Name: Visualización de las interacciones entre la microbiota intestinal y el huésped a través de la hibridación fluorescente in situ , la tinción de lectina y la obtención de imágenes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Aprende a visualizar bacterias en tejidos mediante hibridación fluorescente in situ (FISH) y tinción de lectina. Este protocolo permite estudiar la localización de taxones bacterianos y sus interacciones con el huésped.

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Kristen Earle por el invaluable desarrollo de la técnica, Amber Hann por la ayuda para la solución de problemas, la Dra. Jen Nguyen y Deanna Pepin por la revisión crítica del manuscrito, y el Dr. Hesham Soliman y el laboratorio Rossi de la Universidad de Columbia Británica por proporcionar acceso al microscopio. Los autores reconocen el apoyo de CIHR Team Grant: Canadian Microbiome Initiative 2 (C.T.), Crohn's and Colitis Canada (to C.T. and K.M.N.), CIFAR (to C.T. and K.M.N.), Michael Smith Foundation for Health Research Scholar Award (to C.T.), the Weston Foundation: Weston Family Microbiome Initiative (to C.T.), Paul Allen Distinguished Investigator Award (to C.T.).

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<li>Johansson, M. E. V., Hansson, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+mucus+in+histological+sections%2C+immunostaining+of+mucins+in+fixed+tissue%2C+and+localization+of+bacteria+with+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Preservation of mucus in histological sections, immunostaining of mucins in fixed tissue, and localization of bacteria with FISH.</a> Methods in Molecular Biology. 842, 229-235 (2012).</li>
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</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses.

