Name: Células epiteliales nasales humanas primarias: biobancos en el contexto de la medicina de precisión (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-22T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Aprenda a aislar, amplificar y criopreservar células epiteliales nasales humanas primarias para evaluar la función del CFTR y desarrollar terapias personalizadas en fibrosis quística.

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Agradecemos calurosamente a todos los pacientes y sus familias por su participación en el estudio. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Asociación Francesa Vaincre la Mucoviscidose; Asociación Francesa ABCF 2 y Vertex Pharmaceuticals Innovation Awards.

Todos los experimentos se realizaron siguiendo las directrices y regulaciones descritas por la Declaración de Helsinki y la ley Huriet-Serusclat sobre ética de la investigación humana.
1. Preparación de matraces y diferentes soportes
<ol><li>Preparar la amplificación, el aire-líquido y el medio de congelación como se describe en la Tabla 1.</li>
	<li>Prepare una solución madre de colágeno iv humano disolviendo 50 mg de colágeno en 100 ml de ácido acético glacial al 0,2%. Mezcle en un agitador magnético durante al menos 1 h y esterilice el filtro la solución. Conservar a 4 °C durante un máximo de 6 meses en una botella de vidrio, protegida de la luz.</li>
	<li>Prepare una solución de trabajo de colágeno IV diluyendo la solución madre 1: 5 en agua doble destilada. Conservar a 4 °C durante un máximo de 6 meses.</li>
	<li>Cubra los matraces de cultivo celular de plástico o los filtros transwell con la solución de trabajo de colágeno. Distribuya uniformemente 100 μL para 0,33 cm2 filtros transwell, 500 μL paramatraces 2 cm 2 y 1 mL para matraces2 cm 75 cm en toda la superficie de crecimiento del matraz. NOTA: Esto se puede lograr inclinando suavemente el matraz de lado a lado. Alternativamente, para facilitar el recubrimiento de los matraces, se puede utilizar un mayor volumen, y cuando toda la superficie está cubierta uniformemente, se aspira la solución de colágeno para dejar solo el volumen indicado. La solución de colágeno aspirado se puede usar inmediatamente para recubrir el siguiente matraz (es decir, para tres matraces de 75 cm2 , distribuir 3 ml de solución de colágeno uniformemente en el primer matraz, aspirar 2 ml, que luego se usan para el siguiente matraz, y así sucesivamente).</li>
	<li>Deje los matraces de cultivo celular en la incubadora durante un mínimo de 2 h o durante la noche. Aspire el colágeno a fondo y deje que los matraces se sequen en la incubadora o debajo del capó durante un mínimo de 20 minutos o durante la noche.</li>
	<li>Lavar con 10 ml de DPBS libres de Mg2+- y Ca2+, dejar secar en la incubadora y almacenar en papel de aluminio para proteger de la luz. Guarde los matraces durante un máximo de 6 meses a temperatura ambiente (RT).</li>
</ol>2. Cepillado nasal
NOTA: Asegúrese de que el cepillado nasal se realiza mientras el participante no tiene una infección aguda. Si los pacientes con FQ presentan una infección pulmonar, consulte el antibiograma del paciente y agregue antibióticos adicionales al medio de amplificación. Las células epiteliales nasales humanas se recolectaron mediante cepillado nasal de pacientes con F508del/F508del como se describió anteriormente9.
<ol><li>Pida al paciente que se suene la nariz, luego anestesia tópicamente la mucosa de ambas fosas nasales utilizando mallas de algodón empapadas en xilocaína al 5% con solución de nafazolina.</li>
	<li>Cepille suavemente la pared medial y el cornete inferior de ambas fosas nasales con un cepillo de citología. Remoje el cepillo en un tubo de 15 ml con 2 ml de medio de lavado disponible comercialmente; agitar suavemente para separar las células. Repita el cepillado en la segunda fosa nasal.</li>
	<li>Añadir los siguientes antibióticos al medio de lavado: Penicilina (100 U/mL), Estreptomicina (100 μg/mL), Tazocilina (10 μg/mL), Anfotericina B (2,5 μg/mL) y Colimicina (16 μg/mL). NOTA: Los cepillados nasales se pueden enviar en RT a laboratorios dedicados para la expansión y el cultivo y se pueden sembrar hasta 72 h después del cepillado.</li>
</ol>3. Aislamiento de HNE
NOTA: Las HNE se aislaron del cepillo de citología, se lavaron con DPBS libres de Mg 2+ y Ca2+, se disociaron con tripsina al 0,25% y se sembraron en un matraz de plástico de 25 cm2 como se describió anteriormente10.
