Name: Sistema microfisiológico hepático humano para evaluar la toxicidad hepática inducida por fármacos in vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Aprende a evaluar la toxicidad hepática inducida por fármacos utilizando un sistema microfisiológico hepático humano in vitro. Este método mantiene microtejidos funcionales hasta cuatro semanas para predecir DILI con mayor precisión que cultivos 2D.

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CN Bio Innovations Ltd. financió este estudio.

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Todos los autores son empleados de CN Bio Innovations Limited.

Los MPS están diseñados para recapitular unidades funcionales de órganos humanos in vitro y han sido desarrollados para abordar las limitaciones de los modelos convencionales de cultivo celular 3D27. El hígado es uno de los órganos más modelados que utilizan MPS, y se ha desarrollado una amplia variedad de sistemas. El hígado humano es responsable del metabolismo de los fármacos y de la generación de metabolitos tóxicos de los fármacos, y su función es un elemento clave para modelar el desarrollo de fármacos, incluyendo la evaluación de la responsabilidad DILI de los compuestos28. Aquí hemos introducido un nuevo método para evaluar DILI utilizando un MPS hepático; el protocolo permite buscar conocimientos mecanicistas para cada compuesto ensayado para determinar cómo puede causar DILI, además de ser un ensayo altamente sensible y robusto. Los microtejidos hepáticos se forman en las placas MPS, que son un cocultivo de PHH y HKCs y son altamente funcionales con altos niveles de producción de albúmina y urea, así como alta actividad de CYP3A4 en comparación con los modelos hepáticos in vitro estándar20.
Aunque el modelo DILI descrito aquí puede servir como una herramienta útil en etapas posteriores de las pruebas preclínicas en el proceso de desarrollo de fármacos, también tiene varias limitaciones. Como la mayoría de MPS actualmente disponibles en el mercado, es una plataforma de bajo rendimiento y, por lo tanto, más difícil de usar para actividades de detección de drogas a gran escala. Al consistir en microtejidos formados por el cocultivo de PHH y HKC, el modelo DILI tampoco puede capturar completamente la complejidad del hígado humano, y una mayor optimización mediante la incorporación de diferentes tipos de células (por ejemplo, células inmunes) sería beneficiosa para agregar valor al modelo existente. Este MPS de un solo órgano también podría combinarse con otras plataformas de órganos que pueden compartir un medio común y permitir la diafonía de órganos a nivel celular o endocrino, y que pueden ayudar a comprender mejor los conocimientos mecanicistas de la toxicidad que no se limitan solo al hígado mismo. Además, como cualquier tecnología relativamente nueva, podría considerarse costosa y, por lo tanto, de accesibilidad limitada.
MPS es una plataforma utilizada para desarrollar modelos organotípicos de tejidos humanos individuales o múltiples. El sistema está compuesto por un controlador, un cable umbilical y un controlador MPS en el que se inserta la placa (Figura 5A). Cada placa MPS hepática tiene 12 pocillos abiertos independientes para cultivar células hepáticas primarias en 3D en andamios diseñados. En resumen, el sistema se verifica con control de calidad, y las placas se impriman en el día -1, los PHH y HKC se siembran en las placas en el día cero (Figura 5B, ver 1). Las microbombas integradas facilitan la circulación de los medios de cultivo celular a través de los andamios para facilitar la formación de microtejidos 3D (Figura 5B, ver 2). Los microtejidos formados se QC en el día 4, se dosifican con diferentes concentraciones de cada compuesto cada 48 h durante 4 días y se analizan para biomarcadores de punto final en el día 8 (Figura 5C). La línea de tiempo experimental del ensayo DILI en la placa MPS se representa en la Figura 5D.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63389/63389fig05.jpg"> Figura 5: El sistema microfisiológico y la línea de tiempo experimental de un ensayo DILI estándar. (A) El sistema microfisiológico con sus componentes: controlador (1), cable umbilical (2), estación de acoplamiento (3), controlador MPS (4) y placa LC12 (5). (B) La siembra de PHH y HKC en la placa LC12 en el Día 1 (1) y las microbombas integradas facilitan la circulación de medios de cultivo celular con caudales sintonizables a través de los microtejidos 3D sembrados en los andamios (2). (C) Derribar los andamios al final del estudio. (D) Cronología experimental. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63389/63389fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Al realizar el protocolo, es importante que se realice una verificación de control de calidad robusta del sistema antes de comenzar, verificando que el sistema funcione neumáticamente correctamente y que las placas consumibles se inspeccionen visualmente y se imprimen de manera eficiente para garantizar una funcionalidad uniforme en todos los pozos. Tener células humanas primarias de alta calidad es esencial para este protocolo, ya que se sabe que los hepatocitos se adhieren constantemente en experimentos de cultivo celular y forman interacciones 3D. La descongelación de estas células también es un paso crítico, ya que los hepatocitos primarios no deben resuspenderse mediante la acción del pipeteo, ya que esto puede conducir rápidamente a la muerte celular. Tener una viabilidad celular superior al 85% es fundamental para una siembra exitosa, ya que grandes cantidades de desechos celulares interferirán con la formación de microtejidos 3D. El control de calidad de los microtejidos hepáticos formados en el día 4 también es importante, y el usuario debe asegurarse de que se midan los niveles aceptables de LDH y urea, ya que los parámetros fuera de rango pueden ser indicativos de la formación de tejido de mala calidad y permitir una resolución directa de problemas. Finalmente, la hidrocortisona utilizada en los medios de cultivo celular debe prepararse fresca el día de su uso para evitar cualquier degradación no deseada que pueda afectar la funcionalidad del cultivo celular, ya que es necesaria para mantener la funcionalidad metabólica de los hepatocitos.
A pesar de tener una complejidad significativa, el MPS hepático no contiene todos los tipos de células del hígado humano. Es posible agregar más tipos de células al modelo24,29 para aumentar la relevancia fisiológica, pero estas solo deben agregarse con una justificación clara para el contexto de uso. Para el estudio de DILI PHH son el tipo de célula clave, y la incorporación de HKCs en este modelo permite determinar algunas respuestas inmunológicas. También debe tenerse en cuenta que los PHH aislados de hígados humanos y los PHH criopreservados disponibles comercialmente tienden a demostrar algunas variaciones de un lote a otro. Hemos demostrado aquí que este protocolo produce resultados reproducibles cuando se utiliza con preparaciones de células de alta calidad. Sin embargo, se esperaría alguna variación de lote-lote, y esto podría superarse aún más mediante el uso de lotes agrupados de donantes múltiples. Estas limitaciones podrían ser superadas mediante el uso de células similares a los hepatocitos diferenciadas de iPSC que recapitulan muchas propiedades funcionales de los PHH y que han sido utilizadas en el proceso de desarrollo de fármacos30. Los HKC también muestran mucha variabilidad y un alto nivel de activación al descongelarse; por lo tanto, los donantes de HKC se validan previamente internamente antes de su uso en cultivo celular experimental (cocultivo con PHH validados) y deben tener bajos niveles de activación posterior al deshielo; esto se evalúa midiendo los biomarcadores IL-6 y TNF-alfa (ver Material Suplementario).
Los datos presentados aquí confirman que el ensayo puede detectar DILI con precisión, ayudando a identificar hepatotóxicos que podrían no ser detectados por 2D10,11 e incluso algunos modelos 3D. Los datos generados a partir de MPS todavía no son utilizados como estándar por la industria farmacéutica para presentaciones regulatorias o fines de detección de medicamentos debido a la falta de estandarización y armonización de procesos, incluida la reproducibilidad entre sitios20. Los datos y los enfoques experimentales demostrados aquí abordan esto, mostrando que el modelo hepático se puede usar de forma rutinaria y robusta en las pantallas DILI para predecir con precisión la responsabilidad de los nuevos compuestos.
Al medir una serie de criterios de valoración para producir una "firma de hepatotoxicidad", ayudando a identificar compuestos con diferentes niveles de preocupación DILI (incluidos compuestos no detectables por otros métodos in vitro) y sus mecanismos de toxicidad revelados. Esta tecnología puede cerrar la brecha entre el cultivo celular tradicional y los modelos animales por un lado y los ensayos clínicos en humanos, avanzando hacia la simulación de las condiciones biológicas humanas para la evaluación preclínica de la toxicidad hepática como parte del proceso de desarrollo de fármacos.

