Identificación de la fuente de proteínas secretadas en el riñón por la inyección de brefeldina A

Nuestra técnica nos permite identificar la fuente y la contribución relativa de las células productoras de citoquinas en los riñones lesionados. El uso de Brefeldina A para prevenir la secreción de proteínas nos permite recopilar más información sobre las células que producen citoquinas en los órganos sólidos, como el tipo de célula y el estado de estas células.

Nuestro protocolo debe ser fácilmente adaptable a muchos sistemas de órganos. Dado que la brefeldina A es una molécula pequeña permeable a las células, debería inhibir la secreción en la mayoría de los tipos de células, lo que permite la detección de citocinas y otras proteínas secretadas.

La inyección del coxis es el paso más desafiante técnicamente porque el coxis del ratón es bastante pequeño. Recomendamos practicar este paso antes de realizar nuestro protocolo en animales de experimentación.

[Instructor] Comience colocando la jaula mitad en la almohadilla térmica durante 10 minutos para asegurarse de que los ratones estén calientes. Después de colocar al ratón en un dispositivo de sujeción, desinfecte la cola con un hisopo de povidona yodada y alcohol tres veces. Sostenga la cola horizontalmente y visualice las venas laterales de la cola. Luego inserte una aguja de calibre 28, manteniendo la aguja y la jeringa paralelas a la vena hacia la dirección de la cabeza. Inyecte 200 microlitros de la solución BFA de 1,25 miligramos por mililitro. La vena debe aclararse a medida que la sangre se reemplaza con la solución inyectable. Luego retire la aguja y presione la cola suavemente hasta que se detenga el sangrado. Regrese a los ratones a la jaula y vigílelos para detectar sangrado adicional o signos de angustia. Use una jeringa de 20 mililitros y perfunda el mouse con 10 a 20 mililitros de PBS a través del ventrículo izquierdo a una velocidad de flujo de dos a cuatro mililitros por minuto hasta que la perfusión se vuelva transparente. Extirpe los riñones sosteniendo la arteria y la vena renales cerca de la papila y cortando el vaso del lado opuesto al riñón. Luego, retire suavemente la cápsula del riñón despegándola con la mano o con un par de pinzas finas estériles. Use un rotulador de barrera hidrofóbica y delinee las secciones de tejido manteniendo al menos cinco milímetros de distancia desde el tejido hasta el contorno de la barrera hidrofóbica. Luego agregue 50 microlitros de tampón de bloqueo que contenga 3% de suero de burro y 0,1% de tritón en albúmina de suero bovino al 1% TBS en la parte superior de la sección. Incube a temperatura ambiente durante una hora en una cámara humidificada. Diluir los anticuerpos primarios con PBS a la concentración adecuada. Para detectar citocinas, diluya los anticuerpos dirigidos contra TGF beta uno, PDGF-D o CTGF en 50 microlitros de PBS. Agregue el anticuerpo primario Anti-Alpha SMA conjugado con Cy3 a la solución de anticuerpos primarios en diluciones 1:200 para marcar los miofibroblastos. Retire el tampón de bloqueo y agregue los anticuerpos primarios a la sección, asegurándose de que no se escape del contorno hidrofóbico circular. Incubar durante la noche a cuatro grados centígrados en una cámara humidificada. Retire la cámara humidificada de la incubadora y lave los portaobjetos con PBS tres veces durante cinco minutos. A continuación, diluya los anticuerpos secundarios apropiados de uno a 200 con PBS. Incube las muestras con 50 microlitros de soluciones de anticuerpos secundarios durante una hora a temperatura ambiente en una cámara humidificada. Retire los portaobjetos de la cámara humidificada y lávelos con PBS durante cinco minutos. Diluir la lectina de loto tetragonolobus conjugada con fluoresceína en PBS con calcio y magnesio a una concentración de 10 microgramos por mililitro. Luego incube los tejidos con 50 microlitros de solución LTL durante 30 minutos a temperatura ambiente en una cámara humidificada. Retire los portaobjetos de la cámara humidificada y lávelos con PBS con calcio y magnesio durante cinco minutos. Incube los tejidos con 50 microlitros de DAPI para teñir los núcleos de ADN durante cinco minutos a temperatura ambiente. Lávese una vez con PBS. Agregue 20 microlitros de reactivo de montaje antidecoloración al tejido para montar los cubreobjetos y, a continuación, coloque lentamente el cubreobjetos. Espere 24 horas para que el reactivo antidecoloración se solidifique antes de obtener imágenes. Encienda el microscopio invertido con una platina XY automatizada y seleccione el objetivo de 20x. Coloque el portaobjetos en la platina del microscopio y localice la sección de tejido. Luego abra el software de adquisición de imágenes y haga clic en en vivo para abrir la ventana de visualización en vivo. Encuentre la sección de tejido asegurándose de que esté enfocada. Haga clic en el menú de adquisición y seleccione escanear imagen grande. Configure el área para escanear moviendo el escenario con el joystick hacia la parte más a la izquierda de la sección de tejido y luego haga clic en la flecha izquierda. Repita esto para los segmentos de tejido superior, derecho e inferior. Haga clic en el menú de adquisición y asegúrese de que la casilla de verificación para la captura multicanal esté marcada. Para capturar imágenes multicanal, haga clic en la pestaña lambda, haga clic en cada canal y establezca el tiempo de exposición en un nivel en el que la tinción sea evidente sin saturar ninguna parte de la imagen. Repita esto para cada canal que se recopile. Luego haga clic en Escanear. Abra el software de adquisición de imágenes y haga clic en Archivo. Luego haga clic en Abrir y seleccione la imagen. Haga clic con el botón derecho en la ventana de la imagen y elija ROI poligonal. Describe el ROI con una herramienta a mano alzada. A continuación, delinee las células tubulares LTL positivas o las células intersticiales alfa SMA positivas. Haga clic en la pestaña de medición y luego en el umbral. Configure los límites de umbral superior e inferior ajustando los controles deslizantes a ambos lados del área de señal positiva. Luego haga clic en la pestaña ROI. Finalmente haga clic en el icono de exportación para guardar los valores. Utilice un software de hoja de cálculo para calcular los porcentajes del área de señal positiva por área de ROI.