<ol><li>Separe las células del cepillo de citología pasando repetidamente el cepillo a través de un cono de pipeta de 1000 μL y enjuagando con2 ml de DPBS libre de Mg2+ y Ca 2+. Centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspend el pellet en tripsina al 0,25% durante 8-12 min para disociar las células. Detenga la reacción enzimática agregando 5 ml del medio de amplificación.</li>
	<li>Centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet en 8 ml del medio de amplificación y sembrar en un matraz recubierto de colágenode 25 cm 2 . Crecer a 37 °C y 5% CO2. Esto corresponde al pasaje 0.</li>
	<li>Al día siguiente, reemplace el medio con 5 ml de medio de amplificación fresco y monitoree las células diariamente para la unión, la morfología (las células deben tener una apariencia de adoquín cohesivo) y el número. NOTA: La densidad de siembra inicial varía dependiendo de la calidad del cepillado nasal y la proporción de células epiteliales. Las células HNE recién aisladas generalmente alcanzan una confluencia del 80% al 90% en 3-10 días. Una tasa de crecimiento más lenta sugiere insuficiencia de células epiteliales en la muestra y debe descartarse.</li>
</ol>4. Amplificación y paso a través de células epiteliales nasales humanas
<ol><li>Cultivar células epiteliales nasales humanas en el medio de amplificación a 37 °C y 5% de CO2 en matraces recubiertos de colágeno hasta una confluencia del 80%-90%, cambiando de medio cada 48-72 h. Para matracesde 25 cm 2 , utilice 5 ml de medio de amplificación y 10 ml para matraces de75 cm 2 .</li>
	<li>Cuando las células alcancen una confluencia del 80% -90%, lave las células con 10 ml de DPBS libre de Mg 2+ y Ca2+, aspire y descarte.</li>
	<li>Añadir 1 ml de tripsina al 0,25% para un matraz de 25 cm2 (o 2 ml de tripsina para un matraz de 75 cm2 ) y volver a la incubadora (37 °C, 5% CO2) durante 8-12 min.</li>
	<li>Golpee el matraz con firmeza, con la palma de la mano, para ayudar a que las células se desprendan.</li>
	<li>Añadir 10 ml del medio de amplificación para detener la reacción enzimática. Enjuague vigorosamente el matraz, utilizando la pipeta de 10 ml para extraer y expulsar el medio de amplificación sobre la superficie del matraz para enjuagar y separar las células.</li>
	<li>Centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspend el pellet en 5-10 mL del medio de amplificación.</li>
	<li>Cuente las células usando un hemocitómetro. NOTA: Las celdas se pueden congelar en este punto (consulte los pasos 5.1-5.3). Si se requiere una amplificación adicional, vuelva a sembrar en matraces recubiertos de colágeno (un matrazde 25 cm 2 se puede expandir en tres matraces de 75 cm2 , no se recomienda una mayor dilución).</li>
</ol>5. Criopreservación de células epiteliales nasales primarias
NOTA: Cultive células HNE hasta el paso 1 antes del biobanco para obtener suficientes células para facilitar el crecimiento celular cuando se descongelan. Sin embargo, la biobanca es posible en el pasaje inicial 0 o en el pasaje 2. Los siguientes pasos de criopreservación se adaptan a todos los pasajes.
<ol><li>Después del recuento celular, centrífuga a 500 x g durante 5 min a 4 °C y deseche el sobrenadante</li>
	<li>Resuspendir el pellet en el medio de congelación enriquecido (Tabla 1) para obtener 3 x 106-5 x 106 células por ml y por criovial.</li>
	<li>Congele lentamente las células reduciendo la temperatura a ~ 1 ° C por minuto en un recipiente de criocongelación apropiado a -80 ° C. Al día siguiente, mueva la muestra preservada a un contenedor de almacenamiento de nitrógeno para su almacenamiento a largo plazo (el presente estudio está limitado a 17 meses de almacenamiento).</li>
</ol>6. Descongelación de células HNE amplificadas congeladas
<ol><li>Calentar el baño de agua a 37 °C. Preparar el medio de amplificación como se describe en la Tabla 1 y calentar el medio a 37 °C.</li>
	<li>Retire los crioviales del tanque de almacenamiento de nitrógeno y colóquelos rápidamente en el baño de agua, teniendo cuidado de no sumergir todo el vial en el agua. Retire los crioviales del baño de agua cuando solo quede una pequeña gota congelada. Limpie el vial con alcohol al 70%, seque y colóquelo debajo del capó.</li>
	<li>Usando una pipeta de 1 ml, transfiera las celdas descongeladas a un tubo vacío de 15 ml.</li>
	<li>De manera superficial, agregue 1 ml de medio de amplificación caliente. Después de 1 minuto, agregue otro medio de amplificación de 1 ml y espere un minuto adicional.</li>
	<li>Añadir 10 ml del medio de amplificación y centrífuga durante 2 min a 500 x g.</li>