DILI sigue siendo la causa más común de insuficiencia hepática aguda en los EE.UU. y Europa y es una de las principales causas de desgaste de compuestos en el proceso de desarrollo de fármacos1. Casi todas las clases de medicamentos pueden causar hepatotoxicidad, siendo los agentes del sistema nervioso central y los antibióticos los tratamientos más comunes que causan DILI en pacientes2. La hepatotoxicidad inducida por fármacos es causada por una compleja interacción de factores genéticos, no genéticos y ambientales, que conduce a la muerte de los hepatocitos y otros tipos de células hepáticas, incluidos los colangiocitos y las células endoteliales 1,3.
Los agentes causantes de DILI se pueden clasificar de dos maneras: aquellos que causan daño hepático predecible dependiente de la dosis o aquellos que causan DILI idiosincrásico que es raro y se desarrolla independientemente de la dosis del fármaco, o la vía, o la duración de la administración, pero es responsable de hasta una sexta parte de todas las fallas hepáticas agudas en los EE.UU. sólo4. Desafortunadamente, DILI a menudo no se detecta hasta que los medicamentos han alcanzado las etapas clínicas del proceso de desarrollo del fármaco. El rango de lesión hepática inducida por fármacos (o DILIrank) consiste en más de mil medicamentos aprobados por la FDA que se dividen en cuatro clases de acuerdo con su potencial para causar DILI, y su uso en pacientes debe ser monitoreado de cerca5.
El estudio de los mecanismos de hepatotoxicidad del fármaco sigue siendo muy difícil y, por lo tanto, se han desarrollado muchos modelos preclínicos para explorar los mecanismos del DILI. Los modelos actuales in vitro e in vivo utilizados para predecir DILI en el desarrollo preclínico tienen varias limitaciones para proporcionar información sobre las interacciones complejas y multifacéticas en un cuerpo humano vivo. Las líneas celulares hepáticas cancerosas (es decir, HepG2, HepaRG) cultivadas en 2D todavía se utilizan en las primeras etapas del desarrollo de fármacos para evaluar la toxicidad de los compuestos candidatos6. Aun así, estas líneas celulares provienen de donantes individuales y muestran niveles anormales de función hepática, y no siempre presentan una alta sensibilidad para la detección de DILI 7,8. Como alternativa a las líneas celulares hepáticas cancerosas, los PHH representan mejor la fisiología del hígado humano si se cultivan adecuadamente in vitro, aunque existen varias limitaciones con su cultivo, como el corto tiempo de incubación con medicamentos, la vida relativamente corta, la pérdida de la expresión génica hepática y los cambios en las funciones metabólicas de los fármacos 9,10,11 . Los PHH se pueden cultivar en proteínas de la matriz extracelular en placas de cultivo celular 2D estándar, pero como inconveniente, la rápida disminución de su función significa que tienen baja sensibilidad (<50%) para la predicción DILI12.
Por otro lado, las pruebas en modelos animales son lentas, costosas y necesitan una traducción entre especies para extrapolar la predicción a los humanos. La mayoría de los medicamentos recientemente desarrollados no logran obtener aprobación, lo que hace que este proceso sea costoso y arriesgado5. Además, para probar nuevas modalidades específicas para humanos, los modelos animales son menos adecuados debido a la secuencia de genes o las diferencias de respuesta inmunológica en comparación con los humanos13.
En consecuencia, el interés en modelos hepáticos in vitro tridimensionales (3D) más avanzados ha crecido exponencialmente. El cultivo de PHH como estructuras esferoidales generadas por agregación gravitacional en gotas colgantes o en superficies de fijación ultra bajas representa un método de alto rendimiento para evaluar pasivos compuestos14. Los esferoides de PHH se han utilizado para evaluar DILI en un fondo enfermo (por ejemplo, esteatosis y colestasis)15. Se ha desarrollado una amplia variedad de modelos para incluir cocultivos micropatronados en placas de hepatocitos con fibroblastos estromales16, tejidos hepáticos bioimpresos en 3D 17, cultivos esferoides 3D con o sin células hepáticas no parenquimatosas15. Sin embargo, todos estos métodos todavía tienen inconvenientes, y el cultivo de PHH en un microambiente fisiológicamente más relevante podría proporcionarles niveles más altos de funcionalidad durante largos períodos de tiempo para permitir la investigación de la exposición prolongada a posibles hepatotóxicos. Además, para mejorar la relevancia traslacional de cualquier cultivo avanzado de PHH in vitro, se deben utilizar criterios de valoración funcionales clínicamente relevantes o biomarcadores de salida de toxicidad para permitir que los datos se comparen in vivo o en escenarios clínicos18.
En este estudio, evaluamos si un MPS, también conocido como modelo hepático in vitro de Organ-on-a-Chip (OOC), podría usarse para comprender los aspectos mecanicistas detallados de la toxicidad hepática. Se ha demostrado previamente que el MPS mantiene microtejidos hepáticos 3D altamente funcionales, bajo flujo, hasta por 4 semanas19. El sistema ha sido probado recientemente por la FDA y ha demostrado tener una alta reproducibilidad al realizar toxicidad de medicamentos, metabolismo y acumulación intracelular20. Además, en comparación con los esferoides y los cultivos sándwich, el sistema tuvo una función más estable y una mayor sensibilidad en la detección de la toxicidad de varios fármacos20. Hasta la fecha, el MPS se ha utilizado en una amplia gama de aplicaciones que cubren ADME21, modelado de enfermedades (VHB22, NAFLD 23,24,25) e interacciones farmacológicas 26, lo que lo hace potencialmente muy adecuado para evaluar el DILI agudo y crónico. La tecnología aquí presentada ofrece una alternativa para cerrar la brecha entre los cultivos celulares más tradicionales y los modelos animales y los ensayos clínicos en humanos, avanzando hacia la simulación de las condiciones biológicas humanas para apoyar la evaluación de la toxicidad hepática de los compuestos candidatos en las etapas preclínicas del proceso de desarrollo de fármacos.