El protocolo descrito anteriormente proporciona un método reproducible para visualizar la interfaz huésped-microbiota. Estos ensayos se han beneficiado considerablemente del desarrollo de protocolos, desde la optimización del etiquetado FISH18 hasta la preservación e imagen del moco9. La fijación y la incrustación también proporcionan un almacenamiento útil de muestras; además, los casetes infiltrados en parafina se pueden enviar por correo sin ninguna restricción, ya que las muestras están completamente fijas e inertes.
Importancia y métodos alternativos La combinación de FISH y tinción de moco permite el análisis de la composición de la microbiota en ubicaciones específicas del tejido y la interacción entre las bacterias individuales y el huésped. Las técnicas alternativas que implican el análisis de sitios específicos dentro de la microbiota generalmente no pueden explorar la naturaleza unicelular de estas interacciones, como en el caso de la microdisección de captura láser junto con la secuenciación19. Sin embargo, las técnicas basadas en la secuenciación tienen la ventaja de poder capturar la composición genética de la microbiota a un nivel más fino y más ampliamente que las sondas de ARNr 16S.
Una trampa del protocolo presentado es que proporciona una instantánea única de la microbiota en relación con el huésped. Para la obtención de imágenes en tiempo real en animales vivos, se requieren técnicas especiales de imagen para facilitar la adquisición de una señal de fluorescencia en el tejido profundo (por ejemplo, microscopía intravital de dos fotones y microscopía de fluorescencia de lámina de luz20,21). En estos métodos, el organismo modelo es colonizado con bacterias que se tiñen con moléculas que se unen a su envoltura20 o bacterias modificadas genéticamente que albergan proteínas fluorescentes21. En este último caso, la maduración de las proteínas de fluorescencia es un tema clave, ya que la mayoría de las proteínas fluorescentes estándar requieren oxígeno para emitir luz. Por lo tanto, se requieren organismos modelo que tengan al menos ambientes nanaeróbicos (concentración nanomolar de oxígeno), como el intestino aeróbico del pez cebra21.
En este protocolo, el metanol-Carnoy se utiliza como fijador en lugar de paraformaldehído o formalina porque no contiene agua. Esto evita la hidratación, la deshidratación y el colapso de la capa de moco durante el procesamiento y facilita las mediciones precisas del grosor del moco. Si bien la fijación de metacarno y la incrustación de parafina se han convertido en un estándar en el campo, se han investigado diferentes fijadores y técnicas de incrustación para optimizar la preservación del moco9,22, y algunos estudios indican que las resinas pueden ser superiores a la incrustación de parafina22. Otra limitación importante para la incrustación de parafina y la fijación de metacarna es la pérdida de fluorescencia de proteínas fluorescentes, que puede evitarse mediante el uso de fijadores alternativos (por ejemplo, formalina o paraformaldehído (PFA)) o técnicas de incrustación modificadas23. Cada fijador tiene beneficios e inconvenientes, y la elección del fijador depende de las prioridades de imagen. Las modalidades de imagen se pueden combinar si las réplicas biológicas se fijan en PFA y metacarno y se obtienen imágenes de ambas muestras.
FISH se ha combinado con inmunofluorescencia en casos aislados con anticuerpos policlonales específicos anti-Muc2C3 de conejo9,24. Estos resultados no se han reproducido ampliamente con otros anticuerpos Muc2, lo que indica que la elección de los anticuerpos puede ser crítica en el éxito de la combinación FISH-inmunofluorescencia. Las condiciones para una tinción exitosa de anticuerpos para un anticuerpo dado pueden no permitir la retención de la tinción FISH.
Solución de problemas En este protocolo, la recolección de muestras, la sección y la tinción representan pasos críticos para evitar la creación de artefactos de imágenes. Por ejemplo, presionar el tejido en el momento de la recolección y antes de la incrustación puede conducir a una mala localización de la microbiota y afectar la calidad del moco. Otra consideración importante es evitar la combinación de segmentos de espesores muy diferentes en un solo cassette, como una pieza relativamente vacía del intestino delgado y un pellet dentro del colon distal. Los diferentes espesores conducen a dificultades en la obtención de imágenes: después de la incrustación, la sección transversal a una profundidad específica para un segmento puede estar a la profundidad incorrecta para la obtención de imágenes para el otro (por ejemplo, la luz estará a diferentes profundidades para cada tejido) (Figura 1B, C y Figura 3A). Además, para la obtención de imágenes de gránulos de heces de modelo animal, pueden estar envueltos en membrana peritoneal24. En esta técnica, una pequeña sección de peritoneo recién aislado se pliega suavemente alrededor de las heces y preserva la estructura del pellet durante los pasos de lavado descritos en el protocolo.
A diferencia del procesamiento de tejido animal con contenido, la obtención de imágenes de muestras intestinales humanas presenta algunos desafíos. Específicamente, el contenido luminal y el revestimiento de la mucosa probablemente se verán interrumpidos por la preparación intestinal de colonoscopia que generalmente se realiza antes de las biopsias intestinales o los procedimientos de resección. Además, cuando se recolectan biopsias, es útil anotar la orientación del tejido para ayudar en la identificación de características específicas (por ejemplo, lumen vs. submucosa) en ausencia de contenido intestinal. Pre-incrustación con agar al 3% y/o agar:las mezclas de gelatina pueden ser útiles para mantener la polaridad del tejido25; sin embargo, hay problemas con la deshidratación y la sección de agar, como se informa en la literatura, y los tiempos de procesamiento pueden necesitar ser alterados.