	<li>Aspirar y desechar el sobrenadante. Resuspender el pellet celular en un volumen de medio de amplificación necesario para lograr una densidad celular de al menos 1 x 106 células/ml.</li>
	<li>Sembra las células en un matraz recubierto de colágeno que contenga el medio de amplificación.<ol>
<li>Si el criovial contiene más de 4 x 106 células, sembrar en un matraz de 75 cm2 , en 10 mL del medio de amplificación</li>
		<li>Si criovial contiene menos de 4 x 106 células, células de semilla en un matraz de25 cm 2 , en 5 ml del medio de amplificación</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubar a 37 °C, 5% de CO2, y observar visualmente la expansión celular durante los próximos 2-3 días.</li>
	<li>A continuación, realice la amplificación celular como se detalla en la sección 4. NOTA: Si se cosecharon pocas células en el paso 4.7. (es decir, si se congela en el pasaje 0 antes de la expansión), pasos 6.5. y 6.6. se puede omitir, y las células se pueden sembrar directamente en un matraz recubierto de colágenode 25 cm 2 sin centrifugación. El medio debe cambiarse al día siguiente para eliminar el dimetilsulfóxido (DMSO).</li>
</ol>7. Diferenciación de las células epiteliales nasales humanas en la interfaz aire-líquido
NOTA: Las HNE se diferenciaron en la interfaz aire-líquido como se describió anteriormente10.
<ol><li>Sembrar las células a una densidad de 330.000 células/filtro en filtros porosos recubiertos de colágeno de 0,33 cm2 y complementar con 300 μL del medio de amplificación en el lado apical y 900 μL del medio aire-líquido en el lado basolateral.</li>
	<li>Después de 3 días, aspire el medio apical y cultive las células en la interfaz aire-líquido durante 3-4 semanas en el medio aire-líquido para establecer un epitelio diferenciado. Cambiar el medio basal cada 48-72 h.</li>
</ol>8. Moduladores CFTR
<ol><li>Preparar medio aire-líquido que contenga moduladores CFTR. Utilice VX-445, VX-661 y VX-809 a una concentración final de 3 μM y VX-770 a 100 nM. Utilice el corrector ABBV-2222 a 1 μM de concentración final y el potenciador ABBV-974 a 10 μM. Utilice 100% DMSO para disolver todos los moduladores CFTR.</li>
	<li>Preparar medio aire-líquido que contenga la misma cantidad de 100% DMSO que en el medio corrector.</li>
	<li>Agregue el medio que contiene medicamentos o DMSO al lado basolateral de las células HNE polarizadas cultivadas en una interfaz aire-líquido e incube durante 24 h en 5% de CO2 a 37 ° C.</li>
	<li>Después de 24 h, aspire y deseche el medio y reemplácelo con medio fresco preparado como en los pasos 8.1-8.2., e incube aún más durante un período de 24 h en 5% de CO2 a 37 ° C.</li>
</ol>9. Estudios de la cámara de Ussing
<ol><li>Mida las mediciones de corriente de cortocircuito (Isc) en condiciones de abrazadera de voltaje como se describió anteriormente9. NOTA: La resistencia eléctrica transepitelial (TEER) de los cultivos se midió con un voltímetro de palillo, y solo se consideraron cultivos que alcanzaran al menos 200 Ω·cm2 para los siguientes experimentos. Los filtros de las celdas HNE polarizadas se montaron en las cámaras de Ussing, y las mediciones de corriente de cortocircuito (Isc) se midieron en condiciones de abrazadera de voltaje.</li>
</ol>10. Inmunocitoquímica
<ol><li>Realizar la inmunodetección como se describió anteriormente9. NOTA: La inmunodetección de CFTR se realizó utilizando el anticuerpo monoclonal anti-CFTR C-terminal (24-1) durante la noche a una dilución de 1/100. La tinción de zona-ocludens-1 (ZO-1) (dilución 1/500), alfa-tubulina (dilución 1/300), Muc 5AC (dilución 1/250) y citoqueratina 8 (dilución 1/250) en filtros adicionales. Después del lavado con PBS-Triton-X100 0.1%, se agregaron anticuerpos secundarios de cabra conjugados a Alexa 488 o 594 durante 30 min en suero de cabra al 10% (dilución de 1/1000). Después de un lavado final, los filtros se cortaron del soporte y se montaron con el medio de montaje Vectashield que contenía DAPI. Se utilizó un microscopio confocal (contraste de interferencia diferencial de aceite 63x/1.4 λ objetivo azul PL APO) para capturar imágenes, que se analizaron con el software ImageJ.</li>
</ol>11. Análisis estadístico
<ol><li>Realizar análisis estadísticos utilizando el software adecuado. NOTA: El análisis estadístico se realizó utilizando el software S.A.S. Como se obtuvieron varios filtros HNE por paciente y por condición, los parámetros cuantitativos se expresaron como valores medios (± SEM) por paciente. Las comparaciones (media ± de SD) se llevaron a cabo utilizando la prueba de rango firmado de pares emparejados de Wilcoxon o la prueba t no emparejada.</li>
</ol>