<table><tbody><tr><td>24 pocillos Placas de conglomerado de cultivo celular de fondo plano</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>96 placas de ensayo transparentes de pocillos, fondo plano</td><td>plástico transparente Greiner</td><td>655101</td><td></td></tr><tr><td>96 placas de pocillos negro fondo plano</td><td>Corning</td><td>3915</td><td></td></tr><tr><td>96 pocillos Placa de fondo blanco/transparente, TC Surface</td><td>ThermoScientific</td><td>165306</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM (1x)</td><td>Gibco</td><td>12491015</td><td>Medios de cultivo celular.</td></tr><tr><td>AssayMax Albumin ELISA Kit</td><td>AssayPro</td><td>EA3201-1</td><td>Dilución 1:250. Punto de tiempo Día 4, 6 y 8.</td></tr><tr><td>Cóctel de mantenimiento celular B, (suplementos de mantenimiento de hepatocitos primarios)</td><td>Gibco</td><td>CM4000</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay</td><td>Promega</td><td>G9682</td><td>Dilución 1:1. Punto de tiempo Día 8.</td></tr><tr><td>Clorpromazina HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8138</td><td></td></tr><tr><td>Tapas azules de Chromacol, 9 mm Muestreador automático Vial de rosca Tapas de rosca ThermoScientific</td><td></td><td>9-SCK(B)-ST1</td><td></td></tr><tr><td>vial de vidrio Viales de Chromacol, 9 mm Vidrio transparente Viales de rosca de tornillo</td><td>ThermoScientific</td><td>2-SVW</td><td></td></tr><tr><td>Clase 2 Cabinas de seguridad microbiológica - Trimat2 1500 Soluciones</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>de aire contenido de escapeTubos cónicos 50 mL</td><td>Greiner</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Medio de recuperación de hepatocitos criopreservados (CHRM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Gibco CM7000</td><td></td></tr><tr><td>Hepatocitos humanos primarios criopreservados</td><td>BioIVT Europe</td><td>Lot. RAS</td><td></td></tr><tr><td>CytoTox 96 Kit de ensayo de citotoxicidad (LDH) Promega</td><td></td><td>G1781</td><td>Dilución - ninguno. Punto de tiempo Día 4, 6 y 8</td></tr><tr><td>>El modelo de análisis de datos utilizado para generar el gráfico y las curvas EC:50 fue la regresión no lineal (ajuste de la curva) sigmoidal asimétrica, 5PL, donde X es log(concentración</td><td>GraphPad Prism 9</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Unidades de filtro PES desechables 500mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>15913307</td><td></td></tr><tr><td>Cuencas de pipetas desechables 50ml</td><td>Fisher Scientific 12369175</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO (Dimetilsulfóxido)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Sigma D2650</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeco' s Solución salina tamponada con fosfato sin Ca2+ y Mg2+ (D-PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos de centrífuga de polipropileno de fácil lectura 15 mL</td><td></td><td>Suero</td> bovino fetal 11889640 <td></td>Fisher Scientific</tr><tr><td></td><td>Gibco</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Human ALT ELISA Kit</td><td>Abcam</td><td>&nbsp; ab 234578</td><td>Dilución 1:5. Punto de tiempo Día 6 y 8.</td></tr><tr><td>Células de Kupffer humanas criopreservadas</td><td>Lonza Europe</td><td>Lote. 190088KC</td><td></td></tr><tr><td>hidrocortisona</td><td>Merck</td><td>H0888-1G</td><td></td></tr><tr><td>Modelos de incubadoras: New Brunswick&nbsp; Galaxy 170 S, Nuevo Brunswick &nbsp; Galaxy 170 R y CellXpert&reg; C170.</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Todos los servicios se realizan anualmente; documentación disponible a pedido.</td></tr><tr><td>Microscopio invertido</td><td>Leica DMIL LED</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MPS conocido como Organ-on-a-Chip (OOC)</td><td>CN Bio Innovations Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa MPS LC-12</td><td>CN Bio Innovations Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemocitómetro desechable C-Chip mejorado de Neubauer (2 canales)</td><td>Cambridge Bioscience</td><td>DHC-N01-50</td><td></td></tr><tr><td>P450-Glo CYP3A4 Sistema de ensayo y cribado</td><td>Promega</td><td>V9002</td><td>Dilución - ninguno. Punto de tiempo Día 8</td></tr><tr><td>Plataforma PhysioMimix MPS</td><td>CN Bio Innovations Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pioglitazona</td><td>MedChemExpress Tocris</td><td>HY-13956/CS-1700</td><td></td></tr><tr><td>Quantichrom Urea Kit de ensayo &ndash; Sistemas de bioensayo</td> Sistemas de <td>bioensayo</td><td>DY970-05</td><td>Dilución 1:2 si la lectura inicial es demasiado alta. Punto de tiempo Día 4, 6 y 8.</td></tr><tr><td>Gel de sílice</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7625</td><td></td></tr><tr><td>El software utilizado para analizar y generar todos los gráficos fue</td><td>GraphPad Prisma 9</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stripettes 10 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>11839660</td><td></td></tr><tr><td>Stripettes 25 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>11839181</td><td></td></tr><tr><td>Placa de descongelación Cocktail A, (Suplementos primarios de descongelación y recubrimiento de hepatocitos)</td><td>Gibco</td><td>CM3000</td><td></td></tr><tr><td>Troglitazona</td><td>MedChemExpress Tocris</td><td>97322-87-7</td><td></td></tr><tr><td>Solución de Azul de Tripano, 0.4%</td><td>Gibco</td><td></td> 15250061 <td></td></tr><tr><td>Tubos 1.5 mL</td><td>Greiner</td><td></td> 616201 <td></td></tr><tr><td>Balanza de pesaje - modelo PA214C y AV213C</td><td>Ohaus Corp</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

