Name: Extracción y purificación de la proteína FAHD1 del riñón porcino y el hígado de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-18T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: Aprenda a extraer y purificar la proteína FAHD1 de riñón porcino e hígado de ratón preservando su forma fisiológica y actividad catalítica. Este método permite desarrollar anticuerpos de alta calidad para estudios bioquímicos.

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Los autores están muy agradecidos por la asistencia técnica de Ayse Öztürk y Eva Albertini. Los ratones utilizados para la generación de tejido hepático se mantuvieron bajo la supervisión de la Univ.-Doz. Dr. Pidder Jansen-Dürr (Instituto de Investigación Biomédica sobre el Envejecimiento de la Universidad de Innsbruck, Rennweg 10, 6020 Innsbruck, Austria).

<ol><li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+FAH+domain-containing+protein+1+%28FAHD1%29+as+oxaloacetate+decarboxylase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of FAH domain-containing protein 1 (FAHD1) as oxaloacetate decarboxylase.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (11), 6755-6762 (2015).</li>
<li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain-containing+Protein+1+%28FAHD1%29+as+a+novel+mitochondrial+acylpyruvase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of human Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing Protein 1 (FAHD1) as a novel mitochondrial acylpyruvase.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (42), 36500-36508 (2011).</li>
<li>Kang, T. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence+surveillance+of+pre-malignant+hepatocytes+limits+liver+cancer+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Senescence surveillance of pre-malignant hepatocytes limits liver cancer development.</a> Nature. 479 (7374), 547-551 (2011).</li>
<li>Hong, H., Seo, H., Park, W., Kim, K. K. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence%2C+structure+and+function-based+classification+of+the+broadly+conserved+FAH+superfamily+reveals+two+distinct+fumarylpyruvate+hydrolase+subfamilies%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Sequence, structure and function-based classification of the broadly conserved FAH superfamily reveals two distinct fumarylpyruvate hydrolase subfamilies.</a> Environmental Microbiology. 22 (1), 270-285 (2020).</li>
<li>Timm, D. E., Mueller, H. A., Bhanumoorthy, P., Harp, J. M., Bunick, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+and+mechanism+of+a+carbon-carbon+bond+hydrolase%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Crystal structure and mechanism of a carbon-carbon bond hydrolase.</a> Structure. 7 (9), London, England. 1023-1033 (1999).</li>
<li>Bateman, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+inferences+from+the+crystal+structure+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+with+a+bound+phosphorus-based+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanistic inferences from the crystal structure of Fumarylacetoacetate Hydrolase with a bound phosphorus-based inhibitor.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (18), 15284-15291 (2001).</li>
<li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+bi-functionality+of+human+oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the bi-functionality of human oxaloacetate decarboxylase FAHD1.</a> Biochemical Journal. 475 (22), 3561-3576 (2018).</li>
<li>Etemad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1+-+a+new+regulator+of+mitochondrial+function+and+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">Oxaloacetate decarboxylase FAHD1 - a new regulator of mitochondrial function and senescence.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 177, 22-29 (2019).</li>
<li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cellular+senescence+by+eukaryotic+members+of+the+FAH+superfamily+-+A+role+in+calcium+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">Regulation of cellular senescence by eukaryotic members of the FAH superfamily - A role in calcium homeostasis.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 190, 111284(2020).</li>
<li>Petit, M., Koziel, R., Etemad, S., Pircher, H., Jansen-Dürr, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1+inhibits+mitochondrial+electron+transport+and+induces+cellular+senescence+in+human+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Depletion of oxaloacetate decarboxylase FAHD1 inhibits mitochondrial electron transport and induces cellular senescence in human endothelial cells.</a> Experimental Gerontology. 92, 7-12 (2017).</li>
<li>Wiley, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+induces+senescence+with+a+distinct+secretory+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction induces senescence with a distinct secretory phenotype.</a> Cell Metabolism. 23 (2), 303-314 (2016).</li>
