Complementación de la actividad de empalme por un complejo de galectina-3 - U1 snRNP en perlas

Este informe proporciona la evidencia experimental para la documentación de que un complejo snRNP de galectina-3 U1 se une al sustrato de pre ARNm, forma un complejo funcional y conduce a productos de la reacción de empalme. Este protocolo utiliza la galectina-3 U1 snRNP inmunoseleccionada en perlas acopladas covalentemente a anticuerpos anti-gal3 para iniciar la reacción de empalme, que puede progresar hasta su finalización. Un paso crítico en el protocolo es la eliminación cuidadosa del líquido después de peletizar las perlas que contienen el complejo galectin-3 U1 snRNP y su uso inmediato para iniciar la reacción de empalme.

Para agotar los snRNP de U1 del extracto nuclear, incube 200 microlitros de extracto nuclear con 100 microlitros de perlas anti-U1. Agregue cinco microlitros de ARN a la mezcla y gire el microtubo de cabeza sobre cola a cuatro grados Celsius durante una hora. Granule la mezcla por centrifugación y recoja el material no unido con una jeringa Hamilton.

Diálisar todo el volumen de extracto nuclear empobrecido en U1 junto con una alícuota separada de 50 microlitros del extracto nuclear original no empobrecido en compartimentos separados de un microdializador agitando durante 75 minutos contra un 60% de tampón D a cuatro grados centígrados. Utilice una membrana de diálisis con un corte de peso molecular de 8K. Inmediatamente después de la diálisis, divida las preparaciones en alícuotas de 20 microlitros, luego congélelas en un baño de etanol de hielo seco y guárdelas a menos 80 grados centígrados.

Justo antes de usar, lave las perlas anti-gal3 dos veces con 0,5 mililitros de tampón de lavado TX. Para cada lavado, agregue el tampón de lavado y la centrífuga. Retire el sobrenadante primero con una micropipeta y luego con una jeringa Hamilton para extraer el líquido de las perlas.

Fraccionar el extracto nuclear en un gradiente de glicerol del 12% al 32%. Combine y mezcle las fracciones de gradiente de glicerol tres, cuatro y cinco que están cerca de la región 10S. Prepare dos alícuotas de 150 microlitros de fracciones de gradiente combinadas de la tres a la cinco y colóquelas en 50 microlitros de perlas anti-gal3.

Paralelamente, prepare dos muestras cada una con 150 microlitros de fracción uno y colóquelas en 50 microlitros de perlas anti-gal3. Como control, coloque 150 microlitros de 60% de tampón D en 50 microlitros de perlas anti-gal3. Mezcle suavemente golpeando los tubos, luego gírelos de cabeza sobre cola a cuatro grados centígrados durante una hora.

Granular las muestras con una centrifugación suave. Retire la mayor parte del sobrenadante con una micropipeta. Retire el sobrenadante con una jeringa Hamilton insertando con cuidado la punta de la aguja en la parte inferior de las cuentas.

Utilice los cordones inmediatamente para las reacciones de empalme. Reúna la reacción de empalme como se describe en el manuscrito del texto y agréguela a un conjunto de muestras de cuentas. Reúna un conjunto idéntico de reacciones de empalme en un volumen total de 24 microlitros pero sin extracto nuclear empobrecido en U1 y agréguelo al otro conjunto de cuentas.

Prepare una reacción de empalme de control que se llevará a cabo en ausencia de cordones en un volumen total de 12 microlitros. Esta reacción de control contiene extracto nuclear, 60% de tampón D y sustrato de empalme radiactivo. Mezcle los tubos suavemente golpeando y gírelos de cabeza sobre cola a 30 grados centígrados durante 90 minutos, luego granule la mezcla mediante una centrifugación suave.

Detenga la reacción y eluya las proteínas de las perlas agregando 24 microlitros de tampón de muestra 2X SDS a los tubos que contienen perlas y 12 microlitros de tampón de muestra 2X SDS al tubo de control que contiene extracto nuclear pero sin perlas. Vórtice de cada tubo. Calienta los tubos a 100 grados centígrados durante siete minutos.

Centrifugar los tubos a 1.000 veces G en un rotor de cangilón oscilante a temperatura ambiente durante 10 a 15 segundos. Transfiera los sobrenadantes a micro tubos frescos. Añadir 20 miligramos por mililitro de proteinasa K para digerir y solubilizar las proteínas.

Incuba los tubos a 37 grados centígrados durante 40 minutos. Después de la incubación, centrifugar suavemente los tubos. Diluir las elusiones de las perlas con 39,5 microlitros de TE y 10 microlitros de acetato de sodio de tres molares.

Diluir el control del extracto nuclear con 63,5 microlitros de TE y 10 microlitros de acetato de sodio. Extraiga y analice el ARN tal como se describe en el manuscrito del texto. Los extractos nucleares empobrecidos de los complejos U1 snRNP y gal3 U1 snRNP de la región 10S del gradiente de glicerol inmunoprecipitados por anti-gal3 se mezclaron en una reacción de empalme.

Esta mezcla de reacción contenía el snRNA U1, así como la proteína específica U1-70K de U1. Como era de esperar, el anti-gal3 precipitó gal3. El snRNA U1, la proteína U1-70K y el gal3 no se encontraron en la precipitación de control preinmune.

En comparación con un extracto nuclear no empobrecido realizado como control positivo, el extracto nuclear empobrecido de U1 snRNP no mostró actividad de empalme. La actividad de empalme en el extracto nuclear empobrecido en U1 podría ser reconstituida por el complejo gal3 U1 snRNP unido a perlas. Se encontraron ambos productos de la reacción de empalme, exones ligados e intrones extirpados, así como en intermedios.

Los componentes de las fracciones tres a cinco fueron críticos para restaurar el empalme del extracto nuclear empobrecido en U1. Cuando estas fracciones fueron reemplazadas solo por tampón, no se pudo observar actividad de empalme, lo que indica que las perlas de anti-gal3 no fueron responsables de la restauración de la actividad de empalme en el extracto nuclear empobrecido de U1. De manera más persuasiva, cuando las fracciones tres a cinco fueron reemplazadas por la fracción uno en el procedimiento de inmunoprecipitación y luego se agregaron al extracto nuclear empobrecido en U1, no se encontraron intermedios ni productos de la reacción de empalme. Al intentar este protocolo, una persona debe completar la inmunoprecipitación mientras la otra persona prepara la reacción de empalme con la menor demora posible.

Sería de gran interés el análisis proteómico de la composición polipeptídica de la galectina-3 U1 SNRP que restaura la actividad de empalme a un extracto nuclear empobrecido en U1.