sistema microfisiológico hepático humano para evaluar la toxicidad hepática inducida por fármacos in vitro

Human Liver Microphysiological System for Assessing Drug-Induced Liver Toxicity In Vitro

DILI es una causa importante de desgaste en el desarrollo de medicamentos con más de 1000 medicamentos aprobados por la FDA que se sabe que potencialmente causan DILI en humanos. Desafortunadamente, DILI a menudo no se detecta hasta que los medicamentos han alcanzado etapas clínicas, poniendo en riesgo la seguridad de los pacientes y provocando pérdidas sustanciales para la industria farmacéutica. Teniendo en cuenta que los modelos 2D estándar tienen limitaciones en la detección de DILI es esencial desarrollar modelos in vitro que sean más predictivos para mejorar la traducibilidad de los datos. Para comprender la causalidad y los aspectos mecanicistas de DILI en detalle, se ha desarrollado un MPS hepático humano que consiste en células hepáticas primarias del parénquima y no parénquima (NPC) del hígado humano y cultivadas en microtejidos 3D en un andamio diseñado bajo perfusión. Los hepatocitos humanos primarios criopreservados (PHH) y las células de Kupffer (HKC) se cocultivaron como microtejidos en la plataforma MPS durante un máximo de dos semanas, y cada compuesto de interés se dosificó repetidamente en microtejidos hepáticos a siete concentraciones de prueba durante un máximo de cuatro días. Se analizaron los criterios de valoración funcionales específicos del hígado (incluidos los biomarcadores clínicos como la alanina aminotransferasa, la ALT) para evaluar la función hepática. La exposición aguda y crónica a compuestos de diversas gravedades DILI se puede evaluar comparando las respuestas a microtejidos de dosis únicas y múltiples. La metodología ha sido validada con un amplio conjunto de compuestos graves y levemente hepatotóxicos. Aquí mostramos los datos de pioglitazona y troglitazona, conocidos compuestos hepatotóxicos retirados del mercado por causar fallas hepáticas. En general, se ha demostrado que el modelo de MPS hepático puede ser una herramienta útil para evaluar el DILI y su asociación con cambios en la función hepática. El modelo también se puede utilizar para evaluar cómo se comportan los nuevos compuestos en distintos subconjuntos de pacientes y cómo los perfiles de toxicidad pueden verse afectados por los estados de enfermedad hepática (por ejemplo, hepatitis viral, enfermedad del hígado graso).