<li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression%2C+purification%2C+crystallization%2C+and+enzyme+assays+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain-containing+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Expression, purification, crystallization, and enzyme assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing proteins.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59729(2019).</li>
<li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain+Containing+Protein+1+%28FAHD1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Molcules%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain Containing Protein 1 (FAHD1).</a> Molcules. 26 (16), 5009(2021).</li>
<li>Mizutani, H., Kunishima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification%2C+crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+the+fumarylacetoacetase+family+member+TTHA0809+from+Thermus+thermophilus+HB8%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+F+Structural+Biology+and+Crystallization+Communications%22%5BJournal%5D)">Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of the fumarylacetoacetase family member TTHA0809 from Thermus thermophilus HB8.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 63 (9), 792-794 (2007).</li>
<li>Lee, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+outline+of+methods+for+protein+isolation+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">A simple outline of methods for protein isolation and purification.</a> Endocrinology and Metabolism. 32 (1), Seoul, Korea. 18-22 (2017).</li>
<li>Amer, H. E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+proteins%3A+Between+meaning+and+different+methods%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Technologies+and+Applications%22%5BJournal%5D)">Purification of proteins: Between meaning and different methods).</a> Proteomics Technologies and Applications. , (2019).</li>
<li>Niu, L., Yuan, H., Gong, F., Wu, X., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+extraction+methods+shape+much+of+the+extracted+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Protein extraction methods shape much of the extracted proteomes.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 802(2018).</li>
<li>Gordon, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+vanadate+as+protein-phosphotyrosine+phosphatase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Use of vanadate as protein-phosphotyrosine phosphatase inhibitor.</a> Methods in Enzymology. 201, 477-482 (1991).</li>
<li>Gallagher, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SDS-polyacrylamide+gel+electrophoresis+%28SDS-PAGE%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Essential+Laboratory+Techniques%22%5BJournal%5D)">SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).</a> Current Protocols in Essential Laboratory Techniques. , (2012).</li>
<li>Ahmed, U., Saunders, G. Effect of pH on Protein Size Exclusion Chromatography. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/applications/5990-8138EN.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/applications/5990-8138EN.pdf</a> (2011).</li>
<li>Sørensen, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silver+staining+of+proteins+on+electroblotting+membranes+and+intensification+of+silver+staining+of+proteins+separated+by+polyacrylamide+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Silver staining of proteins on electroblotting membranes and intensification of silver staining of proteins separated by polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Analytical Biochemistry. 304 (1), 33-41 (2002).</li>
<li>Fagerberg, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+human+tissue-specific+expression+by+genome-wide+integration+of+transcriptomics+and+antibody-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 13 (2), 397-406 (2014).</li>
<li>Cytiva Life Fundamentals of size exclusion chromatography. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/protein-research/knowledge-center/protein-purification-methods/size-exclusion-chromatography">https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/protein-research/knowledge-center/protein-purification-methods/size-exclusion-chromatography</a> (2022).</li>
<li>Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+protein+expression+in+Escherichia+coli%3A+advances+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges.</a> Frontiers in Microbiology. 5, 172(2014).</li>
<li>Rosano, G. L., Morales, E. S., Ceccarelli, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+recombinant+protein+production+in+Escherichia+coli%3A+A+5-year+update%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%3A+A+Publication+of+the+Protein+Society%22%5BJournal%5D)">New tools for recombinant protein production in Escherichia coli: A 5-year update.</a> Protein Science: A Publication of the Protein Society. 28 (8), 1412-1422 (2019).</li>
</ol>

Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos.

Pasos críticos en el protocolo Seguir pautas comunes para el manejo de proteínas es esencial, como trabajar en hielo y en condiciones moderadas de pH y sal. El uso de inhibidores de la proteasa es beneficioso para el método, mientras que el uso de inhibidores del proteasoma es muy recomendable. La congelación y descongelación de la muestra siempre puede dar lugar a la precipitación de proteínas (al menos parcialmente), por lo que cualquier alícuota descongelada de lisado proteico inicial (paso 2) debe...

La proteína 1 que contiene el dominio faH eucariota (FAHD1) actúa como oxaloacetato bifuncional (OAA) descarboxilasa (ODx)1 y acilpiruvato hidrolasa (ApH)2. Se localiza en las mitocondrias2 y pertenece a la amplia superfamilia faH de enzimas 1,2,3,4,5,6. Mientras que su actividad apH es solo de menor relevancia, la actividad ODx de FAHD1 está involucrada en la regulación del flujo del ciclo TCA 1,7,8,9. La OAA no solo es necesaria para la reacción de la citrato sintasa central en el ciclo del ácido tricarboxílico, sino que también actúa como un inhibidor competitivo de la succinato deshidrogenasa como parte del sistema de transporte de electrones y como metabolito cataplerótico. La regulación a la baja de la expresión del gen FAHD1 en células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) resultó en una reducción significativa en la tasa de proliferación celular10, y una inhibición significativa del potencial de membrana mitocondrial, asociada con un cambio concomitante a la glucólisis. El modelo de trabajo se refiere a la disfunción mitocondrial asociada a la senescencia (MiDAS)11-como el fenotipo8, donde los niveles de OAA mitocondrial están estrechamente regulados por la actividad de FAHD1 1,8,9.
La proteína recombinante es más fácil de obtener a través de la expresión y purificación de la bacteria12 en lugar de a partir del tejido. Sin embargo, una proteína expresada en bacterias puede estar sesgada por la posible falta de modificaciones post-traduccionales, o simplemente puede ser problemática (es decir, debido a la pérdida de plásmidos, respuestas al estrés bacteriano, enlaces disulfuro distorsionados / no formados, secreción nula o deficiente, agregación de proteínas, escisión proteolítica, etc.). Para ciertas aplicaciones, la proteína debe obtenerse a partir de lisado celular o tejido, con el fin de incluir tales modificaciones y / o excluir posibles artefactos. La proteína purificada del tejido apoya el desarrollo de anticuerpos de alta calidad y/o inhibidores farmacológicos potentes y específicos para enzimas seleccionadas, como para FAHD113.
Este manuscrito presenta una serie de métodos para la extracción y purificación de FAHD1 a partir de riñón porcino e hígado de ratón. Los métodos descritos requieren cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC), pero por lo demás utilizan equipos de laboratorio comunes. Los métodos alternativos se pueden encontrar en otros lugares 14,15,16,17. Después de la extracción total de proteínas, el protocolo propuesto implica una fase de prueba, en la que se discuten los subprotocolos para la precipitación de sulfato de amonio y la cromatografía de intercambio iónico (Figura 1). Después de definir estos subprotos protocolos, la proteína de interés se extrae a través de una estrategia secuencial utilizando intercambio iónico y cromatografía de exclusión de tamaño con FPLC. Sobre la base de estas directrices, el protocolo final puede adaptarse individualmente para otras proteínas de interés.
<img alt="Flujo de trabajo de procesamiento de tejidos: centrifugación, precipitación, cromatografía; Análisis de Western Blot." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63333/63333fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: La estrategia general de este protocolo. De arriba a abajo: La proteína se extrae de los tejidos. El homogeneizado tisular se prepara, centrifuga y filtra. Para cada par de muestras sobrenadantes y derivadas de pellets, se deben realizar pruebas de precipitación de sulfato de amonio y cromatografía de intercambio iónico (FPLC) para sondear las condiciones óptimas. Después de establecer estos subprotos protocolos, la proteína se puede extraer a través de un procedimiento secuencial de precipitación de sulfato de amonio, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de exclusión de tamaño repetitivo (FPLC) a diferentes concentraciones de pH y sal. Todos los pasos deben ser controlados por Western Blot. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63333/63333fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>0,22 y micro; m unidades de filtrado</td><td>MERCK</td><td>SLGP033RS</td><td>Millex-HP, 0,22 y micro; m, PES 33 mm, no estéril</td></tr><tr><td>0,45 y micro; m unidades de filtrado</td><td>MERCK</td><td>SLHP033NS</td><td>Millex-HP, 0,45 y micro; m, PES 33 mm, no estéril</td></tr><tr><td>15 mL Tubos Falcon</td><td>VWR</td><td>734-0451</td><td>Tubos centrífugos</td></tr><tr><td>50 mL Tubos Falcon</td><td>VWR</td><td>734-0448</td><td>Tubos centrífugos</td></tr><tr><td>Microplaca UV de 96 pocillos Thermo-Fischer</td><td></td><td>8404</td><td>UV/VIS transparente de fondo plano Placas de 96 pocillos Solución de</td></tr><tr><td>acrilamida/Bis (40%, proporción 29:1)</td><td>BIO-RAD</td><td>#1610147</td><td>40% de acrilamida/bis-acrilamida, solución 29:1 (reticulante al 3,3%) para fundir geles de poliacrilamida</td></tr><tr><td>&Auml; Sistema FPLC</td> KTA GE <td>Healthcare Life Sciences / Cytiva-utilizando</td><td></td> <td>el sistema FPLC de GE Healthcare; existen diferentes versiones personalizadas; en este trabajo se utilizó el sistema "&Auml; Sistema "KTA puro"</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa</td><td>MERCK</td><td>UFC901024</td><td>filtros centrífigos para el enriquecimiento de proteínas; filtro de masa molecular de 10 kDa; 15 mL</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membran,</td> filtros centrífigos <td>MERCK</td><td>UFC801024</td> de 10 kDa <td>para el enriquecimiento de proteínas; filtro de masa molecular de 10 kDa; 4 mL</td></tr> de <tr><td>polvo de sulfato de amonio</td><td>MERCK</td><td>A4418</td><td>sulfato de amonio para biología molecular, &ge; 99,0 %</td></tr> <tr><td>Grado reactivo de persulfato de amonio, 98 %</td> Catalizador <td>de 215589 MERCK</td><td></td><td>para la polimerización en gel de acrilamida.</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant blue R 250</td><td>MERCK</td><td>1125530025</td><td>Coomassie Brilliant blue R 250 (C.I. 42660) para electroforesis Marca registrada de Imperial Chemical Industries PLC. CAS 6104-59-2, pH 6,2 (10 g/l, H2O, 25 & deg; C)</td></tr><tr><td>Tubo de diálisis membrana de celulosa</td><td>MERCK</td><td>D9277</td><td>Membranas de celulosa para el intercambio de tampones mediante diálisis.</td></tr><tr><td>Tubos de escape de 1,5 mL</td><td>Tubos microcentrífugos</td><td>VWR</td><td>525-1042</td>; esterilizados en autoclave</tr><tr><td>HiLoad 26/600 Superdex 75 pg</td><td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td><td>28989334</td><td>HiLoad Las columnas preempaquetadas Superdex 75 pg son para cromatografía de exclusión por tamaño de alta resolución de proteínas recombinantes</td></tr><tr><td>Membrana de PLDF IMMUN-BLOT</td><td>BIO-RAD</td><td>#1620177</td><td>Las membranas de PVDF son membranas de transferencia de proteínas optimizadas para aplicaciones fluorescentes y fluorescentes multiplex.</td></tr><tr><td>Mini celda de transferencia electroforética Trans-Blot</td><td>BIO-RAD</td><td>#1703930</td><td>Utilice la Mini Celda Trans-Blot para el secado rápido de geles prefabricados y fundidos a mano Mini-PROTEAN.</td></tr><tr><td>Célula de electroforesis vertical Mini-PROTEAN Tetra para mini geles prefabricados</td><td>BIO-RAD</td><td>#1658004</td><td>sistema de electroforesis vertical de 4 geles, incluye conjunto de electrodos, módulo de funcionamiento complementario, tanque, tapa con cables de alimentación, presa de almacenamiento intermedio de mini celda.</td></tr><tr><td>Las columnas Mono Q 10/100 GL</td><td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td><td>17516701</td><td>Las columnas Mono Q son columnas de cromatografía de intercambio aniónico fuerte para el análisis de proteínas o el pulido de proteínas a pequeña escala y alta resolución.</td></tr><tr><td>Las columnas Mono S 10/100 GL</td><td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td><td>17516901</td><td>Las columnas Mono S son columnas de cromatografía de intercambio catiónico fuerte para el análisis de proteínas o el pulido de proteínas a pequeña escala y alta resolución.</td></tr><tr><td>PageRuler Escalera de proteínas preteñida, de 10 a 180 kDa</td><td>Thermo-Fischer</td><td>26616</td><td>Una mezcla de 10 proteínas teñidas de azul, naranja y verde (de 10 a 180 kDa) para su uso como estándares de tamaño en electroforesis de proteínas (SDS-PAGE) y Western blot.</td></tr><tr><td>Kit de ensayo de proteínas BCA de Pierce</td><td>Thermo-Fischer</td><td>23225</td><td>Un ensayo de proteínas de dos componentes, de alta precisión y compatible con detergentes para la determinación de la concentración de proteínas.</td></tr><tr><td>Sonda 250; Disruptor celular ultrasónico con convertidor</td><td></td> <td>Branson-Nuevos</td> <td>modelos en https://www.emerson.com/documents/automation/brochure-sonifier-sfx250-sfx550-cell-disruptors-homogenizers-branson-en-us-168180.pdf</td></tr><tr><td>Inmunoglobulinas anti-conejo porcina/HRP (aislado por afinidad)</td><td>Agilent Dako</td><td>P0399</td><td>El anticuerpo utilizado para la conjugación de la peroxidasa de rábano picante reacciona con inmunoglobulinas de conejo de todas las clases.</td></tr><tr><td>TEMED, 1,2-Bis(dimetilamino)etano, TMEDA</td><td>MERCK</td><td>T9281</td><td>TEMED (N,N,N&prime;,N&prime;-Tetrametiletilendiamina) es una molécula que permite la polimerización rápida de geles de poliacrilamida.</td></tr><tr><td>Rodillo de tubo</td><td>:</td><td></td> <td>un rodillo rotador de tubo general; por ejemplo, un nuevo modelo en https://labstac.com/de/Mixer/Roller/c/71</td></tr><tr><td>Rotador de tubo</td><td>:</td><td></td> <td>una rueda rotadora de tubo general; por ejemplo, un nuevo modelo en</td></tr><tr><td>https://labstac.com/de/Tube-Roller/p/MT123 ULTRA-TURRAX; T 25 digital</td><td>IKA</td><td>0003725000</td><td>Nuevos modelos en https://www.ika.com/de/Produkte-Lab-Eq/Dispergierer-Dipergiergeraet-Homogenisierer-Homogenisator-csp-177/T-25-digital-ULTRA-TURRAX-cpdt-3725000/</td></tr></tbody></table>

