Visualización de las interacciones entre la microbiota intestinal y el huésped a través de la hibridación fluorescente in situ , la tinción de lectina y la obtención de imágenes

Este protocolo simplificado detalla un flujo de trabajo para detectar e obtener imágenes de bacterias en muestras de tejido complejo, desde la fijación del tejido hasta la tinción de microbios con hibridación fluorescente in situ .

Los microbios que están asociados al huésped conforman este ecosistema muy complejo que realmente requiere imágenes para ser entendidos. Y a través de esta partícula, le mostraremos cómo pasar por el proceso de tinción y lograr la visualización de la interfaz del microbioma del huésped. Comprender la biología de las bacterias asociadas al huésped requiere una comprensión de su localización dentro de microambientes.

Y esta técnica nos permitirá visualizar taxones individuales dentro de los entornos huésped, así como dentro del contexto de otras bacterias. A través de esta técnica, será posible determinar qué bacterias pueden haber penetrado a través del tejido del huésped, así como determinar si las características clave, como el moco del huésped, pueden agotarse. Prepare metacarno fresco en un recipiente compatible con 60% de metanol absoluto, 30% de cloroformo y 10% de ácido acético glacial.

Usando herramientas afiladas y limpias, corte los segmentos intestinales de los ratones para obtener imágenes. Minimice la perturbación de la muestra tanto como sea posible y maneje las secciones por sus crestas para evitar afectar el área de imágenes. Fije la muestra tan pronto como sea posible después de la disección para evitar la degradación.

Coloque las secciones intestinales en casetes histológicos sosteniendo delicadamente un borde del tejido con pinzas. Cierre el cassette y sumérjalo completamente en una solución de metacarno fresca, asegurándose de que la solución no sea más antigua que unas pocas horas después de la inmersión de los casetes. Para las muestras clínicas que se recogerán en una sala clínica sin acceso a una campana extractora, utilice un recipiente de almacenamiento de polietileno con una solapa cortada en la tapa que permitirá el paso de los casetes histológicos.

Cierre con cinta adhesiva esta solapa cuando no pasen muestras para evitar el escape de humos tóxicos. Coloque la parafina en un recipiente resistente al calor y derrita en un horno a 60 grados centígrados durante la noche. Lave el tejido vertiendo el líquido en el recipiente de desechos apropiado e incube secuencialmente en metanol absoluto, etanol absoluto y xileno como se describe en el manuscrito de texto.

Abra ligeramente los casetes para permitir que la parafina entre sin perder los segmentos de tejido con guantes dobles o pinzas. Sumergir y cerrar los casetes en el recipiente de parafina derretida. Vuelva a colocar el recipiente en el horno de 60 grados centígrados, asegurándose de que los casetes estén llenos de parafina y que no queden grandes burbujas de aire.

Después de la incubación durante dos horas, retire el recipiente del horno. Usando fórceps, retire cuidadosamente los casetes. Calentar el horno a 60 grados centígrados y precalentar un frasco de Coplin.

Agregue suficiente volumen de xileno en una botella de vidrio para cubrir los portaobjetos de vidrio en el frasco dos veces y coloque la parapelícula alrededor de la tapa para evitar la evaporación de los xilenos. Permita que la temperatura de los xilenos alcance los 60 grados centígrados. Prepare la solución de hibridación FISH como se menciona en el manuscrito de texto.

Coloque las diapositivas en el frasco Coplin, asegurándose de que las secciones no entren en contacto con otras diapositivas o el frasco y hornee las diapositivas a 60 grados centígrados durante 10 minutos. En la campana de humos, llene el frasco de Coplin con xilenos precalentados del horno, teniendo cuidado de no verter directamente sobre las muestras y potencialmente desalojar los tejidos. Coloque el frasco de Coplin de nuevo en el horno de 60 grados.

Vierta los xilenos usados en un recipiente de desechos adecuado, teniendo cuidado de no molestar las secciones de tejido en los portaobjetos de vidrio y usando un par de fórceps para evitar que los portaobjetos se caigan del frasco De Coplin. Reponga el frasco de Coplin con los xilenos restantes e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente en la campana de humos. Incubar las secciones en etanol al 99,5% durante cinco minutos a temperatura ambiente.

