In Vivo CRISPR/Cas9 Screening para evaluar simultáneamente la función génica en la piel del ratón y la cavidad oral

Este protocolo es importante porque permite a los investigadores investigar simultáneamente las funciones supresoras de tumores de cientos de genes en el cáncer de cabeza y cuello a una fracción del costo de un modelo convencional de ratón knockout. Esta técnica es flexible y se puede adaptar para cubrir la expresión de genes para estudiar su función en la piel. El protocolo de biblioteca CRISPR dirigido también se puede aplicar para otros tipos de cáncer.

Coloque el animal anestesiado con el lado ventral hacia arriba en la etapa de cirugía calentada y use cinta quirúrgica para mantener las patas en su lugar. Aplique el tubo de anestesia nasal para un suministro constante de isoflurano y oxígeno hasta que se complete la cirugía. Para confirmar el embarazo E9.5, aplique una pequeña cantidad de crema depilatoria en el abdomen y extiéndala sobre un área cuadrada de tres por tres centímetros cuadrados con un aplicador con punta de algodón.

Después de dos o tres minutos, retire suavemente la crema con una gasa o un pañuelo de papel y limpie el área con PBS y etanol al 70%. Con la sonda de ultrasonido y el gel, compruebe si la rata embarazada está embrionaria en el día E9.5. Esto también se puede hacer el día anterior en E8.5 para ahorrar tiempo el día de la cirugía.

Retire el gel de ultrasonido y limpie el área con BPS y luego con etanol al 70%. Inyecte la mayor cantidad con analgésico subcutáneo. A continuación, se colocan pinzas y tijeras estériles para hacer una incisión vertical en la piel.

Use pinzas romas para separar la piel alrededor de la incisión del peritoneo. A continuación, se colocan pinzas y tijeras estériles para cortar el peritoneo. Con pinzas romas, extraiga suavemente el cuerno del útero izquierdo y derecho y cuente los embriones.

Vuelva a insertar la mayoría de los cuernos uterinos, pero deje expuesto el extremo distal de un cuerno uterino que contiene tres embriones. Con pinzas romas, empuje y tire suavemente del útero con los tres embriones, a través de la abertura en la membrana de silicona de la placa de Petri modificada. Estabilice la placa de Petri con cubos de arcilla para modelar.

Estabilizar el útero con los tres embriones dentro de la placa de Petri, utilizando un molde de silicona. A continuación, aplana el tapón de silicona en el lateral de los embriones con una herramienta roma. Llene la placa de Petri con PBS estéril y enjuague la membrana de silicona en la parte inferior de la placa de Petri, con el vientre de la madre embarazada, evitando así cualquier fuga.

Mueva el cabezal de ultrasonido a la placa de Petri, aproximadamente 0,5 centímetros por encima del embrión superior y ajuste la etapa para que la cavidad amniótica se haga claramente visible en la vista de ultrasonido. Alinee la aguja del inyector, con cuidado, en la placa de Petri modificada. Con el micromanipulador, coloque la punta de la aguja a menos de cinco milímetros del embrión superior, luego mueva la aguja hacia adelante y hacia atrás para moverse hacia el plano donde su punta parece más brillante en la imagen de ultrasonido.

Con el micromanipulador, empuje la aguja a través de la pared uterina hasta la cavidad amniótica. Inyecte 62 nanolitros del lentivirus con la biblioteca de sgRNA a una velocidad de inyección lenta. Presione el botón Inyectar ocho veces para un total de 496 nanolitros por embrión.

Repita el mismo procedimiento para los otros dos embriones. A continuación, levante el cabezal de ultrasonido y retire el tapón de silicona. Empujó suavemente los dos primeros de los tres embriones en el abdomen del ratón con un hisopo de algodón estéril.

Extraiga los siguientes tres embriones y empuje el tercer embrión previamente inyectado. Repita el procedimiento de inyección hasta inyectar el número deseado de embriones, asegurándose de no exceder los 30 minutos de anestesia. Al terminar, levante el cabezal de ultrasonido, retire el micromanipulador con la aguja, aspire el PBS y retire la placa de Petri.

Con toallitas estériles, absorba cualquier PBS que pueda haberse acumulado en la cavidad abdominal. Cierre la incisión peritoneal con suturas reabsorbibles. Luego use dos grapas para cerrar la incisión en la piel abdominal.

A continuación, las lecturas de secuenciación de generación de ADN amplificado por PCR de células transducidas de plásmidos y bibliotecas lentivirales deberían mostrar una alta correlación. Si las lecturas de sgRNA del ADN plasmídico no muestran una representación igual de sgRNA, entonces el procedimiento de preparación y concentración viral debe repetirse con cuidado. Aquí se muestran los resultados de la inyección guiada por ultrasonido de lentivirus portador de Cre recombinasa en crías de ratón confeti E9.5 Lox-STOP-Lox en el día postnatal P0.

Si bien un alto título de virus daría como resultado una mayor cobertura de la piel del ratón, también resultaría en la transducción de múltiples sgRNAs en la misma célula. Este gráfico muestra lecturas de secuenciación de próxima generación de ADN amplificado por PCR, de células transducidas de plásmidos y bibliotecas lentivirales, así como lecturas de cuatro tumores representativos. Las guías de sgRNA dirigidas a los supresores tumorales ADAM10 y RIPK4 se enriquecen en las muestras tumorales en comparación con el grupo de plásmidos o las células infectadas.

Realizar la cirugía en E9.5 es fundamental. Recuerde comprobar el embarazo con ecografía, nueve días después de colocar la cruz e identificar el punto de tiempo embrionario en cada ratón hembra. Una vez que nacen las crías, las células transducidas se pueden aislar y perfilar exhaustivamente utilizando las últimas técnicas de perfil genético, como la secuenciación de ARN de una sola célula.