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<li>Awatade, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significant+functional+differences+in+differentiated+Conditionally+Reprogrammed+%28CRC%29-+and+Feeder-free+Dual+SMAD+inhibited-expanded+human+nasal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cystic+Fibrosis%22%5BJournal%5D)">Significant functional differences in differentiated Conditionally Reprogrammed (CRC)- and Feeder-free Dual SMAD inhibited-expanded human nasal epithelial cells.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 20 (2), 364-371 (2021).</li>
<li>Veit, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+folding+correction+of+F508del+and+rare+CFTR+mutants+by+elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor+%28Trikafta%29+combination%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Allosteric folding correction of F508del and rare CFTR mutants by elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor (Trikafta) combination.</a> JCI Insight. 5 (18), 139983(2020).</li>
<li>Dale, T. P., Borg D'anastasi, E., Haris, M., Forsyth, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rock+Inhibitor+Y-27632+enables+feeder-free%2C+unlimited+expansion+of+Sus+scrofa+domesticus+swine+airway+stem+cells+to+facilitate+respiratory+research%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Rock Inhibitor Y-27632 enables feeder-free, unlimited expansion of Sus scrofa domesticus swine airway stem cells to facilitate respiratory research.</a> Stem Cells International. 2019, 1-15 (2019).</li>
<li>Laselva, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+multiple+class+II+CFTR+mutations+by+elexacaftor%2Btezacaftor%2Bivacaftor+mediated+in+part+by+the+dual+activities+of+elexacaftor+as+both+corrector+and+potentiator%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Rescue of multiple class II CFTR mutations by elexacaftor+tezacaftor+ivacaftor mediated in part by the dual activities of elexacaftor as both corrector and potentiator.</a> The European Respiratory Journal. 57 (6), 2002774(2021).</li>
<li>Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK+inhibitor+improves+survival+of+cryopreserved+serum%2Ffeeder-free+single+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells.</a> Human Reproduction. 24 (3), 580-589 (2008).</li>
<li>Neuberger, T., Burton, B., Clark, H., Van Goor, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+primary+cultures+of+human+bronchial+epithelial+cells+isolated+from+cystic+fibrosis+patients+for+the+pre-clinical+testing+of+CFTR+modulators%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Use of primary cultures of human bronchial epithelial cells isolated from cystic fibrosis patients for the pre-clinical testing of CFTR modulators.</a> Methods in Molecular Biology. 741, Clifton, N.J. 39-54 (2011).</li>
<li>Laselva, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+pre-clinical+modulators+developed+for+F508del-CFTR+have+the+potential+to+be+effective+for+ORKAMBI+resistant+processing+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cystic+Fibrosis%22%5BJournal%5D)">Emerging pre-clinical modulators developed for F508del-CFTR have the potential to be effective for ORKAMBI resistant processing mutants.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 20 (1), 106-119 (2021).</li>
</ol>