Un aspecto clave para lograr una buena tinción fish proviene del ajuste de la concentración de formamida para sondas FISH específicas. La formamida controlará la rigurosidad de hibridación de las sondas FISH a sus objetivos. Es importante asegurarse de que a) se elija la concentración adecuada de formamida para teñir una comunidad determinada, y b) que incluso sea posible una concentración de formamida adecuada para la combinación de sonda que se está utilizando, esto puede afectar la elección óptima de la sonda cuando se utilizan múltiples sondas. Los sitios web como mathFISH (http://mathfish.cee.wisc.edu/) pueden ayudar a calcular las concentraciones adecuadas de formamida para una sonda determinada. En ausencia de información sobre las concentraciones apropiadas de formamida, este protocolo se puede probar con formamida al 0% y al 10%.
Seccionar las muestras incrustadas requiere cortar el bloque a una profundidad suficiente para obtener cortes luminales, ya que seccionar demasiado superficialmente en un bloque dará como resultado una vista transversal de las vellosidades / criptas sin contenido luminal (Figura 3A). Manche las muestras poco después de la sección para obtener una señal FISH óptima y use DAPI fresco (o DAPI almacenado a -20 ° C) para resolver problemas de fondo (Figura 3C). La tinción fish de secciones que tienen más de un mes de edad puede resultar en una tinción más pobre / inconsistente.
Si el tejido o el cubrebocas no es perfectamente plano con respecto a la diapositiva, es posible que la muestra no esté enfocada en todas las posiciones dentro de una exploración de mosaico (Figura 3B), lo que lleva a un esfuerzo desperdiciado y un posible fotoblanqueo. Esto se puede resolver tomando escaneos de mosaicos más pequeños en los que se ha verificado que todas las posiciones están enfocadas. La seccionamiento con cuchillas opacas también puede conducir al desprendimiento del contenido mucoso y luminal, que aparecen como grandes áreas oscuras durante la toma de imágenes. Finalmente, la evaporación de la solución o burbujas durante el paso de hibridación puede conducir a una tinción desigual de las sondas FISH en el tejido.
Otro parámetro crítico que afecta la eficiencia de la unión de la sonda FISH es la competencia entre diferentes sondas. Una comprobación útil para verificar que la sonda FISH está etiquetando bacterias es examinar la colocalización de la señal de la sonda FISH con DAPI (Figura 2C, D). En muestras que requieren el uso de múltiples sondas de ARNr, el ajuste de parámetros como la temperatura de hibridación, la concentración de la sonda y la formamida se vuelve crítico para garantizar que las sondas se unan a la especie correcta de manera eficiente18.
Notas sobre imágenes Las bacterias teñidas con PECES se visualizan mejor utilizando un microscopio confocal y un objetivo de al menos 40x de aumento. Si bien se prefiere el aumento de 63x a las bacterias de imagen a nivel de una sola célula, el aumento de 40x también se puede usar maximizando el zoom digital o empleando un sistema de superresolución. Los sistemas equipados con capacidades de superresolución también pueden proporcionar resolución subcelular de células bacterianas individuales. Se pueden utilizar objetivos de menor aumento para obtener una sensación general de la localización bacteriana y el grosor del moco.
También se recomienda adquirir imágenes de 16 bits en lugar de imágenes de 8 bits, ya que el rango dinámico más alto ayudará a capturar el amplio rango de la señal DAPI de los núcleos extremadamente brillantes del epitelio y la señal relativamente débil de las bacterias luminales. Además de utilizar la configuración de imágenes descrita anteriormente, una consideración importante de las imágenes es la elección de los fluoróforos. Para una mejor separación entre los tipos bacterianos, asegúrese de que los fluoróforos utilizados no se superpongan en los espectros de excitación y emisión (a menos que se tomen imágenes en un sistema con la capacidad de realizar una desmezcla lineal). Además, las sondas se pueden usar en combinación (por ejemplo, la combinación de una sonda específica de la familia y una sonda específica del género) para identificar miembros adicionales de la comunidad. Si se utilizan sondas lineales sin mezclar o no validadas, es esencial probar la precisión y el nivel de tinción FISH en cultivos puros8,14.
Una vez recogidas las imágenes, se dispone de múltiples herramientas para el análisis cuantitativo de la interfaz huésped-microbiota, como BacSpace26, HiPR-FISH8 y otras herramientas de segmentación27. BacSpace es un software de MATLAB que permite la segmentación de los componentes tisulares y luminales y la eliminación de material vegetal de las imágenes26. El programa también proporciona análisis del espesor de moco en 2D y cuantificación de la distribución espacial basada en distancias de píxeles en diferentes canales26. Por el contrario, el software HiPR-FISH Image Analysis permite la segmentación de células teñidas con FISH8. Finalmente, otras herramientas de segmentación bacteriana que han sido optimizadas para experimentos in vitro27 también podrían adaptarse a esta aplicación.
Conclusión Las imágenes in situ permiten el análisis cuantitativo de taxones microbianos individuales en el contexto de otros miembros de la comunidad y los diversos microambientes creados por la dieta, el moco y las criptas epiteliales del huésped. La interacción entre organismos dicta la biología de los sistemas microbianos asociados al huésped y proporciona un análisis esencial del cambio en estas estructuras durante la perturbación que tiene implicaciones para la salud. En particular, la capacidad de obtener imágenes de la microbiota in situ a través del protocolo descrito anteriormente proporciona una ventana increíble a la biogeografía de la microbiota en relación con el huésped animal.