El manuscrito describe un modelo de MPS hepático utilizado para evaluar DILI. El MPS facilita la generación de microtejidos hepáticos 3D que se mantienen altamente funcionales bajo flujo durante un máximo de 4 semanas. Los PHH/HKC se siembran en andamios recubiertos de colágeno para formar microtejidos hepáticos que se perfunden con un medio de crecimiento y, después de pasar el control de calidad, se dosifican con compuestos. Aquí, mostramos datos para troglitazona y pioglitazona, dos compuestos estructuralmente similares pero con diferentes gravedades DILI.
En el día 4, antes de la dosificación del fármaco, se evalúa un control de calidad de los microtejidos hepáticos formados y consiste en la liberación de LDH y la síntesis de urea (Figura 1A). El QC tiene como objetivo confirmar que el MPS hepático produce microtejidos hepáticos altamente consistentes y funcionales. Los datos presentados aquí se generan a partir de tres experimentos y muestran buenos niveles de reproducibilidad con baja variabilidad intra e inter-estudio. Después de un cultivo de 8 días, se evalúan múltiples métricas hepáticas y de salud (albúmina, urea, CYP3A4, ATP) y los microtejidos de control muestran altos niveles de funcionalidad hepática y reproducibilidad (Figura 1B, C). La microscopía de fase de contraste y la tinción IF de los microtejidos hepáticos (Ver Material Suplementario) muestran una alta consistencia de siembra en todos los microcanales del andamio y revelan la distribución de HKC en los microtejidos PHH (Figura 1D)
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63389/63389fig01.jpg"> Figura 1: MPS hepático produce datos altamente reproducibles y microtejidos consistentes. (A) Métricas 3D de control de calidad de microtejidos hepáticos en el día 4 y evaluación de funcionalidad al final del estudio en el día 8 -(B) Albúmina y urea, (C) CY3A4 y ATP). Los datos se recopilan de 3 experimentos; En cada experimento, hubo 3 réplicas de control de vehículos. Los datos mostrados son Media ± DE, N = 9. (D) Microscopía de contraste de fase (10x y 20x) e IF de microtejidos hepáticos 3D generados por cocultivo de PHHs y HKCs en plataforma MPS hepática para evaluar DILI. Para visualizar los HKCs, antes de la siembra los HKCs fueron transducidos con un vector adenoviral que expresa eGFP (ver Material Suplementario). Se muestran fotomicrografías representativas. La transducción y la obtención de imágenes se realizaron como un experimento independiente para demostrar la localización celular y no se realizaron con el protocolo DILI descrito. Las células HKC se validan previamente internamente antes de su uso en cultivos celulares experimentales y deben tener bajos niveles de activación posterior al deshielo; esto se evalúa midiendo los biomarcadores IL-6 y TNF-alfa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63389/63389fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Se sabe que la troglitazona causa DILI grave; después de su licencia para el tratamiento de la diabetes tipo 2, fue retirado por la FDA después de 3 años en el mercado debido a la frecuencia de lesión hepática asociada con su uso. Hasta la fecha, los estudios publicados en animales no pudieron predecir el potencial de la troglitazona para causar lesión hepática grave. La toxicidad de este compuesto tampoco se detectó en ensayos hepáticos 2D estándar in vitro 14.
Los microtejidos hepáticos en el MPS se dosificaron con troglitazona durante 96 h, y causó una respuesta tóxica aguda, impulsada por C max, que se detectó por liberación de ALT y LDH y una rápida reducción en la producción de albúmina y urea, a alrededor de 15 x Cmax, después de la exposición aguda a troglitazona (Figura 2A). El criterio de valoración celular (contenido de ATP) y la actividad del CYP3A4 (para evaluar la biotransformación metabólica), muestreados después de 96 h de exposición, confirmaron además la toxicidad causada por troglitazona y los valores de EC:50 fueron muy comparables a otros criterios de valoración (Figura 2B). Las imágenes de microscopía de campo claro tomadas después de un cultivo de 8 días en el MPS revelan un microtejido hepático sano, sembrado uniformemente en todo el andamio (control del vehículo) en contraste con la muerte/degradación generalizada del tejido como se ve en las réplicas tratadas con control positivo y troglitazona en las dos concentraciones superiores de prueba (Figura 2C).