extracción y purificación de la proteína fahd1 del riñón porcino y el hígado de ratón

Extraction and Purification of FAHD1 Protein from Swine Kidney and Mouse Liver

La proteína 1 que contiene el dominio de la fumarilacetoacetato hidrolasa (FAHD1) es el primer miembro identificado de la superfamilia FAH en eucariotas, actuando como oxaloacetato descarboxilasa en las mitocondrias. Este artículo presenta una serie de métodos para la extracción y purificación de FAHD1 a partir de riñón porcino e hígado de ratón. Los métodos cubiertos son la cromatografía de intercambio iónico con cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC), la filtración en gel preparativa y analítica con FPLC y los enfoques proteómicos. Después de la extracción total de proteínas, se exploró la precipitación de sulfato de amonio y la cromatografía de intercambio iónico, y se extrajo FAHD1 a través de una estrategia secuencial utilizando intercambio iónico y cromatografía de exclusión de tamaño. Este enfoque representativo puede adaptarse a otras proteínas de interés (expresadas a niveles significativos) y modificarse para otros tejidos. La proteína purificada del tejido puede apoyar el desarrollo de anticuerpos de alta calidad y/o inhibidores farmacológicos potentes y específicos.

La proteína FAHD1 se extrajo del riñón porcino y del hígado de ratón utilizando el protocolo presentado. Para el tejido de ratón, se requieren múltiples órganos para obtener varios μg después de la etapa final de purificación. Por esta razón, este artículo se centra en la extracción de FAHD1 de los riñones porcinos, que es un experimento mucho más ejemplar. La extracción de FAHD1 del hígado de ratón se realiza para presentar las dificultades y posibles escollos de este protocolo. En general, se recomienda utilizar órgano...

Este protocolo describe cómo extraer la proteína 1 que contiene el dominio fumarilacetato hidrolasa (FAHD1) del riñón porcino y el hígado de ratón. Los métodos enumerados pueden adaptarse a otras proteínas de interés y modificarse para otros tejidos.

Extracción y purificación de la proteína FAHD1 del riñón porcino y el hígado de ratón

Fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing protein 1 (FAHD1) is the first identified member of the FAH superfamily in eukaryotes, acting as ...