Las técnicas de visualización microbiana tienen orígenes que son tan antiguos como la microbiología misma, cuando Antonie Van Leeuwenhoek usó su microscopio para observar bacterias (a las que llamó "animalcules") de la placa dental y las heces en el siglo 17. Desde entonces, se han desarrollado numerosas técnicas para visualizar la organización espacial del consorcio de bacterias, hongos y virus que viven asociados a un huésped: la microbiota1. Dilucidar la localización de estos microbios es esencial para determinar su función dentro de su huésped animal. La biogeografía de las bacterias es importante tanto en los taxones comensales como en los patógenos, ya que la proximidad a lugares específicos (por ejemplo, el epitelio), los sustratos nutricionales y los microbios específicos pueden dictar la producción bacteriana de metabolitos subyacentes entre especies e interacciones entre reinos.
Una estructura clave que separa las bacterias y los tejidos del huésped en varios sitios corporales dispares, como la cavidad oral, el intestino o el pulmón, es el moco, una capa producida por el huésped que previene la translocación microbiana en las células epiteliales del huésped y sirve como recurso nutricional para la microbiota2,3,4 . Caracterizar las brechas y cambios en esta barrera es de vital importancia, lo que lleva a una visión mecanicista de las interacciones huésped-microbiota que no se obtendrían solo mediante la secuenciación5,6,7. Por ejemplo, las imágenes permitieron descubrir que la exposición a antibióticos puede alterar la capa de moco y la organización de la microbiota7,8, y que los laxantes pueden agotar el moco, correlacionándose con grandes cambios en los parámetros inmunes5.
Este protocolo describe un marco general para la fijación, tinción e imagen de la microbiota y el tejido huésped (Figura 1), basado en el trabajo de Johansson y Hansson9. Si bien este protocolo se modela en el contexto de las secciones intestinales, se puede adaptar fácilmente a otros tipos de tejidos. Este protocolo permite el procesamiento de muestras clínicas experimentales de animales o humanos; se han incluido notas para el procesamiento de ambos tipos de muestras. En el ejemplo presentado aquí, el epitelio huésped y las bacterias luminales se han marcado simultáneamente con tinción de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), moco con la lectina conjugada con fluoresceína (FITC), Aglutinina I de Ulex europaeus (UEA-1) y un taxón bacteriano específico utilizando FISH. Las sondas FISH generalmente están diseñadas contra los genes de ARNr 16S de un taxón para garantizar la alta señal de unión de una transcripción de alta copia.
En este ejemplo, la sonda se dirige al ARNr 16S de la familia bacteriana Muribaculaceae (Figura 2). Sin embargo, las manchas se sustituyen fácilmente con diferentes sondas FISH y / o lectinas para adaptarse a la pregunta biológica apropiada. Las sondas FISH previamente validadas se pueden encontrar en ProbeBase10, un recurso en línea para sondas de oligonucleótidos dirigidas a ARNr, o en SILVA11, una base de datos de ARN ribosómico. Para el diseño de nuevas sondas, el lector puede referirse a nuevas tuberías como HiPR-FISH8 u Oligominer12. Usando este protocolo, es posible observar el empaquetamiento cercano de bacterias en la luz intestinal y las diferentes características del moco intestinal en todo el tracto digestivo. El flujo de trabajo descrito aquí permite el análisis cuantitativo de la microbiota en el contexto espacial de su entorno huésped.