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63389/63389fig02.jpg"> Figura 2: Determinación del riesgo DILI de troglitazona utilizando múltiples criterios de valoración hepatotóxicos. Los microtejidos hepáticos se expusieron a siete concentraciones de prueba de troglitazona durante 96 h y se compararon para (A) liberación de LDH, liberación de ALT, producción de albúmina, síntesis de urea, actividad de CYP3A4 y contenido de ATP. Líneas azules - 48 h de exposición (solo puntos finales de medios), líneas rojas - 96 h de exposición. El control positivo fue clorpromazina de 100 μM. Todos los criterios de valoración se miden a partir de los mismos cultivos de MPS hepáticos. Los datos mostrados son medias ± DE, N = 3. (B) Resumen de los números E:50 generados a partir de datos. N.D. = datos no trazables. Línea = no ensayado. (C) Microscopía representativa de campo claro de microtejidos hepáticos después de un cultivo de 8 días (aumento 10x). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63389/63389fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
También se investigó la toxicidad hepática tras la exposición a pioglitazona. La pioglitazona es un compuesto conocido por ser de bajo problema DILI4 y no ejerció hepatotoxicidad en cultivos clásicos de hepatocitos primarios 2D e incluso en algunos modelos 3D más avanzados10,11. Se observaron efectos hepatotóxicos leves en ambos puntos temporales probados (Figura 3). No se detectó ninguna liberación de LDH o ALT; sin embargo, después de 48 h, se observó una leve reducción en la producción de albúmina y urea, a aprox. 25x Cmax (Figura 3A). También se observó una reducción muy pequeña en el contenido de ATP a altas concentraciones de pioglitazona, pero esto no fue significativo. Los valores EC:50 generados a partir de curvas dosis-respuesta se presentan en la figura 3B. La microscopía reveló una ligera alteración microtisular después de 96 h de exposición a pioglitazona en las dos concentraciones más altas ensayadas (Figura 3C). Los resultados demuestran la capacidad del MPS hepático para detectar la toxicidad de compuestos con preocupación DILI leve.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63389/63389fig03.jpg"> Figura 3: Determinación del riesgo DILI de pioglitazona utilizando múltiples criterios de valoración hepatotóxicos. Los microtejidos hepáticos se expusieron a siete concentraciones de prueba de pioglitazona durante 96 h y se compararon para (A) liberación de LDH, liberación de ALT, producción de albúmina, síntesis de urea, actividad de CYP3A4 y contenido de ATP. Líneas azules - 48 h de exposición (solo puntos finales de medios), líneas rojas - 96 h de exposición. El control positivo fue clorpromazina de 100 μM. Todos los criterios de valoración se miden a partir de los mismos cultivos de MPS hepáticos. Los datos mostrados son medias ± DE, N = 3. B) Resumen de los números CE:50 generados a partir de datos. N.D. = datos no trazables. Línea = no ensayado. (C) Microscopía representativa de campo claro de microtejidos hepáticos después de un cultivo de 8 días (aumento 10x). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63389/63389fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Al evaluar todos los criterios de valoración funcionales y biomarcadores de producción de toxicidad que podrían representar escenarios in vivo o clínicos (liberación de LDH, síntesis de urea, producción de albúmina, actividad de CYP3A4, contenido de ATP, liberación de ALT) y corroborar los datos generados para ambos compuestos probados dosificados en un rango de dosis de siete puntos durante 48 h y 96 h, se ha generado un mapa de calor para obtener una "firma de hepatotoxicidad", ayudar a identificar compuestos con un nivel variable de preocupación DILI (Figura 4).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63389/63389fig04.jpg"> Figura 4: Determinación de la "firma de toxicidad" con MPS hepático. Mapa de calor que muestra troglitazona y pioglitazona de seis criterios de valoración funcionales específicos del hígado (liberación de LDH, síntesis de urea, producción de albúmina, liberación de ALT, actividad de CYP3A4 y contenido de ATP) después de una exposición de 48 h y 96 h a un rango de dosis de siete puntos. Cada valor se genera como Media, N = 3, y se normaliza para controlar las muestras. Los valores de las barras de color representan un aumento de pliegue sobre los controles de línea base. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63389/63389fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Material suplementario: Imágenes de microscopio fluorescente de microtejidos y evaluación previa de calificación de células. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63389/Supplementary%20Material-63389R1.docx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

