Aislamiento de (micro) ARN fecal

Presentamos un protocolo para aislar ARN de muestras fecales para estudiar microRNAs. Este protocolo se puede utilizar para aislar el ARN de las heces con alta calidad y cantidad. Minimiza los ARN de los microbios vivos.

Es importante enfatizar que el búfer de enlace no se utiliza en este protocolo. Este protocolo es simple y directo. Comience resuspendiendo de 25 a 100 miligramos de muestras fecales en 600 microlitros de DPBS 1X estéril en un tubo de microcentrífuga de dos mililitros.

Incubar el tubo que contiene la muestra a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, triturar la mezcla con una punta de pipeta de un mililitro y verter bien. Vuelva a suspender la mezcla en un homogeneizador con un ajuste de un ciclo a 4.000 rotaciones por minuto durante 45 segundos para optimizar y aumentar la cantidad y la calidad del ARN.

Agregue 600 microlitros de solución de cloroformo de fenol ácido a la muestra y agite la mezcla durante 60 segundos. Alternativamente, para optimizar una mayor cantidad de ARN en el rendimiento, mézclelo con un homogeneizador. Centrifugar la muestra durante 15 minutos a 10.000 x g a temperatura ambiente para separar la fase acuosa de la orgánica.

Repita la centrifugación hasta que la interfaz esté compacta. Transfiera la fase acuosa superior con cuidado sin alterar la fase inferior a un nuevo tubo de microcentrífuga de dos mililitros con una tapa de bisagra. Agregue etanol 100% de grado ACS a 1,25 x el volumen de la fase acuosa adquirida y vórtice durante tres segundos.

Coloque el cartucho de filtro en los tubos de recolección. Cargue 600 microlitros de cada una de las muestras en el cartucho de filtro provisto en el kit de aislamiento de microARN. Centrifugar a 10.000 x g durante 90 segundos para filtrar la mezcla a través del cartucho.

A continuación, deseche el filtrado. Repita esto hasta que todo el volumen de la mezcla se filtre a través de la misma membrana filtrante en aplicaciones sucesivas. Después de todo, se filtra la muestra.

agregue 700 microlitros de solución de lavado de microARN 1 en el mismo cartucho de filtro. Centrifugar durante 60 segundos para filtrar la solución de lavado a través del cartucho de filtro. Deseche el filtrado y coloque el cartucho de filtro en el mismo tubo de recolección.

Lave el cartucho de filtro con 700 microlitros de solución de lavado 2/3 preparada en etanol 100% de grado ACS y centrifugue a 10, 000 x g durante un minuto. Deseche el filtrado obtenido y coloque el cartucho de filtro en el mismo tubo. Lavar el cartucho filtrante con 500 microlitros de solución de lavado 2/3 y centrifugar a 10.000 x g durante un minuto.

Deseche el filtrado obtenido y coloque el cartucho de filtro en el mismo tubo de recolección. Lave el cartucho de filtro con 250 microlitros de solución de lavado 2/3 preparada en etanol 100% de grado ACS y centrifugue a 10, 000 x g durante un minuto. Deseche el filtrado obtenido y coloque el cartucho de filtro en el mismo tubo de recolección.

Finalmente, transfiera el cartucho de filtro a un nuevo tubo de recolección y gire el conjunto durante cinco minutos para eliminar el líquido residual. Transfiera el cartucho de filtro a un nuevo tubo de recolección, luego agregue 50 microlitros de agua sin nucleasa al centro del filtro y tape el tubo. Incuba el tubo a temperatura ambiente durante 10 minutos.

A continuación, gire el tubo durante cinco minutos a 8.000 x g para recuperar el ARN en un nuevo tubo de recolección. Un ensayo de electroforesis de ARN basado en chips sugiere que los aislados de ARN representativos de las heces de ratón y humanos son bajos o inexistentes en las composiciones de ARNr 18S y 28S y el tamaño de los aislados de ARN cae en la región de ARN pequeña. Otra electroforesis de ARN pequeño con electroforesis basada en chip reveló que una gran parte de los ARN son del tamaño de microARN.

La pureza del ARN extraído fue alta, como lo indica la relación de absorbancia de 2,0 para longitudes de onda de 260 y 280 nanómetros y el valor de la relación de 1,8 para la absorbancia a 260 y 230 nanómetros. Para garantizar el éxito de la extracción orgánica, asegúrese de que las caras sean evidentes y solo transfiera la fase acuosa superior sin perturbar la fase inferior, incluso a costa de un volumen reducido de nuestra fase acuosa.