<table><tbody><tr><td>Papel</td><td></td><td></td><td></td>de aluminio</tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Fisher</td><td>C298-500</td><td>Tarro</td></tr><tr><td>tóxico Coplin</td><td>Fisher</td><td>08-813E</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos, 22 & veces; 22 mm, n.º #1</td><td>VWR</td><td>CA48366-227-1</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>Resuspendido a 5 mg/mL</td></tr><tr><td>Caja(s)</td><td></td><td></td> <td>de punta de pipeta vacíaPara derretir parafina</td></tr><tr><td>Etanol, anhidro, grado molecular</td><td>--</td><td>--</td>Sondas <td></td></tr><tr><td>FISH Solución</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de hibridación FISH</td><td>--</td><td>--</td><td>20 mM Tris&ndash; HCl pH 7,4, 0,9 M NaCl, 0,01% (p/v) SDS en agua libre de nucleasas. Adición opcional de 5&ndash; 50% (v/v) formamida tampón de</td></tr><tr><td>lavado FISH</td> <td>--</td><td>--20</td> <td>mM Tris&ndash; HCl pH 7,4, 0,9 M NaCl</td></tr><tr><td>Ulex Europaeus Aglutinina (UEA-1) lectina marcada con fluorescencia</td><td>Vector Laboratories</td><td>FL-1061 (marcada con fluoresceína) o RL-1062-2 (marcada con rodamina)</td><td>UEA-1 marca glicanos fucosilados, por lo que no es apropiado para ratones libres de gérmenes o para muestras de huéspedes deficientes en fucosiltransferasa 2 (FUT2).</td></tr><tr><td>Pinzas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de formamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>Fumehood</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido Acético Glacial</td><td>Fisher</td><td>A38-212</td><td>Corrosivo e inflamable</td></tr><tr><td>HybriSlip cubreobjetos de plástico flexible, 22 x 22 mm y veces; 0,25 mm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>GBL722222</td><td>para los pasos de hibridación FISH, pueden sustituir a los cubreobjetos de vidrio</td></tr><tr><td>ImmEdge Barrera Hidrofóbica Pluma PAP</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher</td><td>A412</td><td>Microtomo</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> tóxico e inflamable <td>para el corte</td></tr><tr><td>Contenedores de almacenamiento de muestras multipropósito, 473 mL</td><td>Fisher</td><td>14-955-117A</td><td>Puede sustituirlo por un recipiente de vidrio o polietileno de su elección. El metacarn no es compatible con el poliestireno o el metal.</td></tr><tr><td>Esmalte de uñas</td><td>Ciencias de la microscopía electrónica</td><td>72180</td><td>Cualquier esmalte de uñas debe funcionar</td></tr><tr><td>Horno</td><td></td><td></td><td>Rango necesario: 45-60 & grados; C</td></tr><tr><td>Parafina: Leica Paraplast</td><td>Leica</td><td>39601006</td><td></td></tr><tr><td>PBS, solución salina tamponada con fosfato (solución 10x)</td><td>Fisher</td><td>BP3991</td><td>Diluido a 1x para el protocolo</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Fisher</td><td>S271</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil Sulfato de sodio (SDS), solución al 20%, sin RNasa</td><td>Invitrogen</td><td>AM9820</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Loc HistoScreen Cassettes</td><td>Thermo Scientific</td><td>CA83009-999</td><td></td></tr><tr><td>Solución de clorhidrato de Trizma, 1M Tris-HCl, pH 7.4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2663-1L</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Agua, sin nucleasas</td><td>Fisher</td><td>BP2484100</td><td></td></tr><tr><td>Xilenos</td><td>Fisher</td><td>X3P-1GAL</td><td>Tóxico e inflamable</td></tr></tbody></table>