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El uso de células epiteliales nasales derivadas del paciente como sustitutos de las células epiteliales bronquiales humanas (HBE) para medir la actividad de CFTR en el contexto de la medicina personalizada se ha propuesto como propiedades de reproducción de células HNE en cultivo 9,11. La gran ventaja de la HNE sobre los cultivos de células HBE es que se muestrean de forma fácil y no invasiva. Las mediciones de corriente de cortocircuito en cultivos celulares HNE...

La fibrosis quística (FQ) es un trastorno autosómico recesivo resultante de mutaciones en el gen regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) que conduce a la ausencia o disfunción de la proteína CFTR, un canal aniónico situado en la superficie apical de los epitelios 1,2. Los recientes avances en la terapia CFTR han mejorado el pronóstico de la enfermedad, y los últimos fármacos aprobados que combinan correctores CFTR y potenciadores CFTR condujeron a mejoras importantes en la función pulmonar y la calidad de vida de los pacientes con FQ portadores de la mutación p.Phe508del más frecuente (F508del)3,4. A pesar de este prometedor progreso terapéutico, alrededor del 10% de los pacientes con FQ no son elegibles ya que portan mutaciones que no son rescatables por estos moduladores CFTR. Para estos pacientes, existe la necesidad de probar otros medicamentos o combinaciones de medicamentos para encontrar la combinación más eficiente para mutaciones específicas, destacando la importancia de las terapias personalizadas.
Las células epiteliales nasales humanas (HNE) son fáciles de recolectar mediante un cepillado nasal simple y no invasivo y permiten cuantificar el transporte cíclico de cloruro mediado por AMP (Cl−) como un índice de la función CFTR. Las células HNE producen un modelo preciso de las vías respiratorias humanas, pero su vida útil es limitada en cultivo. Gracias a la optimización de las técnicas de cultivo, las células HNE primarias derivadas del paciente pueden reprogramarse condicionalmente con inhibidor de la quinasa asociada a Rho (ROCKi), amplificarse y diferenciarse en un epitelio pseudoestratificado en condiciones de interfaz aire-líquido (ALI) en filtros microporosos 5,6. Existen numerosos protocolos de cultivo para el cultivo de HNE (disponibles comercialmente, sin suero, "caseros", cocultivos con células alimentadoras, etc.), y se ha descrito que la elección de los medios y las condiciones de cultivo afectan el crecimiento, la diferenciación de la población celular y la función epitelial 7,8. El protocolo aquí presenta un método de amplificación ROCKi simplificado, libre de alimentación, que permite obtener con éxito un gran número de células HNE que luego se diferencian en ALI para ensayos de función CFTR.
Hemos demostrado que, en células HNE diferenciadas, un tratamiento de 48 h con moduladores CFTR es suficiente para inducir la corrección electrofisiológica de la corriente Cl dependiente de CFTR y que la corrección observada in vitro puede estar correlacionada con la mejoría clínica del paciente9. Las células HNE, por lo tanto, representan un modelo apropiado no solo para la investigación fundamental de la FQ, sino también para estudios preclínicos con pruebas de modulador CFTR específicas del paciente. En este contexto de terapia personalizada, el objetivo del protocolo fue validar que las células HNE criopreservadas de pacientes con FQ, cultivadas en nuestras condiciones, eran un modelo apropiado para los estudios de corrección de CFTR, y se podían esperar resultados similares al comparar el transporte de Cl- dependiente de CFTR de células frescas y congeladas-descongeladas. El estudio también evaluó la eficacia de diferentes moduladores CFTR cuando se utilizan terapias duales y triples.

<table><tbody><tr><td>ABBV-2222</td><td>Selleckchem</td><td>S8535</td><td></td></tr><tr><td>ABBV-974</td><td>Selleckchem</td><td>S8698</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Tecnologías de vida</td> avanzadas <td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488 anticuerpo secundario de cabra</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 594 anticuerpo secundario de cabra</td><td>Invitrogen</td><td>A11012</td><td></td></tr><tr><td>Anfotericina B</td><td>Life Technologies</td><td>15290026</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-alfa-tubulina</td><td>Abcam</td><td>ab80779</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo monoclonal anti-CFTR (24-1)</td><td>R& D Systems</td><td>MAB25031</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-citoqueratina 8</td><td>Progen</td><td>61038</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo Anti-Muc5AC</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-20118</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-ZO-1</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-10804</td><td></td></tr><tr><td>Ciprofloxacino</td><td></td><td>proporcionado por Necker Hospital Pharmacy</td><td></td></tr><tr><td>Colimicina</td><td>Sanofi</td><td>proporcionado por Necker Farmacia Hospitalaria</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno tipo IV</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>C-7521</td><td></td></tr><tr><td>cepillo de citología</td><td>Laboratorio GYNEAS</td><td>02.104</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0311</td><td></td></tr><tr><td>Epinefrina</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>E4375</td><td></td></tr><tr><td>F12-Mezcla de nutrientes</td><td>Life Technologies</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Ferticult</td><td>Fertipro NV</td><td></td> Frascos FLUSH020 <td></td></tr><tr><td>25</td><td>Frascos Thermo Scientific</td><td>156.367</td><td></td></tr><tr><td>75</td><td>Thermo Scientific</td><td>156.499</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>VWR</td><td>20104.298</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Hidrocortisona</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>SLCJ0893</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>I0516</td><td></td></tr><tr><td>Mg2+ y Ca2+ DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190094</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>15140130</td><td></td></tr><tr><td>Tazocilina</td><td>Mylan</td><td>proporcionada por Necker Hospital Pharmacy</td><td></td></tr><tr><td>Transwell Filters</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>CLS3470-48EA</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina 0,25%</td><td>Life Technologies</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Medio de montaje Vectashield con DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>VX-445</td><td>Selleckchem</td><td>S8851</td><td></td></tr><tr><td>VX-661</td><td>Selleckchem</td><td>S7059</td><td></td></tr><tr><td>VX-770</td><td>Selleckchem</td><td>S1144</td><td></td></tr><tr><td>VX-809</td><td>Selleckchem</td><td>S1565</td><td></td></tr><tr><td>Xilocaína naphazolina 5%</td><td>Aspen Francia</td><td>proporcionado por Necker Hospital Pharmacy</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Selleckchem</td><td>S1049</td><td></td></tr></tbody></table>

células epiteliales nasales humanas primarias: biobancos en el contexto de la medicina de precisión

