Electroporación Unicelular A Través De Diferentes Cultivos Organotípicos Slice De Ratón Excitatorio Hipocampal Y Neuronas Inhibitorias Específicas De Clase
6 de octubre de 2020
Aquí se presenta un protocolo para la electroporación unicelular que puede entregar genes en neuronas excitatorias e inhibitorias a través de un rango de edades in vitro de cultivo de rebanadas de hipocampo. Nuestro enfoque proporciona una expresión precisa y eficiente de genes en células individuales, que se pueden utilizar para examinar las funciones intercelulares y autónomas de la célula.
La transfección génica es un enfoque vital para los estudios de neurobiología. Nuestra técnica de electroporación nos permite transfectar interneuronas de genes de interés en cultivos de cortes de hipocampo organotípicos sin efectos secundarios detectables. Este protocolo tiene una eficiencia de transfección mucho mayor en comparación con otros protocolos de una sola célula, pero sigue siendo relativamente barato y fácil de realizar.
Esta técnica será útil para los investigadores interesados en comprender las funciones moleculares y fisiológicas específicas de las neuronas, incluidos los mecanismos autónomos de las células y las interacciones de proteínas transsinápticas. Para preparar los cultivos en rodajas para la electroporación, transfiera los insertos de cultivo de interés a placas de Petri individuales de tres centímetros cargadas con 900 microlitros de medio de cultivo y coloque los cultivos en una incubadora de dióxido de carbono de mesa. A continuación, preincube los insertos de cultivo frescos con un mililitro de medio de cultivo en rodajas por inserto en una placa de Petri de 3,5 centímetros durante al menos 30 minutos, y esterilice las líneas del equipo de electroporación con lejía al 10% durante cinco minutos.
Al final de la perfusión, enjuague las líneas con agua ionizada esterilizada en autoclave durante al menos 30 minutos antes de perfundir con ACSF esterilizado por filtro que contenga 0,001 milimolar de tetrodotoxina. Ajuste el pulso del electroporador a una amplitud de menos cinco voltios, un pulso cuadrado, un tren de 500 milisegundos, una frecuencia de 50 hercios y un ancho de pulso de 500 microsegundos. Llene una pipeta de vidrio con cinco microlitros de solución interna que contiene plásmidos y golpee suavemente la punta varias veces para eliminar las burbujas atrapadas.
Utilice un microscopio de disección para confirmar que la punta no está dañada y fije firmemente la punta de la pipeta al electrodo. Cuando la punta entre en contacto con el ACSF, registre la lectura de la resistencia de la pipeta del electroporador. Para aislar un cultivo de corte, corte la membrana del inserto de cultivo con una cuchilla afilada y use pinzas de ángulo agudo para transferir cuidadosamente el cultivo de corte a la cámara de electroporación.
A continuación, fije la posición de la referencia cultural con un anclaje de corte. Para la electroporación de las células de interés, aplique presión positiva a la pipeta por vía oral y utilice los controles de perilla tridimensionales para maniobrar la punta de la pipeta cerca de la superficie del cultivo en cortes. Al ver el cultivo con el microscopio, acérquese a la célula objetivo con la punta, manteniendo la presión positiva aplicada hasta que se forme un hoyuelo en la superficie de la célula.
Tras la visualización del hoyuelo, aplique rápidamente una presión negativa leve por la boca para que se forme un sello suelto entre la punta de la pipeta y la membrana plasmática. La membrana entrará ligeramente en la pipeta. Se debe observar un aumento de aproximadamente 2,5 veces en la resistencia inicial de la pipeta, como lo indica un aumento en el tono de los altavoces.
Vuelva a aplicar rápidamente la presión positiva para que el hoyuelo se reforme. Luego, complete inmediatamente al menos dos ciclos de presión más, como se acaba de demostrar, sin pausa. Después del último pulso de presión, mantenga la presión negativa durante un segundo.