visualización de las interacciones entre la microbiota intestinal y el huésped a través de la hibridación fluorescente in situ , la tinción de lectina y la obtención de imágenes

Visualization of Gut Microbiota-host Interactions via Fluorescence In Situ Hybridization, Lectin Staining, and Imaging

Medir la localización de microbios dentro de su contexto in vivo es un paso esencial para revelar las relaciones funcionales entre la microbiota y el intestino de los vertebrados. El paisaje espacial de la microbiota intestinal está estrechamente controlado por características físicas (moco intestinal, criptas y pliegues) y se ve afectado por propiedades controladas por el huésped, como el pH, la disponibilidad de oxígeno y los factores inmunológicos. Estas propiedades limitan la capacidad de los microbios comensales y los patógenos por igual para colonizar el intestino de manera estable. A escala micrométrica, la organización microbiana determina las interacciones de corto alcance entre diferentes microbios, así como las interacciones entre los microbios y su huésped. Estas interacciones afectan la función de los órganos a gran escala y la salud del huésped.
Este protocolo permite la visualización de la organización espacial de la microbiota intestinal desde las distancias entre las células hasta las escalas de todo el órgano. El método se basa en la fijación de los tejidos intestinales mientras se preservan la estructura intestinal y las propiedades del moco. Las muestras fijas se incrustan, seccionan y tiñen para resaltar especies bacterianas específicas a través de la hibridación fluorescente in situ (FISH). Las características del huésped, como el moco y los componentes de la célula huésped, están etiquetadas con lectinas marcadas fluorescentemente. Finalmente, las secciones teñidas se toman imágenes utilizando un microscopio confocal que utiliza imágenes de escaneo de azulejos a gran aumento para unir las escalas de micras a centímetros de longitud. Este tipo de imágenes se pueden aplicar a secciones intestinales de modelos animales y biopsias de tejidos humanos para determinar la biogeografía de la microbiota en el intestino en la salud y la enfermedad.