Primary Human Nasal Epithelial Cells: Biobanking in the Context of Precision Medicine

Las células epiteliales nasales humanas (HNE) son fáciles de recolectar mediante un cepillado nasal simple y no invasivo. Las células HNE primarias derivadas del paciente se pueden amplificar y diferenciar en un epitelio pseudoestratificado en condiciones de interfaz aire-líquido para cuantificar el transporte cíclico de cloruro (Cl-) mediado por AMP como un índice de la función reguladora de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR). Si los pasos críticos, como la calidad del cepillado nasal y la densidad celular tras la criopreservación, se pueden realizar de manera eficiente, las células HNE se pueden biobancar con éxito. Además, los estudios de corriente de cortocircuito demuestran que la congelación-descongelación no modifica significativamente las propiedades electrofisiológicas de las células HNE y la respuesta a los moduladores CFTR. En las condiciones de cultivo utilizadas en este estudio, cuando se congelan menos de 2 x 106 células por criovial, la tasa de fracaso es muy alta. Recomendamos congelar al menos 3 x 106 células por criovial. Demostramos que las terapias duales que combinan un corrector CFTR con un potenciador CFTR tienen una eficacia de corrección comparable para la actividad CFTR en células HNE F508del-homocigotas. La terapia triple VX-445 + VX-661 + VX-770 aumentó significativamente la corrección de la actividad de CFTR en comparación con la terapia dual VX-809 + VX-770. La medida de la actividad de CFTR en células HNE es un biomarcador preclínico prometedor útil para guiar la terapia con moduladores de CFTR.

Las células HNE frescas cultivadas en la interfaz aire-líquido muestran características típicas del epitelio respiratorio polarizado y diferenciado evaluado por inmunotinción (Figura 1). Las células HNE se vuelven a diferenciar en una capa heterogénea de células epiteliales (inmunotinción positiva de queratina 8) que imitan la situación in vivo de un epitelio respiratorio pseudoestratificado compuesto por células caliciformes productoras de moco ciliadas (tinción positiva de alfa-tu...

Aquí describimos el aislamiento, la amplificación y la diferenciación de las células epiteliales nasales humanas primarias (HNE) en la interfaz aire-líquido y un protocolo de biobanco que permite congelar con éxito y luego descongelar la HNE amplificada. El protocolo analiza las propiedades electrofisiológicas de las células HNE diferenciadas y la corrección de la secreción de cloruro relacionada con CFTR en diferentes tratamientos moduladores.

Células epiteliales nasales humanas primarias: biobancos en el contexto de la medicina de precisión

Human nasal epithelial (HNE) cells are easy to collect by simple, non-invasive nasal brushing. Patient-derived primary HNE cells can be amplified and ...