La purificación de proteínas recombinantes de bacterias es un método bien establecido. Sin embargo, pueden ocurrir varios problemas al usar estas técnicas. Tener métodos para extraer proteínas de los tejidos es ciertamente atractivo.La principal ventaja de este método es que se puede extraer la proteína en su forma fisiológica, incluidos todos los efectos mutuos que pueden afectar su plegamiento y actividad catalítica. Este enfoque puede adaptarse a otras proteínas de interés y modificarse para otros tejidos. La proteína purificada del tejido puede apoyar el desarrollo de anticuerpos de alta calidad e inhibidores farmacológicos.Para comenzar, prepare el tampón de lisis de proteínas mezclando 250 mililitros de PBS con fluoruro de sodio 50 milimolar, un fluoruro de fenilmetilsulfonilo milimolar, dos microgramos por mililitro de aprotinina y un ortovanadato activado milimolar. Filtre la solución con una unidad de filtro de jeringa de 0,22 micrómetros. Prepare tubos con dos mililitros de tampón de lisis por gramo de tejido y colóquelos sobre hielo.Para preparar la muestra de tejido, diseccione el tejido de aproximadamente 100 miligramos cada uno en una placa de vidrio prelimpiada colocada sobre hielo en una caja de espuma de poliestireno. Transfiera las piezas de tejido a los tubos preparados para la lisis posterior. Para preparar una solución saturada de sulfato de amonio, caliente 500 mililitros de agua destilada doble a 70 grados centígrados.Mientras se agita, agregue gradualmente polvo de sulfato de amonio hasta que no se disuelva más sulfato de amonio. Enfríe esta solución saturada a temperatura ambiente y guárdela a cuatro grados centígrados durante la noche. Para homogeneizar los tejidos renales porcinos, sonice la suspensión preferiblemente mediante una sonda ultrasónica mientras mantiene la muestra en hielo.En el caso de los tejidos hepáticos de ratón, use un homogeneizador eléctrico y lávelo regularmente en PBS para evitar la obstrucción mientras mantiene las muestras en hielo. Saque 20 microlitros de las muestras y compruebe bajo el microscopio si las células del tejido homogeneizado se destruyen correctamente. De lo contrario, repita la homogeneización.Centrifugar los tubos a 10.000 veces G durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Recoge el sobrenadante en un tubo fresco y colócalo sobre hielo. Posteriormente, filtre el sobrenadante utilizando unidades de filtro de jeringa de 0,45 micrómetros y 0,22 micrómetros.Alícuota el sobrenadante en lotes de 10 mililitros y congélelos a menos 20 grados Celsius para almacenamiento a corto plazo o a menos 80 grados Celsius para un almacenamiento más largo. Prepare una muestra de 50 microlitros para el análisis SDS-PAGE o Western blot agregando 10 microlitros de cinco veces el tampón de muestra SDS a 40 microlitros del sobrenadante y luego hirviendo a 95 grados Celsius durante 10 minutos. Prepare un gel discontinuo de poliacrilamida SDS-PAGE al 12,5% de acuerdo con las instrucciones del fabricante.Para realizar el análisis SDS-PAGE, cargue los pocillos del gel posteriormente con una escalera de marcadores de proteínas, cinco nanogramos de proteína recombinante FAHD1 humana como control positivo, 20 microlitros de la muestra a analizar y los pozos restantes con 20 microlitros de tampón de muestra SDS-PAGE preparado. Ejecute los geles SDS-PAGE a 125 voltios utilizando el búfer de ejecución SDS. Una vez que se complete SDS-PAGE, realice un análisis de Western blot, sondee las membranas utilizando el anticuerpo disponible contra FAHD1.Después de preparar las alícuotas sobrenadantes como se describió anteriormente, procese después de la descongelación o procese directamente después de la extracción de proteínas sin congelar la muestra. Filtre la muestra utilizando una unidad de filtro de 0,22 micrómetros para excluir posibles precipitados después de la descongelación. Prepare seis tubos de 1,5 mililitros sobre hielo, luego transfiera 250 microlitros de muestra a cada tubo.Prepare una serie de dilución de sulfato de amonio en los tubos preparados y componga el volumen final a 1, 000 microlitros con tampón de lisis de proteínas. Incubar las muestras a cuatro grados centígrados durante la noche en un rotador de tubo. Usando una centrífuga de mesa, centrífuga a 10, 000 veces G durante 30 minutos a cuatro grados Celsius y transfiera cuidadosamente todos los sobrenadantes en tubos separados.Seque al aire los gránulos resultantes y vuelva a gastar cada uno de ellos en 1.000 microlitros de agua destilada doble. Para cada par de pellets y sobrenadantes resuspendidos del paso anterior, mezcle 40 microlitros con 10 microlitros de cinco veces el tampón de muestra SDS y hierva a 95 grados Celsius con tapas abiertas hasta que la mayor parte del líquido se haya vaporizado. Luego