Para investigar la localización de bacterias comensales intestinales específicas en el intestino del ratón, en este estudio se utilizaron ratones Webster suizos libres de gérmenes que habían sido colonizados con aislados bacterianos individuales. Para este experimento, las especies bacterianas etiquetadas fueron i) un aislado humano de la familia Muribaculaceae5, Muribaculum intestinale, una familia abundante y prevalente de bacterias en la microbiota murina15, así como ii) Bacteroides thetaiotaomicron, una bacteria intestinal genéticamente tratable y común. Después de dos semanas de equilibrio, los ratones fueron sacrificados, y un segmento del colon que contenía un gránulo fecal fue seccionado y fijado en metacarno recién preparado. Después de dos días de fijación, las secciones se deshidrataron mediante el procesamiento a través de metanol, etanol y xilenos, se infiltraron con parafina, se incrustaron y luego se seccionaron en rodajas luminales de 4 μm. Estas muestras se tiñeron con una sonda FISH (3' Cy3-tagged) específica para el aislado de Muribaculum, diseñada utilizando el software Oligominer12, y se verificó la estructura secundaria y terciaria y la unión mínima no específica utilizando NuPACK y mathFISH16,17. Las muestras también se contrateñeron con la lectina UNIDA a la rodamina UEA-1 (que tiñe los glicanos fucosilados en el moco) y DAPI. Las secciones teñidas se tomaron imágenes utilizando un objetivo de aceite 40x y un módulo de superresolución.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62646/62646fig01.jpg"> Figura 1: Flujo de trabajo de visualización de la interfaz microbiota-huésped en el intestino. (A) Un flujo de trabajo ilustrado para la tubería. (B) Los dos planos de seccionamiento producirán secciones transversales (preferidas para esta tubería) o "rosquillas" de sección transversal. (C) La incrustación de tejidos de espesores muy diferentes puede dar lugar a rebanadas que solo son óptimas para un tejido u otro. Abreviaturas: FISH = hibridación fluorescente in situ ; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62646/62646fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62646/62646fig02.jpg"> Figura 2: Las imágenes del colon muestran la localización de Muribaculum intestinale en relación con el moco en un modelo de ratón gnotobiótico. Las secciones se tiñeron con DAPI (azul), sonda Muribaculaceae FISH (rojo) y UEA-1 (verde). (A) Colon distal de ratón monocolonizado con Muribaculum intestinale y (B) colon distal de ratón bicolonizado con Muribaculum intestinale y Bacteroides thetaiotaomicron. Barra de escala = 20 μm. (C y D) Cy3-FISH (izquierda), DAPI (centro) y canales combinados Cy3-FISH + DAPI para porciones luminales insertadas de (A) y (B), respectivamente. Barra de escala = 5 μm. En (A) y (C), todas las señales DAPI con forma de bacteria y del tamaño de una bacteria están etiquetadas con Cy3 (puntas de flecha simples), y en (B) y (D), además de estas células Cy3 y DAPI de doble positivo (puntas de flecha simples), hay células bacterianas teñidas con DAPI que son Cy3 negativas (puntas de flecha dobles), como se espera para los estados de mono y bicolonización. Con la excepción de las bacterias filamentosas más largas, las estructuras DAPI positivas más grandes (&gt;4 μm de longitud) (flechas romas) son material vegetal o núcleos de células huésped. Abreviaturas: FISH = hibridación fluorescente in situ ; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62646/62646fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62646/62646fig03.jpg"> Figura 3: Problemas comunes. (A) La sección superficial no proporcionará cortes luminales del intestino. (Izquierda) Un segmento intestinal que ha sido seccionado a una profundidad que proporciona una vista de la luz, así como vistas longitudinales del epitelio. (Derecha) Un segmento intestinal que ha sido seccionado demasiado superficialmente, revelando solo secciones transversales de criptas y sin capa de moco constante o bacterias. (B) La cobertura desigual de tejido/deslizamiento puede dar lugar a exploraciones de baldosas borrosas y desigualmente iluminadas. Se configuró un escaneo de mosaicos con posiciones que estaban fuera de foco (esquina superior derecha). (C) Ejemplo de fondo normal (izquierda) y fondo alto (derecha). En este ejemplo, para la señal DAPI, observe la señal proveniente del epitelio, fuera de los núcleos. Todas las barras de escala = 20 μm. Abreviatura: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62646/62646fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Este protocolo simplificado detalla un flujo de trabajo para detectar e obtener imágenes de bacterias en muestras de tejido complejo, desde la fijación del tejido hasta la tinción de microbios con hibridación fluorescente in situ .

Visualización de las interacciones entre la microbiota intestinal y el huésped a través de la hibridación fluorescente in situ , la tinción de lectina y la obtención de imágenes

Measuring the localization of microbes within their in vivo context is an essential step in revealing the functional relationships between the microbiota ...

