago2, páncreas3,4, hígado5, y cerebro6 se han derivado con éxito en sistemas de organoides 3D. Estos organoides tienen similitudes arquitectónicas y funcionales con los órganos in vivo y son más relevantes biológicamente para el estudio del microambiente tisular que los sistemas de cultivo monocapa7. Como resultado, los organoides testiculares han comenzado a interesar se ademásde8,9,10,11,12. La mayoría de los métodos reportados hasta ahora son complejos, no altos rendimiento10 y requieren la adición de proteínas ECM8,10. Esta complejidad también conduce a problemas de reproducibilidad. Se necesita un método sencillo y reproducible que permita la generación de organoides testiculares con asociaciones celulares que son como testículos in vivo.
Recientemente hemos informado de un sistema para abordar estos requisitos12. Utilizando el cerdo como modelo, empleamos un enfoque centrífugo de agregación forzada en el sistema de micropocillos. En el sistema de micropozos, cada pozo contiene un gran número de micropozos más pequeños idénticos13. Esto permite la generación de numerosos esferoides de tamaño uniforme. El sistema de microrwell permitió la generación de un gran número de organoides uniformes con una arquitectura específica de testis. El sistema es simple y no requiere la adición de proteínas ECM.

<table><tbody><tr><td>Placa de cultivo de tejidos de fijación ultra baja de 100 mm</td><td>Corning</td><td>#CLS3262</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultivo de tejidos de 100 mm</td><td>Corning</td><td>#353803</td><td></td></tr><tr><td>Aggrwell 400</td><td>Stemcell Technologies</td><td>#34411</td><td></td></tr><tr><td>Solución de enjuague antiadherente</td><td>Stemcell Technologies</td><td>#07010</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa tipo IV de Clostridium histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#C5138</td><td>denominada Colagenasa IV S</td></tr><tr><td>Colagenasa tipo IV</td><td>Worthington Worthington-Biochem</td><td>#LS004189</td><td>denominada Colagenasa IV W</td></tr><tr><td>Desoxirribonucleasa I del páncreas bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#DN25</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Águila Modificada' s Medio/F12</td><td>Gibco</td><td>#11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Águila Modificada' s Glucosa media-alta</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#D6429</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#D8537</td><td></td></tr><tr><td>Factor de crecimiento epidérmico</td><td>R& D Systems</td><td>#236-EG</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de celdas Falcon 70 &micro; m</td><td>FisherScientific</td><td>#352350</td><td></td></tr><tr><td>Coladores de células de halcón 40 &micro; m</td><td>FisherScientific</td><td>#352340</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#12483-020</td><td></td></tr><tr><td>Insulina-Transferrina-Selenio</td><td>Gibco</td><td>#41400-045</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#P4333</td><td></td></tr><tr><td>Tejido testicular porcino</td><td>Sunterra Farms Ltd (Alberta, Canadá)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steriflip-GP unidad de filtro superior de tubo de centrífuga estéril</td><td>Millipore</td><td>#SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>tripsina-EDTA</td><td>Sigma</td><td>#T4049</td><td></td></tr></tbody></table>

generación de organoides testiculares porcinos con arquitectura específica de testis utilizando microwell culture

Generation of Porcine Testicular Organoids with Testis Specific Architecture using Microwell Culture

Los organoides son estructuras tridimensionales compuestas por múltiples tipos de células que son capaces de recapitular la arquitectura tisular y las funciones de los órganos in vivo. La formación de organoides ha abierto diferentes vías de investigación básica y traslacional. En los últimos años, los organoides testiculares han despertado interés en el campo de la biología reproductiva masculina. Los organoides testiculares permiten el estudio de las interacciones celulares, el desarrollo de tejidos y el microambiente de nicho de células germinales y facilitan el cribado de toxicidad y fármacos de alto rendimiento. Se necesita un método para generar de forma fiable y reproducible organoides testiculares con una arquitectura de tejido específica para testículos. El sistema de cultivo de micropozos contiene una densa gama de micropozos en forma de pirámide. Las células testiculares derivadas de testículos prepúberes se centrifugan en estos micropozos y se cultivan para generar organoides testiculares con arquitectura de tejido específica de testículos y asociaciones celulares. Miles de organoides homogéneos se pueden generar a través de este proceso. El protocolo aquí reportado será de amplio interés para los investigadores que estudian la reproducción masculina.

Células aisladas de testículos porcinos de 1 semana de edad que se cultivaron en los micropozos autoorganizados en esferoides(Figura 1A, Figura 2), con compartimentos exteriores delineados y distintos (epitelio seminúfero) e interiores ( intersticio)(Figura 1B, Figura 2). Los dos compartimentos estaban separados por una membrana de sótan...

Aquí, presentamos un protocolo para la generación reproducible de organoides testiculares porcinos con arquitectura de tejido específica testis utilizando el sistema de cultivo de micropozos disponible comercialmente.

Generación de organoides testiculares porcinos con arquitectura específica de Testis utilizando Microwell Culture

Organoids are three dimensional structures composed of multiple cell types that are capable of recapitulating tissue architecture and functions of organs ...