Cuando el tono de los altavoces alcance un ápice estable en el tono, use el pedal para pulsar rápidamente el electroporador. Después de la electroporación, retraiga suavemente la pipeta aproximadamente 100 micras de la celda sin aplicar presión y vuelva a aplicar presión positiva, verificando que la resistencia sea similar a la lectura de referencia antes de acercarse a la siguiente celda. Cuando todas las células de interés hayan sido electroporadas, transfiera el cultivo en rodajas a uno de los insertos de cultivo fresco preparados y coloque el inserto a 35 grados Celsius durante un máximo de tres días.
En este experimento representativo, EGFP se transfectó en cinco a 20 neuronas piramidales en el área CA1 del hipocampo durante siete, 14 y 21 días de cultivo in vitro. Las interneuronas de parvalbúmina y glutamato vesicular tipo 3 también se pueden electroporar con éxito dentro del área CA1 del hipocampo. Curiosamente, la transfección no se ve afectada significativamente por la edad del cultivo in vitro del día, y no difiere con la eficiencia de la transfección observada en las neuronas piramidales CA1.
Las neuronas son muy frágiles. Debe ser extremadamente cauteloso y suave al acercarse y presionar ciclando las células y retrayendo la punta de la pipeta para causar daños graves. Después de la electroporación, las células pueden someterse a diversos análisis experimentales, incluida la electrofisiología y la obtención de imágenes.
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Descripción general
Este artículo presenta un protocolo para la electroporación de célula individual que permite la transferencia de genes tanto en neuronas excitadoras como inhibidoras en cultivos organotípicos de secciones del hipocampo. Esta técnica permite un control preciso sobre la expresión génica, facilitando el estudio de mecanismos celulares autónomos e interacciones intercelulares en diversas etapas del desarrollo.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Transfección génica
- Electrofisiología
Antecedentes
- La transfección génica es fundamental para la investigación neurobiológica.
- La electroporación ofrece una alta eficiencia de transfección con efectos secundarios mínimos.
- El método es relativamente sencillo y económico en comparación con otras técnicas.
- Comprender las funciones moleculares y fisiológicas en las neuronas es esencial para la neurobiología.
Objetivo del estudio
- Establecer un método eficaz para la transfección de genes en poblaciones neuronales.
- Estudiar funciones y mecanismos moleculares específicos en neuronas excitadoras e inhibitorias.
- Evaluar la eficiencia de transfección en cultivos de cortes de diferentes edades.
Métodos Utilizados
- Se realizó electroforesis en cultivos organotípicos de secciones del hipocampo.
- Las neuronas piramidales y las interneuronas fueron los modelos biológicos clave utilizados.
- La transfección se evaluó en secciones de diversas edades (7, 14 y 21 días in vitro).
- Los pasos detallados incluyen la preparación, las técnicas de pipeteo y el monitoreo de los cambios en la resistencia.
- Las lesiones celulares durante el proceso se minimizaron mediante una manipulación cuidadosa.
Resultados principales
- Se logró una alta eficiencia de transfección génica en neuronas diana sin diferencias significativas entre las edades de los cultivos de cortes.
- La electroporación no afectó negativamente la viabilidad, manteniendo la integridad celular tras la transfección.
- El método permitió estudios detallados sobre las respuestas fisiológicas y los posibles mecanismos de interacción entre neuronas.
- También se demostró la transfección exitosa de interneuronas de la pars y del tipo vesicular de glutamato 3.
Conclusiones
- Este estudio presenta un protocolo robusto para la transfección génica en cultivos neuronales, mejorando las capacidades de investigación en neurobiología.
- El método sienta las bases para futuras investigaciones sobre los mecanismos neuronales y las funciones intercelulares.