Los microbios que están asociados al huésped conforman este ecosistema muy complejo que realmente requiere imágenes para ser entendidos. Y a través de esta partícula, le mostraremos cómo pasar por el proceso de tinción y lograr la visualización de la interfaz del microbioma del huésped. Comprender la biología de las bacterias asociadas al huésped requiere una comprensión de su localización dentro de microambientes.Y esta técnica nos permitirá visualizar taxones individuales dentro de los entornos huésped, así como dentro del contexto de otras bacterias. A través de esta técnica, será posible determinar qué bacterias pueden haber penetrado a través del tejido del huésped, así como determinar si las características clave, como el moco del huésped, pueden agotarse. Prepare metacarno fresco en un recipiente compatible con 60% de metanol absoluto, 30% de cloroformo y 10% de ácido acético glacial.Usando herramientas afiladas y limpias, corte los segmentos intestinales de los ratones para obtener imágenes. Minimice la perturbación de la muestra tanto como sea posible y maneje las secciones por sus crestas para evitar afectar el área de imágenes. Fije la muestra tan pronto como sea posible después de la disección para evitar la degradación.Coloque las secciones intestinales en casetes histológicos sosteniendo delicadamente un borde del tejido con pinzas. Cierre el cassette y sumérjalo completamente en una solución de metacarno fresca, asegurándose de que la solución no sea más antigua que unas pocas horas después de la inmersión de los casetes. Para las muestras clínicas que se recogerán en una sala clínica sin acceso a una campana extractora, utilice un recipiente de almacenamiento de polietileno con una solapa cortada en la tapa que permitirá el paso de los casetes histológicos.Cierre con cinta adhesiva esta solapa cuando no pasen muestras para evitar el escape de humos tóxicos. Coloque la parafina en un recipiente resistente al calor y derrita en un horno a 60 grados centígrados durante la noche. Lave el tejido vertiendo el líquido en el recipiente de desechos apropiado e incube secuencialmente en metanol absoluto, etanol absoluto y xileno como se describe en el manuscrito de texto.Abra ligeramente los casetes para permitir que la parafina entre sin perder los segmentos de tejido con guantes dobles o pinzas. Sumergir y cerrar los casetes en el recipiente de parafina derretida. Vuelva a colocar el recipiente en el horno de 60 grados centígrados, asegurándose de que los casetes estén llenos de parafina y que no queden grandes burbujas de aire.Después de la incubación durante dos horas, retire el recipiente del horno. Usando fórceps, retire cuidadosamente los casetes. Calentar el horno a 60 grados centígrados y precalentar un frasco de Coplin.Agregue suficiente volumen de xileno en una botella de vidrio para cubrir los portaobjetos de vidrio en el frasco dos veces y coloque la parapelícula alrededor de la tapa para evitar la evaporación de los xilenos. Permita que la temperatura de los xilenos alcance los 60 grados centígrados. Prepare la solución de hibridación FISH como se menciona en el manuscrito de texto.Coloque las diapositivas en el frasco Coplin, asegurándose de que las secciones no entren en contacto con otras diapositivas o el frasco y hornee las diapositivas a 60 grados centígrados durante 10 minutos. En la campana de humos, llene el frasco de Coplin con xilenos precalentados del horno, teniendo cuidado de no verter directamente sobre las muestras y potencialmente desalojar los tejidos. Coloque el frasco de Coplin de nuevo en el horno de 60 grados.Vierta los xilenos usados en un recipiente de desechos adecuado, teniendo cuidado de no molestar las secciones de tejido en los portaobjetos de vidrio y usando un par de fórceps para evitar que los portaobjetos se caigan del frasco De Coplin. Reponga el frasco de Coplin con los xilenos restantes e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente en la campana de humos. Incubar las secciones en etanol al 99,5% durante cinco minutos a temperatura ambiente.Después de la incubación, retire las diapositivas del frasco de Coplin. Limpie la parte posterior de los portaobjetos en una toallita de laboratorio o una toalla de papel y seque brevemente al aire hasta que las gotas de etanol desaparezcan. Cree círculos muy cercanos alrededor de cada sección de tejido utilizando un bloqueador líquido o una pluma PAP para limitar el área de expansión necesaria para ser cubierta por la solución de hibridación, evitando el contacto de la tinta con la sección.Prepare la solución de hibridación y agregue 0,5 microgramos de sonda por cada 50 microlitros de la solución utilizada. Pipetear la solución en las secciones de la diapositiva. Superponga la sección con cubiertas de plástico flexibles, asegurando que el volumen de líquido utilizado cubra toda la sección.Cree una cámara húmeda con una caja de punta de pipeta con toallitas o toallas de papel que se hayan empapado con un exceso de solución de hibridación o PBS para proporcionar humedad. Incubar el portaobjetos en la cámara húmeda a 45 a 50 grados centígrados durante al menos tres horas, dependiendo de la sonda configurada para reducir la evaporación. Retire las fundas de plástico e incube los portaobjetos en el tampón de lavado FISH en un frasco de Coplin, ambos precalentados a 50 grados centígrados.Coloque el frasco de Coplin de nuevo en el horno de 50 grados Celsius durante 10 a 20 minutos. Retire el tampón de lavado FISH y reemplácelo con PBS en el frasco Coplin. Inmediatamente después de rellenar el frasco de Coplin con PBS, decantar el PBS.Retire las diapositivas del frasco y pipetee la contratinta en la parte superior de toda la sección, mientras se asegura de no tocar el pañuelo con la punta de la pipeta. Incubar a cuatro grados centígrados durante 45 minutos. Lave las manchas tres veces rápidamente con PBS fresco.Limpie la parte posterior de las diapositivas contra una toallita o toalla de papel y deje que la mayor parte del PBS se evapore de las secciones con la ayuda de una línea de vacío conectada a una punta de pipeta. Monte las secciones utilizando un medio de montaje. Fije los cubrehojas a la diapositiva pintando a lo largo de los bordes de la cubierta con esmalte de uñas transparente, teniendo cuidado de mantenerse alejado del borde de la diapositiva.Deja que se cuaje a temperatura ambiente. Aquí se muestran imágenes de colon distal de ratón monocolonizado con Muribaculum intestinale y el bicolonizado con Muribaculum intestinale y Bacteroides thetaiotaomicron. Las muestras se tiñeron con una sonda FISH de tres primos de cianina-3 marcada específica para aislado de Muribaculum y también contrateñida con la lectina unida a rodamina UEA-1 y DAPI.Las imágenes de las secciones teñidas con cianina-3 FISH, DAPI y canales combinados de cianina-3 FISH y DAPI muestran la localización de Muribaculum intestinale. Todas las señales DAPI en forma de bacteria y del tamaño de una bacteria están etiquetadas con cianina-3 en el estado de monocolonización. En el estado de bicolonización, además de estas células doblemente positivas de cianina-3 y DAPI, hay células bacterianas teñidas de DAPI que son cianina-3 negativas como se esperaba.Con la excepción de las bacterias filamentosas más largas, las estructuras DAPI positivas más grandes son material vegetal o núcleos de células huésped. Un segmento intestinal que ha sido seccionado a una profundidad que proporciona una vista de la luz, así como vistas longitudinales del epitelio y un segmento de sección poco profundo que revela solo secciones transversales de criptas y ninguna capa de moco constante o bacterias demuestra que la sección poco profunda no proporcionará cortes luminales del intestino. La cobertura desigual de tejido o cubierta da como resultado escaneos de baldosas borrosas y desigualmente iluminadas.Un ejemplo de fondo normal y fondo alto también se muestran aquí. A medida que aprendemos más sobre la microbiota, se ha vuelto realmente obvio que los ensayos a granel, como la secuenciación, no son suficientes para determinar realmente lo que sucede entre las diferentes especies microbianas y cómo interactúan juntas. Y para esto, realmente requerimos imágenes.Este tipo de técnica ha permitido algunos descubrimientos realmente importantes, por ejemplo, que la privación de fibra de la dieta causa adelgazamiento de la capa de moco y potencialmente infección por patógenos como estudios del grupo Martins, así como estudios sobre los efectos de la diarrea osmótica y cómo el agotamiento de la capa de moco realmente afecta tanto al huésped como a la microbiota. Y estos fueron estudios realizados por el grupo de Sonnenberg, así como por nuestro grupo.

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Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Visualización de las bacterias en los nematodos mediante microscopía de fluorescencia

Fuente: Ng, K. M., Tropini, C. Visualización de las interacciones microbiota-huésped intestinal mediante hibridación in situ por fluorescencia, tinción de lectinas e imagen. J. Vis. Exp. (2021).Este vídeo demuestra el procedimiento de hibridación fluorescente in situ (FISH) para teñir la microbiota intestinal dentro del tejido intestinal del ratón mediante la hibridación de sondas fluorescentes con ARNr bacteriano (ácido ribonucleico ribosómico) y la contracoloración de las estructuras del...

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