[Presentador] Las vesículas beta positivas para TGF en el tercer día después de la administración de cisplatino o solución salina se muestran en las imágenes representativas. Se observan vesículas beta positivas de TGF en PTC marcadas con LTL en riñones tratados con cisplatino en presencia de BFA. Sin embargo, estas vesículas no se observaron en riñones no lesionados o no tratados con BFA.

[Instructor] La modificación reveló un aumento en el área beta positiva de TGF con el tratamiento BFA en la lesión renal aguda inducida por cisplatino. Similar a TGF beta, las vesículas PTGF-D positivas o CTGF positivas también se acumularon con el tratamiento BFA en la LRA inducida por cisplatino. La cuantificación demostró que las áreas positivas para PDGF-D y CTGF positivas también aumentaron significativamente con BFA En células de túbulos proximales positivas para LTL La inyección de BFA no aumentó significativamente los niveles plasmáticos de BUN el tercer día después de la inyección de cisplatino. Se observaron vesículas TGF beta positivas en células intersticiales marcadas con alfa SMA en IRA de cisplatino con tratamiento con BFA. La modificación reveló que las áreas positivas para TGF beta en el área positiva para la AME alfa aumentaron significativamente con el tratamiento con BFA en la LRA de cisplatino. Al igual que las vesículas beta positivas para TGF, las vesículas positivas para CTGF también aumentaron con el tratamiento con BFA. La cuantificación demostró que el tratamiento con BFA mejoró la relación entre el área positiva de CTGF y el área positiva de SMA alfa en la LRA inducida por cisplatino. En comparación con la lesión inducida por cisplatino, las vesículas positivas para TGF-beta en los PTC fueron mucho más pequeñas en la fase crónica de AA. Hubo una tinción positiva mínima en los PTC positivos para LTL. Sin embargo, la intensidad de la señal de TGF beta en PTC positivos para la molécula de lesión renal uno aumentó con el tratamiento con BFA. El nivel medio de intensidad de TGF beta fue tres veces mayor con la inyección de BFA que sin BFA.

El paso más crítico es asegurarse de que la inyección de la vena de la cola sea exitosa. Una inyección fallida alteraría los resultados. Por lo tanto, busque los signos de éxito, como que la vena se aclare con la inyección, y busque los signos de falla, como la hinchazón sobre las colas.

La inyección de Brefeldina A podría combinarse con una serie de ensayos, incluida la western blot o la citometría de flujo, para evaluar la producción de citoquinas a escala de órgano o de una sola célula.

Usando esta técnica, hemos podido identificar nuevas citoquinas secretadas por las células epiteliales renales que anteriormente se pensaba que provenían de otros tipos de células. Se puede utilizar para resolver debates de larga data sobre la contribución de tipos específicos de células a la lesión.