Después de la incubación, retire las diapositivas del frasco de Coplin. Limpie la parte posterior de los portaobjetos en una toallita de laboratorio o una toalla de papel y seque brevemente al aire hasta que las gotas de etanol desaparezcan. Cree círculos muy cercanos alrededor de cada sección de tejido utilizando un bloqueador líquido o una pluma PAP para limitar el área de expansión necesaria para ser cubierta por la solución de hibridación, evitando el contacto de la tinta con la sección.

Prepare la solución de hibridación y agregue 0,5 microgramos de sonda por cada 50 microlitros de la solución utilizada. Pipetear la solución en las secciones de la diapositiva. Superponga la sección con cubiertas de plástico flexibles, asegurando que el volumen de líquido utilizado cubra toda la sección.

Cree una cámara húmeda con una caja de punta de pipeta con toallitas o toallas de papel que se hayan empapado con un exceso de solución de hibridación o PBS para proporcionar humedad. Incubar el portaobjetos en la cámara húmeda a 45 a 50 grados centígrados durante al menos tres horas, dependiendo de la sonda configurada para reducir la evaporación. Retire las fundas de plástico e incube los portaobjetos en el tampón de lavado FISH en un frasco de Coplin, ambos precalentados a 50 grados centígrados.

Coloque el frasco de Coplin de nuevo en el horno de 50 grados Celsius durante 10 a 20 minutos. Retire el tampón de lavado FISH y reemplácelo con PBS en el frasco Coplin. Inmediatamente después de rellenar el frasco de Coplin con PBS, decantar el PBS.

Retire las diapositivas del frasco y pipetee la contratinta en la parte superior de toda la sección, mientras se asegura de no tocar el pañuelo con la punta de la pipeta. Incubar a cuatro grados centígrados durante 45 minutos. Lave las manchas tres veces rápidamente con PBS fresco.

Limpie la parte posterior de las diapositivas contra una toallita o toalla de papel y deje que la mayor parte del PBS se evapore de las secciones con la ayuda de una línea de vacío conectada a una punta de pipeta. Monte las secciones utilizando un medio de montaje. Fije los cubrehojas a la diapositiva pintando a lo largo de los bordes de la cubierta con esmalte de uñas transparente, teniendo cuidado de mantenerse alejado del borde de la diapositiva.

Deja que se cuaje a temperatura ambiente. Aquí se muestran imágenes de colon distal de ratón monocolonizado con Muribaculum intestinale y el bicolonizado con Muribaculum intestinale y Bacteroides thetaiotaomicron. Las muestras se tiñeron con una sonda FISH de tres primos de cianina-3 marcada específica para aislado de Muribaculum y también contrateñida con la lectina unida a rodamina UEA-1 y DAPI.

Las imágenes de las secciones teñidas con cianina-3 FISH, DAPI y canales combinados de cianina-3 FISH y DAPI muestran la localización de Muribaculum intestinale. Todas las señales DAPI en forma de bacteria y del tamaño de una bacteria están etiquetadas con cianina-3 en el estado de monocolonización. En el estado de bicolonización, además de estas células doblemente positivas de cianina-3 y DAPI, hay células bacterianas teñidas de DAPI que son cianina-3 negativas como se esperaba.

Con la excepción de las bacterias filamentosas más largas, las estructuras DAPI positivas más grandes son material vegetal o núcleos de células huésped. Un segmento intestinal que ha sido seccionado a una profundidad que proporciona una vista de la luz, así como vistas longitudinales del epitelio y un segmento de sección poco profundo que revela solo secciones transversales de criptas y ninguna capa de moco constante o bacterias demuestra que la sección poco profunda no proporcionará cortes luminales del intestino. La cobertura desigual de tejido o cubierta da como resultado escaneos de baldosas borrosas y desigualmente iluminadas.

Un ejemplo de fondo normal y fondo alto también se muestran aquí. A medida que aprendemos más sobre la microbiota, se ha vuelto realmente obvio que los ensayos a granel, como la secuenciación, no son suficientes para determinar realmente lo que sucede entre las diferentes especies microbianas y cómo interactúan juntas. Y para esto, realmente requerimos imágenes.

Este tipo de técnica ha permitido algunos descubrimientos realmente importantes, por ejemplo, que la privación de fibra de la dieta causa adelgazamiento de la capa de moco y potencialmente infección por patógenos como estudios del grupo Martins, así como estudios sobre los efectos de la diarrea osmótica y cómo el agotamiento de la capa de moco realmente afecta tanto al huésped como a la microbiota. Y estos fueron estudios realizados por el grupo de Sonnenberg, así como por nuestro grupo.