Este protocolo es significativo porque permite la generación de organoides de testículos, que se pueden utilizar como plataforma para el estudio de la morfogénesis de los testículos y para los exámenes de alta toxicidad y fármaco tropo. La principal ventaja de esta técnica es que es altamente reproducible, requiere un número relativamente bajo de células y se puede utilizar para generar un gran número de organoides testiculares con arquitectura específica de testículos. Este método se puede aplicar para estudiar otros sistemas, como células madre pluripotentes o células de islotes pancreáticos con las optimizaciones necesarias.Demostrar el procedimiento de digestión enzimática del tejido testicular será Anna Voigt, una estudiante de doctorado de mi laboratorio. Recoger los testículos en un vaso de precipitados estéril y lavar con PBS que contiene 1%estreptomicina de penicilina. Después del lavado transfiera los testículos a un plato de cultivo de tejido de 100 milímetros con PBS que contiene 1%estreptomicina de penicilina.Usa tijeras y fórceps autoclavados para eliminar la túnica vaginal y el epidídimo. Transfiera los testículos aislados a un nuevo plato de 100 milímetros y lávese

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Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Mostramos un método para la necropsia y la disección de modelos de cáncer de próstata de ratón, centrándose en la disección tumoral de próstata. También se presenta un protocolo paso a paso para la generación de organoides tumorales de próstata de ratón.

Generación de organoides tumorales a partir de modelos de ratón de ingeniería genética del cáncer de próstata

La glándula mamaria es una estructura bicapa, que comprende células epiteliales mioepiteliales externas e internas. Presentado es un protocolo para preparar organoides utilizando la trippsinización diferencial. Este método eficiente permite a los investigadores manipular por separado estos dos tipos de células para explorar preguntas sobre sus funciones en la forma y función de la glándula mamaria.

Generación de organoides mamarios de mosaico por trippsinización diferencial

Aquí, se describen cuatro métodos para generar organoides testiculares a partir de células testiculares murinas neonatales primarias, es decir, matriz extracelular (ECM) y entornos de cultivo 2D y 3D libres de ECM. Estas técnicas tienen múltiples aplicaciones de investigación y son especialmente útiles para el estudio del desarrollo testicular y la fisiología in vitro.

Extra Cellular Matrix-Based y Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

Este artículo presenta un protocolo de fabricación para un nuevo tipo de sustrato de cultivo con cientos de microcontenedores por mm2, en el que los organoides pueden ser cultivados y observados utilizando microscopía de alta resolución. También se detallan los protocolos de siembra celular e inmunotinción.

Una plataforma de alto rendimiento para el cultivo y la obtención de imágenes 3D de organoides

Aquí, describimos un protocolo para cultivar organoides 3D intestinales de cerdo a partir de criptas epiteliales criopreservadas. También describimos un método para establecer monocapas celulares derivadas de organoides 3D, permitiendo el acceso al lado apical de las células epiteliales.

Cultivo de organoides 3D intestinales de lechones a partir de criptas epiteliales criopreservadas y establecimiento de monocapas celulares

Este protocolo presenta un método para generar organoides vasculares utilizando células madre pluripotentes humanas.

Generación de organoides vasculares a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos

Este estudio describe un protocolo para generar monocapas 2D de organoides porcinos derivados del intestino delgado y grueso. El crecimiento de estas monocapas se caracteriza por el aumento de los valores de TEER, lo que indica una sólida integridad epitelial. Además, estas monocapas exhiben respuestas secretoras fisiológicas en experimentos en cámara de Ussing después de la aplicación de forskolina.

Organoides intestinales porcinos bidimensionales que reflejan las propiedades fisiológicas del intestino nativo

Este estudio presenta una metodología rentable y eficiente para generar estructuras celulares en 3D utilizando un sistema basado en sellos para crear micropocillos en moldes de agarosa. El sistema promueve la formación de esferoides/organoides uniformes, mejorando así las interacciones celulares. Este enfoque reduce la variabilidad experimental y apoya las aplicaciones en pruebas de fármacos e ingeniería de tejidos.

Generación de esferoides/organoides tridimensionales a partir de cultivos celulares bidimensionales utilizando un novedoso dispositivo de estampado

Describimos métodos para aislar células somáticas ováricas de ratón a partir de una fracción del ovario enriquecida con estroma y para generar organoides somáticos ováricos de ratón utilizando un enfoque sin andamiaje.

Investigación del microambiente ovárico: métodos para aislamiento, cultivo 2D y cultivo organoide de células somáticas ováricas de ratón

Las células madre pluripotentes (hPSCs) tienen el potencial para tratar una gran variedad de enfermedades diferentes. La utilidad de estas células reside en el hecho de que pueden diferenciarse en cualquier tipo de célula en el cuerpo. Aquí se describe el ensayo de teratoma, que se utiliza para demostrar la pluripotence de hPSCs.

Teratoma generación en la cápsula del testículo

Aprende a generar organoides testiculares porcinos con arquitectura específica de testis mediante cultivo en micropocillos. Este protocolo reproducible permite estudiar la morfogénesis testicular y realizar cribados de toxicidad.

Generación de organoides testiculares porcinos con arquitectura específica de Testis utilizando Microwell Culture

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