Electroporación Unicelular A Través De Diferentes Cultivos Organotípicos Slice De Ratón Excitatorio Hipocampal Y Neuronas Inhibitorias Específicas De Clase

Aquí se presenta un protocolo para la electroporación unicelular que puede entregar genes en neuronas excitatorias e inhibitorias a través de un rango de edades in vitro de cultivo de rebanadas de hipocampo. Nuestro enfoque proporciona una expresión precisa y eficiente de genes en células individuales, que se pueden utilizar para examinar las funciones intercelulares y autónomas de la célula.

La transfección génica es un enfoque vital para los estudios de neurobiología. Nuestra técnica de electroporación nos permite transfectar interneuronas de genes de interés en cultivos de cortes de hipocampo organotípicos sin efectos secundarios detectables. Este protocolo tiene una eficiencia de transfección mucho mayor en comparación con otros protocolos de una sola célula, pero sigue siendo relativamente barato y fácil de realizar.

Esta técnica será útil para los investigadores interesados en comprender las funciones moleculares y fisiológicas específicas de las neuronas, incluidos los mecanismos autónomos de las células y las interacciones de proteínas transsinápticas. Para preparar los cultivos en rodajas para la electroporación, transfiera los insertos de cultivo de interés a placas de Petri individuales de tres centímetros cargadas con 900 microlitros de medio de cultivo y coloque los cultivos en una incubadora de dióxido de carbono de mesa. A continuación, preincube los insertos de cultivo frescos con un mililitro de medio de cultivo en rodajas por inserto en una placa de Petri de 3,5 centímetros durante al menos 30 minutos, y esterilice las líneas del equipo de electroporación con lejía al 10% durante cinco minutos.

Al final de la perfusión, enjuague las líneas con agua ionizada esterilizada en autoclave durante al menos 30 minutos antes de perfundir con ACSF esterilizado por filtro que contenga 0,001 milimolar de tetrodotoxina. Ajuste el pulso del electroporador a una amplitud de menos cinco voltios, un pulso cuadrado, un tren de 500 milisegundos, una frecuencia de 50 hercios y un ancho de pulso de 500 microsegundos. Llene una pipeta de vidrio con cinco microlitros de solución interna que contiene plásmidos y golpee suavemente la punta varias veces para eliminar las burbujas atrapadas.

Utilice un microscopio de disección para confirmar que la punta no está dañada y fije firmemente la punta de la pipeta al electrodo. Cuando la punta entre en contacto con el ACSF, registre la lectura de la resistencia de la pipeta del electroporador. Para aislar un cultivo de corte, corte la membrana del inserto de cultivo con una cuchilla afilada y use pinzas de ángulo agudo para transferir cuidadosamente el cultivo de corte a la cámara de electroporación.

A continuación, fije la posición de la referencia cultural con un anclaje de corte. Para la electroporación de las células de interés, aplique presión positiva a la pipeta por vía oral y utilice los controles de perilla tridimensionales para maniobrar la punta de la pipeta cerca de la superficie del cultivo en cortes. Al ver el cultivo con el microscopio, acérquese a la célula objetivo con la punta, manteniendo la presión positiva aplicada hasta que se forme un hoyuelo en la superficie de la célula.

Tras la visualización del hoyuelo, aplique rápidamente una presión negativa leve por la boca para que se forme un sello suelto entre la punta de la pipeta y la membrana plasmática. La membrana entrará ligeramente en la pipeta. Se debe observar un aumento de aproximadamente 2,5 veces en la resistencia inicial de la pipeta, como lo indica un aumento en el tono de los altavoces.

Vuelva a aplicar rápidamente la presión positiva para que el hoyuelo se reforme. Luego, complete inmediatamente al menos dos ciclos de presión más, como se acaba de demostrar, sin pausa. Después del último pulso de presión, mantenga la presión negativa durante un segundo.

Cuando el tono de los altavoces alcance un ápice estable en el tono, use el pedal para pulsar rápidamente el electroporador. Después de la electroporación, retraiga suavemente la pipeta aproximadamente 100 micras de la celda sin aplicar presión y vuelva a aplicar presión positiva, verificando que la resistencia sea similar a la lectura de referencia antes de acercarse a la siguiente celda. Cuando todas las células de interés hayan sido electroporadas, transfiera el cultivo en rodajas a uno de los insertos de cultivo fresco preparados y coloque el inserto a 35 grados Celsius durante un máximo de tres días.

En este experimento representativo, EGFP se transfectó en cinco a 20 neuronas piramidales en el área CA1 del hipocampo durante siete, 14 y 21 días de cultivo in vitro. Las interneuronas de parvalbúmina y glutamato vesicular tipo 3 también se pueden electroporar con éxito dentro del área CA1 del hipocampo. Curiosamente, la transfección no se ve afectada significativamente por la edad del cultivo in vitro del día, y no difiere con la eficiencia de la transfección observada en las neuronas piramidales CA1.

Las neuronas son muy frágiles. Debe ser extremadamente cauteloso y suave al acercarse y presionar ciclando las células y retrayendo la punta de la pipeta para causar daños graves. Después de la electroporación, las células pueden someterse a diversos análisis experimentales, incluida la electrofisiología y la obtención de imágenes.