La lesión hepática inducida por fármacos (DILI) es una causa importante de fracaso farmacológico. Se ha desarrollado un protocolo para predecir con precisión la responsabilidad DILI de un compuesto utilizando un sistema microfisiológico hepático (MPS). El modelo hepático utiliza el cocultivo de células hepáticas primarias y criterios de valoración traslacionalmente relevantes para evaluar las respuestas celulares al tratamiento.

Sistema microfisiológico hepático humano para evaluar la toxicidad hepática inducida por fármacos in vitro

DILI is a major cause of attrition in drug development with over 1000 FDA-approved drugs known to potentially cause DILI in humans. Unfortunately, DILI is ...

El protocolo describe cómo evaluar la lesión hepática inducida por fármacos in vitro utilizando un sistema microfisiológico que puede mantener microtejidos hepáticos altamente funcionales y metabólicamente activos durante un máximo de cuatro semanas. Este enfoque es un modelo de cultivo celular específico para humanos para detectar con precisión la responsabilidad de lesión hepática inducida por fármacos para nuevos compuestos, que es más predictivo que los cultivos 2D más simples o incluso los cultivos 3D más complejos. Esta técnica se puede utilizar como parte de una batería de pruebas de seguridad preclínicas para determinar si un compuesto es seguro para comenzar el desarrollo clínico.Se puede probar una amplia variedad de modalidades. Comience a configurar el sistema microfisiológico hepático conectando el controlador a la estación de acoplamiento en una incubadora de cultivo celular. Asegúrese de agregar desecante nuevo al frasco de desecante ubicado en la parte posterior del controlador.Después de encender el controlador presionando el interruptor basculante del barco, espere cinco minutos para que el sistema se estabilice y alcance la presión. Retire cada plato del embalaje. A continuación, prepare cada pocillo agregando 500 microlitros de medio DMEM avanzado de siembra precalentado al lado del depósito.Coloque el conductor en la estación de acoplamiento de la incubadora. Cuando haya terminado, seleccione el programa principal en la pantalla del controlador hasta que el fluido pase por los soportes del filtro. Para cubrir el canal de superficie, llene todos los pozos con 1.1 mililitros de medio DMEM avanzado de siembra.Después de colocar los controladores con placas en una incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono, conecte la estación de acoplamiento y ejecute el programa de incubación. Descongele los viales de PHH y HJC manteniendo los viales en un baño de agua de 37 grados centígrados hasta que solo quede una pequeña astilla de hielo. Una vez descongelado, pipetear suavemente un máximo de dos viales de PHH directamente en un tubo de medio de recuperación de hepatocitos criopreservados precalentado, medios CHRM.Luego use un mililitro de CHRM para lavar las células restantes del criotubo. Pipetear los HKC suavemente desde el criotubo a 10 mililitros de medio DMEM avanzado de siembra en frío en un tubo de centrífuga de 50 mililitros. Más tarde, centrifugar ambos tipos de células por separado a temperatura ambiente a 100 veces G durante 10 minutos.Después de la centrifugación, retire el sobrenadante y vuelva a suspender los PHH en medio DMEM avanzado de siembra en caliente y HKC en medio DMEM avanzado de siembra helada utilizando un mililitro por vial de las células agregadas al tubo. Vuelva a suspender las células con una acción de balanceo suave y luego colóquelas en hielo. Cuando esté suspendido, cuente las celdas y registre la viabilidad.La viabilidad de la celda debe ser superior al 85%A continuación, desconecte el controlador de la estación de acoplamiento y coloque el controlador en el gabinete de seguridad microbiológica o MBSC. Luego aspire el medio desde arriba del andamio hasta el punto de parada, el canal y el depósito, dejando un volumen muerto de 0,2 mililitros en el pozo de cultivo, llegando justo por encima del andamio. Agregue 400 microlitros de medio DMEM avanzado de siembra en la cámara del pozo antes de devolver el controlador a la estación de acoplamiento en la incubadora y ejecutar el programa de cambio de medios durante tres minutos.Después de tres minutos, desconecte el controlador de la estación de acoplamiento y vuelva a colocarlo en el MBSC. Aspirar los medios desde el andamio anterior hasta el punto de parada y en el extremo del depósito de cada pocillo, seguido de volver a suspender los PHH balanceando suavemente el tubo y agregando el volumen requerido de la suspensión celular a cada pocillo de cultivo. Pipetea cuidadosamente la suspensión celular, asegurando una dispersión uniforme de las células a través del andamio de la placa.Vuelva a suspender cuidadosamente los HKC y agregue bien las suspensiones celulares a cada cultivo. Una vez que todos los pocillos contengan ambos tipos de células, coloque el sistema microfisiológico o el controlador MPS en la estación de acoplamiento en la incubadora sin conectarse físicamente para reposar durante una hora. Una vez que haya pasado una hora, conecte el controlador a la estación de acoplamiento y ejecute el programa de semillas.Cuando el programa se detenga automáticamente a los dos minutos, retire el controlador de la