Este protocolo destaca los pasos clave para amplificar, diferenciar y criopreservar las células epiteliales nasales primarias. En nuestras condiciones de cultivo, las células epiteliales nasales primarias imitan el epitelio pulmonar. Esto permite cultivos derivados de pacientes y estudios de medicina personalizada a partir de células frescas o biobancarias.Los cultivos epiteliales nasales derivados del paciente se pueden utilizar para evaluar la actividad de CFTR y ayudar con la terapia de fibrosis quística mediante la evaluación de la respuesta individual del paciente a las nuevas terapias. Demostrando el procedimiento estará Aurelie Hatton, una ingeniera de mi laboratorio. Para empezar, cultivar células epiteliales nasales o HNE, en 10 mililitros de medio de amplificación.Incubar a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono en un matraz recubierto de colágeno de 75 centímetros cuadrados hasta que alcance una confluencia del 80 al 90%. Cambie el medio cada 48 a 72 horas. Más tarde, lave las células con 10 mililitros de DPBS libre de magnesio y calcio.Aspirar y desechar la solución salina. Antes de añadir dos mililitros de tripsina al 0,25% y devolver el matraz a la incubadora durante ocho a 12 minutos. Más tarde, golpee el matraz firmemente con una palma para ayudar al desprendimiento celular.Agregue 10 mililitros del medio de amplificación para detener la reacción enzimática. Enjuague vigorosamente el matraz con una pipeta de 10 mililitros para extraer y expulsar el medio de amplificación sobre la superficie del matraz para enjuagar y separar las células y recoger las células en un tubo de 15 mililitros. Centrifugar la suspensión celular a 500 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y desechar el sobrenadante.Vuelva a suspender el pellet en cinco a 10 mililitros de medio de amplificación. Luego cuente las células en un hemocitómetro. Después del recuento celular, centrífuga las células a 500 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y deseche el sobrenadante.Luego vuelva a suspender el pellet en el medio de congelación enriquecido para obtener de tres a cinco veces 10 a las seis células por mililitro y colóquelo en un vial criogénico. Congele lentamente las células reduciendo la temperatura en aproximadamente un grado Celsius por minuto en un recipiente criocongelante apropiado a menos 80 grados Celsius. Al día siguiente, mueva la muestra conservada a un contenedor de almacenamiento de nitrógeno para su almacenamiento a largo plazo.Caliente el medio de amplificación recién preparado en un baño de agua a 37 grados centígrados. Retire los viales criogénicos del tanque de almacenamiento de nitrógeno y colóquelos rápidamente en el baño de agua, teniendo cuidado de no sumergir todo el vial en agua. Retire los viales criogénicos del baño de agua cuando solo quede una pequeña gota congelada.Limpie los viales con alcohol al 70% y colóquelos debajo del capó. Usando una pipeta de un mililitro, transfiera las células descongeladas a un tubo de 15 mililitros. Luego agregue un mililitro de medio de amplificación caliente de una manera superficial.Después de un minuto, agregue otro mililitro de medio de amplificación y espere un minuto. Agregue 10 mililitros de medio de amplificación y centrífuga a 500 veces G durante dos minutos a cuatro grados centígrados. Aspirar y desechar el sobrenadante.Vuelva a suspender el pellet en un volumen de medio de amplificación necesario para lograr una densidad celular de una vez 10 a las seis celdas por mililitro. Después de sembrar las células en un matraz recubierto de colágeno de 25 centímetros cuadrados, que contiene un medio de amplificación, incuba las células a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Observe visualmente la expansión celular durante dos o tres días antes de realizar la amplificación celular como se demostró anteriormente.Sembrar las células a una densidad de 3,3 veces 10 a la quinta célula por filtro en filtros porosos recubiertos de colágeno de 0,33 centímetros cuadrados, complementados con 300 microlitros de medio de amplificación en el lado apical y 900 microlitros de medio líquido de aire en el lado basolateral. Después de tres días, aspire el medio apical y cultive las células en la interfaz aire-líquido durante tres a cuatro semanas en el medio aire-líquido para establecer un epitelio diferenciado. Cambie el medio basal cada 48 a 72 horas.Las células HNE frescas cultivadas en la interfaz aire-líquido mostraron características típicas del epitelio respiratorio polarizado y diferenciado. En las 78 muestras de células HNE, se compararon las tasas de éxito en el cepillado nasal sembrado inmediatamente y después de uno a siete días de transporte en un medio de lavado. El porcentaje medio inicial de cultivos exitosos fue del 82% y alcanzó el 87% en muestras sembradas entre cero y cinco días.El 83% de las muestras que se diferenciaron con éxito en condiciones frescas también tuvieron éxito en muestras criopreservadas. Del mismo modo, en muestras que no lograron diferenciarse en condiciones frescas, el 71% tampoco tuvo éxito en condiciones de congelación-descongelación. Además, el 50% de las muestras congeladas entre dos y tres veces 10 a las seis células por crio vial no crecieron cuando se descongelaron, alcanzando el 80% por debajo de dos veces 10 a las seis células.Para el cambio de corriente de cortocircuito en respuesta a la forskolina y el cambio de corriente de cortocircuito en respuesta al inhibidor de CFTR 172 en células HNE tratadas con DMSO, no se observaron diferencias significativas entre HNE descongelada fresca o congelada. Tras el tratamiento, ambos tipos de células mostraron una corrección significativa con un aumento en el cambio de corriente de cortocircuito en respuesta a la forskolina y una disminución en el cambio de corriente de cortocircuito en respuesta al inhibidor de CFTR 172. la respuesta correctiva de las terapias duales de función CFTR se evaluó en comparación con el cambio de corriente de cortocircuito de las células HNE tratadas con DMSO en respuesta a la forskolina y en respuesta al inhibidor de CFTR 172 mejoraron significativamente tanto por VX-809 más VX-770 como por VX-661 más VX-770.Se compararon tres terapias moduladoras de CFTR diferentes en HNE de seis pacientes homocigotos con F508del. Cuando se usa en combinación con un corrector y potenciador CFTR, tanto el vértice como un modulador CFTR, corrigen el cambio de corriente de cortocircuito en respuesta a la forskolina y el cambio de corriente de cortocircuito en respuesta al inhibidor de CFTR 172 en una medida similar. Al congelar las células HNE, es importante tener al menos 3 millones de células por crio vial para aumentar las posibilidades de un buen resultado al descongelarse.Se ha demostrado que la actividad de CFTR en células HNE es un buen modelo predictivo para evaluar y ajustar las terapias personalizadas en la fibrosis quística.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Se describe aquí un método para la biopsia de mucosa olfatoria de ratas y humanos cavidades nasales. Estas biopsias se pueden utilizar tanto para la identificación de anomalías moleculares en las enfermedades cerebrales o el aislamiento de células madre adultas multipotentes que pueden ser utilizados para el trasplante de células en modelos animales de trauma cerebral /...