vuelva a suspender el pellet en una mezcla de 50% de dimetilsulfóxido en agua destilada doble.Realice SDS-PAGE cargando las muestras derivadas de los pellets resuspendidos y sobrenadante en pares, seguido de un análisis de Western blot. Sin embargo, haga funcionar los geles a 80 voltios durante tres horas. Configure el sistema FPLC con la columna de intercambio aniónico o catiónico.Lave la columna con cinco volúmenes de columna de etanol al 20% en agua destilada doble, seguido de cinco volúmenes de columna de agua destilada doble. Aplique la muestra sobre la columna, ya sea por inyección o mediante el uso de una bomba de muestra y recoja el flujo. Lave la columna con un volumen de columna del tampón de sal baja.Configure una elución de gradiente lineal de tampón de sal 100% bajo a tampón de sal 100% alto dentro de tres volúmenes de columna. Recoja continuamente fracciones de un mililitro. Una vez finalizado el gradiente, continúe funcionando con un tampón de sal alto hasta que no se detecten más picos asociados a proteínas en el cromatograma en el rango de un volumen de columna.Aplique un mililitro de SDS al 25% disuelto en hidróxido de sodio molar 0.5 y agua destilada doble para limpiar la columna. Lave consecutivamente la columna con tres volúmenes de columna de agua destilada doble y tres volúmenes de columna de etanol al 20% en agua destilada doble. Recopile las muestras SDS-PAGE de todas las fracciones máximas y el flujo continuo.Congele las fracciones recolectadas en nitrógeno líquido y guárdelas a menos 80 grados centígrados. Después de sondearlos a través de Western blot, descongelar y agrupar las fracciones que contienen las proteínas de interés y desechar las demás. Para realizar el paso de purificación, reduzca el volumen de la solución de proteína a dos mililitros utilizando unidades de filtro de ultra centrifugación.Filtre secuencialmente la solución con unidades de filtro de jeringa de 0,45 micrómetros y 0,22 micrómetros para eliminar cualquier microprecipitación. Equilibre la columna de cromatografía de exclusión de tamaño con un volumen de columna de tampón en ejecución que contenga un ditiotreitol milimolar. Cargue la muestra en la columna y ejecute la unidad de cromatografía hasta que todas las proteínas se eluyan como se describió anteriormente.Preparar 50 muestras de microlitros para el análisis SDS-PAGE y Western blot descrito anteriormente. Lave consecutivamente la columna con una columna de volumen de agua destilada doble y una columna de volumen de etanol al 20% en agua destilada doble. Después de realizar el análisis de Western blot, agrupe todas las fracciones que contienen FAHD1.Reduzca el volumen de la solución proteica a dos mililitros utilizando unidades de filtro de ultra centrifugación. El cribado de Western blot muestra la presencia de FAHD1 porcino en el sobrenadante con una banda a 25 kilodaltons mientras que el control positivo marcado corre a 34 kilodaltons. El FAHD1 porcino del lisado se purificó mediante cromatografía de intercambio aniónico y las proteínas de unión se eliminaron por elución.Las fracciones que contenían FAHD1 porcino se identificaron mediante análisis de Western blot, agrupadas y concentradas. Las muestras de proteínas fueron purificadas por sec e identificadas por el análisis de Western blot. El rendimiento de la proteína FAHD1 porcina fue de aproximadamente un miligramo con un nivel de pureza del 80%.El análisis de Western blot detectó la proteína FAHD1 del ratón en el flujo a través junto con otras proteínas. El flujo a través se aplicó para la cromatografía de exclusión de tamaño. Las fracciones que contenían FAHD1 se agruparon, concentraron y aplicaron al análisis SDS-PAGE.Sin embargo, el rendimiento de proteína no fue muy alto. La actividad enzimática específica de la FAHD1 porcina aumenta con el nivel de pureza al aumentar la cantidad relativa de FAHD1 por proteína total. Las concentraciones más altas de sulfato de amonio causan el efecto sonrisa, que se puede resolver a un voltaje más bajo.Se encontró proteína adicional en el lisado y el sobrenadante a una concentración del 15%. Sin embargo, a concentraciones más altas, las muestras pueden precipitar y no pueden ser detectadas. El protocolo presentado aquí requiere que la proteína sea solucionable.Las condiciones óptimas para la precipitación y el pH o el ajuste de tamaño para la cromatografía deben probarse y definirse. El estudio de la función enzimática, la investigación de la estructura de las proteínas y el desarrollo de anticuerpos se apoyan en gran medida cuando se extrae proteína del tejido en lugar de extraerse de las bacterias.

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Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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