incubadora y agregue lentamente 1, 000 microlitros del medio DMEM avanzado de siembra al canal para lograr un volumen total de 1.4 mililitros. Más tarde, mueva las placas a la incubadora y ejecute el resto del programa de semillas durante ocho horas. En el cuarto día, pausa el programa en el controlador y desconecta el controlador y la placa de la estación de acoplamiento.Transfiéralos a un MBSC. Utilice una pipeta para recoger manualmente aproximadamente un mililitro de medio de cada pocillo para el análisis de biomarcadores solubles sin alterar el cultivo celular tocando el andamio. Etiquete los medios recolectados como muestras del día cuatro y ejecute ensayos de lactato deshidrogenasa y urea como control de calidad para garantizar que la siembra haya sido exitosa.A continuación, dosifique cada pocillo de acuerdo con el plan de la placa realizando el cambio de medios. Una vez completado, devuelva el controlador a la estación de acoplamiento en la incubadora y ejecute el programa de incubación. En el sexto día, desconecte el conductor y la placa de la estación de acoplamiento y transfiéralos a un MBSC.Use una pipeta para recolectar aproximadamente un mililitro de medio de cada pocillo, y etiquételo como muestras 48 horas después de la dosis y almacene las muestras a menos 80 grados centígrados para ensayos posteriores. En el octavo día, retire los andamios de las placas con un par de pinzas y coloque los andamios en una placa de 24 pocillos que contenga 500 microlitros de DPBS sin calcio y magnesio en cada pocillo sin alterar el microtejido. Tome las instantáneas de cada andamio bajo un microscopio de luz invertida con un aumento de 10 veces.En el cuarto día, antes de la dosificación del fármaco, se realizó un control de calidad de los microtejidos hepáticos formados con liberación de LDH y síntesis de urea. En el día ocho, se evaluaron múltiples métricas de salud y hepáticas como albúmina, urea, CYP tres A cuatro, ATP para confirmar altos niveles de funcionalidad hepática y reproducibilidad en los microtejidos. La microscopía de fase de contraste y la tinción de IF en los microtejidos hepáticos revelaron la distribución uniforme de HKC en los microtejidos PHH.La exposición aguda de los microtejidos hepáticos a la troglitazona causó toxicidad, que fue detectada por la alanina aminotransferasa o ALT, y la liberación de LDH y una rápida reducción en la producción de albúmina y urea. El contenido de ATP y la actividad de CYP tres A cuatro confirmaron la toxicidad causada por troglitazona, y los valores de EC50 fueron altamente comparables a otros criterios de valoración. Las imágenes de microscopía de campo claro tomadas después de ocho días de cultivo en el MPS revelan un microtejido hepático sano, sembrado uniformemente en todo el andamio en el control del vehículo.Se observó muerte o degradación tisular en las réplicas tratadas con control positivo y troglitazona. Además, también se investigó la toxicidad hepática después de la exposición a pioglitazona. No se detectó liberación de LDH o ALT, sin embargo, se observó una leve reducción en la producción de albúmina y urea después de 48 horas.Se observó una reducción menor en el contenido de ATP a altas concentraciones de pioglitazona. Los valores de EC50 se generaron a partir de las curvas de dosis-respuesta. La microscopía reveló una ligera alteración del microtejido después de 96 horas de exposición a pioglitazona en las dos concentraciones más altas probadas.En el estudio, el uso de células de buena calidad y viabilidad superiores al 85% es esencial para generar microtejidos 3D altamente funcionales y sanos en el sistema microfisiológico. Después de este procedimiento, podemos evaluar la adenina y las interacciones farmacológicas y la lesión hepática inducida por fármacos en modelos de enfermedad como la hepatitis Delta no alcohólica o el modelo de enfermedad del hígado graso no alcohólico que utiliza el cultivo triple de células del parénquima hepático y no parenquimatoso.

human-liver-microphysiological-system-for-assessing-drug-induced

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

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Protocolo para el aislamiento de hepatocitos primarios humanos y la correspondiente principales poblaciones de células hepáticas no parenquimatosas

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Los avances técnicos recientes permitieron la producción a escala de una plataforma in vitro para aplicaciones de metabolismo y toxicidad de fármacos. Un sistema hepático 2D+ totalmente humano (TV2D+) proporciona resultados fisiológicamente relevantes utilizando métodos tradicionales de cultivo bidimensional. Este protocolo apoyará a los usuarios finales en la configuración, el mantenimiento y la aplicación del sistema.

Un sistema de cultivo hepático totalmente humano para aplicaciones de desarrollo de fármacos

Aprende a evaluar la toxicidad hepática inducida por fármacos utilizando un sistema microfisiológico hepático humano in vitro. Este método mantiene microtejidos funcionales hasta cuatro semanas para predecir DILI con mayor precisión que cultivos 2D.

Sistema microfisiológico hepático humano para evaluar la toxicidad hepática inducida por fármacos in vitro

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