- Comprender estos procesos es fundamental para obtener conocimientos sobre la plasticidad neuronal y posibles aplicaciones terapéuticas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La electro poración de célula individual en cultivos de cortes hipocampales organotípicos permite una entrega precisa de genes en neuronas excitadoras e inhibitorias, lo que apoya la validación de dianas y la reducción de riesgos mecanicistas en el descubrimiento en neurociencia. El método proporciona una alta eficiencia de transfección (~80 %) en todas las etapas del desarrollo, permitiendo cribados fenotípicos consistentes y el desarrollo de ensayos para la interrogación de vías. Este enfoque reduce la incertidumbre biológica en las primeras pruebas de hipótesis sobre dianas al posibilitar estudios reproductibles y cuantitativos de expresión génica en sistemas neuronales relevantes para la enfermedad.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas en neuronas excitatorias del hipocampo y en neuronas inhibitorias específicas por clase.
- Valor científico: Apoya la validación funcional de dianas al vincular la expresión génica con lecturas fisiológicas en microcircuitos intactos.
- Valor operativo: Logra una alta eficiencia de transfección sin efectos secundarios detectables, reduciendo la variabilidad experimental.
- Valor operativo: Funciona en cultivos de cortes de diferentes edades (7–21 días in vitro), permitiendo estudios longitudinales de la interacción con la diana.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Prepara sistemas neuronales validados para ensayos posteriores de electrofisiología y análisis de imágenes.
- Valor científico: Proporciona datos cuantitativos con resolución a nivel de célula individual sobre la función génica y las interacciones proteicas.
- Valor operativo: Utiliza equipos estándar de electrofisiología, lo que permite una integración escalable en los flujos de trabajo existentes.
- Valor operativo: Mantiene la eficiencia de transfección durante períodos prolongados de cultivo, facilitando campañas de cribado longitudinales.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Proporciona circuitos hipocampales relevantes para la enfermedad para estudiar mecanismos diana en contextos fisiopatológicos.
- Valor científico: Permite evaluar interacciones proteicas transsinápticas y mecanismos autónomos celulares.
- Valor operativo: Facilita la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante el mantenimiento de la salud neuronal tras la transfección.
- Valor operativo: Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo mediante una entrega fiable y repetible de genes en cultivos primarios de neuronas.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la prueba de hipótesis sobre dianas hasta la identificación de compuestos activos, permitiendo la reducción de riesgos mecanicistas antes del cribado de compuestos.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías en poblaciones neuronales del hipocampo.
- Selección: Proporciona sistemas listos para ensayos con transfección reproducible y resultados cuantitativos para la evaluación de compuestos.
- Análisis: Permite el monitoreo basado en resistencia y lecturas electrofisiológicas para correlacionar la expresión génica con fenotipos funcionales.
- Investigación Traductiva: Conecta estudios de función génica con continuidad preclínica mediante transfección estable en rebanadas organotípicas.
- Reutilización Empresarial: Aprovecha la infraestructura existente de electrofisiología, posicionando el método como una plataforma reutilizable para la validación de dianas neuronales.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en la validación de objetivos mediante una entrega génica de alta eficiencia y baja toxicidad en neuronas primarias.
- Valor operativo: Normalización y reproducibilidad mediante parámetros de pulso y un protocolo de ciclo de presión consistentes.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de avance o interrupción del proyecto al reducir la ambigüedad mecanicista en la interacción con objetivos neuronales.
- Impacto en la cartera: Priorización ajustada al riesgo mediante una evaluación confiable de la función génica en diferentes clases neuronales y etapas de desarrollo.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en electrofisiología y manipulación de micropipetas para el direccionamiento de células individuales.
- Depende de electrodos de vidrio, electroporador y ACSF estéril con tetrodotoxina para la salud neuronal.
- Necesita la estandarización de las secuencias de pulsos de presión y el monitoreo de la resistencia entre diferentes usuarios.
- Las consideraciones de adaptación incluyen el ajuste de la concentración de plásmido y la duración del pulso para diferentes tipos de neuronas o tamaños de genes.
- Limitación práctica: la fragilidad neuronal exige una técnica minuciosa para evitar la ruptura de la membrana durante los ciclos de presión.