Aislar las células madre olfativo nasal de los roedores o los seres humanos

Células epiteliales nasales, obtenidas mediante biopsia raspadura superficial de voluntarios humanos, se expanden y se transfieren a insertos de cultivo de tejidos. Al llegar a la confluencia, las células se cultivan en la interfase aire-líquido, produciendo cultivos de células ciliadas y no ciliadas. Cultivos de células epiteliales nasales diferenciados proporcionan modelos experimentales viables para el estudio de la mucosa respiratoria.

El cultivo de células humanas epiteliales nasales en la interfase aire líquido

Esta publicación demuestra métodos para el muestreo y cultivo exitosos de mucosa epitelial nasal de niños, y la reprogramación de estas células a Células Madre Pluripotentes (iPSCs) inducidas.

Cultivar las células primarias epiteliales nasales de niños y reprogramar en células madre pluripotentes inducidas

Los tumores cutáneos se descartan a menudo después de la cirugía micrográfica de Mohs. Se describe aquí un protocolo que permite al personal de soporte clínico procesar y almacenar eficazmente muestras de tumores cutáneos ( por ejemplo, carcinoma de células escamosas, carcinoma basocelular y melanoma) para aplicaciones de laboratorio aguas abajo sin interferir con las operaciones clínicas.

Establecimiento de un Biorepository basado en la Clínica

Aquí se describe un método para generar culturas esferoide tridimensional de células epiteliales nasales humanas. Esferoides son estimulados luego a unidad de regulador de conductancia transmembrana de la Fibrosis Quística (CFTR)-ion dependiente y secreción flúida, cuantificar el cambio en el tamaño luminal esferoide como un proxy para la función CFTR.

Generación de células epiteliales nasales humanas esferoides para estudio de regulador de conductancia de la transmembrana individualizada la Fibrosis quística

Aquí se presenta un protocolo detallado para describir un modelo organoide in vitro de células epiteliales nasales humanas. El protocolo tiene opciones para mediciones que requieren equipos de laboratorio estándar, con posibilidades adicionales para equipos y software especializados.

Cultivo e imágenes de organoides epiteliales nasales humanos

Este protocolo describe la recolección, expansión y diferenciación de células epiteliales nasales a modelos organotípicos de células epiteliales de las vías respiratorias y la cuantificación de la frecuencia de latidos de los cilios a través de imágenes de células vivas y guiones personalizados.

Recopilación, expansión y diferenciación de modelos primarios de células epiteliales nasales humanas para la cuantificación de la frecuencia de latido de los cilios

Los avances recientes en los protocolos de diferenciación de células madre pluripotentes inducidas por humanos permiten la derivación gradual de tipos de células específicas de órganos. Aquí, proporcionamos pasos detallados para el mantenimiento y la expansión de las células basales de las vías respiratorias derivadas de iPSC y su diferenciación en un epitelio mucociliar en cultivos de interfaz aire-líquido.

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El epitelio nasal es el principal sitio de barrera que encuentran todos los patógenos respiratorios. Aquí, describimos métodos para utilizar células epiteliales nasales primarias cultivadas como cultivos de interfaz aire-líquido (ALI) para caracterizar las interacciones entre el coronavirus humano y el huésped en un sistema fisiológicamente relevante.

Infección de células epiteliales nasales primarias cultivadas en una interfaz aire-líquido para caracterizar las interacciones entre el coronavirus y el huésped humano

Aquí se presenta un método reproducible, asequible y robusto para el aislamiento y la expansión de células epiteliales bronquiales primarias para biobancos a largo plazo y la generación de células epiteliales diferenciadas por cultivo en la interfaz aire-líquido.

Aislar células epiteliales bronquiales del tejido pulmonar resecado para biobancos y establecer cultivos de interfaz aire-líquido bien diferenciados

Aprenda a aislar, amplificar y criopreservar células epiteliales nasales humanas primarias para evaluar la función del CFTR y desarrollar terapias personalizadas en fibrosis quística.

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