La inducción de la encefalomielitis autoinmune experimental en ratones y evaluación de la distribución de la enfermedad dependiente de las células inmunes en diversos tejidos

Este manuscrito describe los métodos para la inducción y puntuación del modelo experimental de encefalomielitis autoinmune (EAE), junto con la evaluación de la distribución de células inmunitarias y los niveles de citocinas de ARNm en ganglios linfáticos, bazo, sangre y médula espinal mediante citometría de flujo y PCR cuantitativa, respectivamente, en varias fases de la enfermedad.

El objetivo general del modelo de Encefalomielitis Autoinmune Experimental (EAE) es facilitar el estudio de los posibles mecanismos moleculares que subyacen al desarrollo de la esclerosis múltiple. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la esclerosis múltiple, como por ejemplo, ¿en qué etapa de la enfermedad se infiltran las células inmunitarias en el sistema nervioso central? La principal ventaja de esta técnica es que el modelo EAE imita muchas de las principales características de la esclerosis múltiple, como la desmielinización y la infiltración de células inmunitarias.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento de la esclerosis múltiple porque los fármacos probados con este método ya han sido aprobados para esta enfermedad. En general, las personas nuevas en este método tendrían dificultades porque hay muchas condiciones que deben tenerse en cuenta al inducir EAE. Los ratones deben mantenerse en un ambiente libre de estrés, y la toxina de la tos ferina debe estar recién preparada.

La demostración oficial de este método es fundamental, ya que el aislamiento de los ganglios linfáticos y la extracción de la médula espinal son difíciles de aprender solo con la descripción. Comience inyectando por vía subcutánea a ratones hembra de 10 a 13 semanas de edad 200 microgramos de glicoproteína de oligodendrocitos de mielina. emulsionado en 200 microlitros de adyuvante completo de Freund, conteniendo 400 microgramos de mycobacterium tuberculosis.

Inmediatamente y 24 horas después, inyectar intraperitonealmente a los ratones 0,2 microgramos de toxina pertussis en 200 microlitros de PBS. Es fundamental que los ratones se hayan adaptado tanto al manejo como al entorno experimental antes de la inducción de EAE para inducir estrés que pueda prevenir el desarrollo de síntomas clínicos. Una semana después de la inyección, examine diariamente a los ratones para detectar síntomas clínicos como se describe en la tabla.

Para evaluar la población de células inmunitarias de los ganglios linfáticos inducida por EAE, en el momento adecuado después de la inducción, humedecer el área de la incisión con isopropanol al 80% y retirar cuidadosamente la piel sobre la región de la cadera. Con fórceps, extraiga con cuidado el ganglio linfático inguinal del tejido graso. A continuación, pese el nodo y coloque la muestra en PBS sobre hielo.

Para analizar las células de la médula espinal, humedezca el lomo del animal con isopropanol y use un bisturí para hacer un corte longitudinal en la columna vertebral. A continuación, retire la piel y diseccione la parte lumbar de la columna vertebral, inerviendo las extremidades traseras. Enjuague la columna vertebral con una jeringa llena de PBS para extraer la médula espinal.

Después de extraer aproximadamente 1/3 de la médula lumbar, pese el fragmento de la columna vertebral y almacene el tejido en PBS sobre hielo. Para analizar la población de células inmunitarias esplénicas, abra el tejido para acceder a la parte inferior del abdomen. A continuación, retire el bazo y corte aproximadamente 1/8 del tejido.

Pese el fragmento de bazo y almacene el tejido en PBS sobre hielo. A continuación, utilice el émbolo de una jeringa de dos ml para macerar el resto del tejido a través de un tamiz de malla de 70 micras en un tubo de 50 mililitros, seguido de un lavado de PBS de cinco mililitros del colador. Centrifugar las células filtradas.

Vuelva a suspender el pellet en 500 microlitros de tampón de lisis celular y transfiera las células a un tubo de 1,5 mililitros. Después de 10 minutos a temperatura ambiente, lavar las células dos veces en 500 microlitros de PBS. Después del segundo lavado, vuelva a suspender el pellet en 100 microlitros de 0.2%BSA en PBS y agregue dos microlitros de tampón de bloqueo del receptor Fc a las células.

Después de 15 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente, etiquete las células con 13 microlitros de cóctel de anticuerpos durante otros 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Al final de la incubación, lavar las células al menos dos veces en 500 microlitros de PBS y volver a suspender el pellet final en 500 microlitros de PBS fresco. A continuación, transfiera las células a un tubo de citometría de flujo con hielo.

Finalmente, para analizar las muestras por citometría de flujo, directamente antes de la medición de la citometría de flujo, agregue 30 microlitros de estándar de recuento absoluto de citometría de flujo a las celdas para determinar los recuentos absolutos de células. A continuación, analice las muestras en el citómetro de flujo. Como se muestra en esta figura, se observa un aumento transitorio de todas las poblaciones de células inmunitarias dentro de los ganglios linfáticos durante la fase aguda de la inducción de EAE.

Sin embargo, en el bazo, solo los macrófagos, las células B, las células T y los neutrófilos muestran un aumento de la infiltración. En la sangre, todas las poblaciones de células inmunitarias muestran un aumento transitorio de su circulación periférica durante la fase preclínica que corresponde a un aumento similar dependiente de la enfermedad en la médula espinal lumbar durante la fase aguda de la enfermedad, excluyendo la población de monocitos, que presumiblemente se diferencia en macrófagos después de la entrada en la médula espinal. Aquí, se muestra la estrategia de compuerta para la evaluación de las diferentes poblaciones celulares.

El número de células está relacionado con la cantidad de tejido o el volumen de sangre analizado, lo que refleja el recuento absoluto de células. En los ganglios linfáticos, la expresión de ARNm de IL-23 aumenta durante la fase preclínica, mientras que la expresión de IL-6 aumenta de forma dependiente de la enfermedad. En el bazo, la expresión de IL-6 e IL-23 aumenta en la fase preclínica, mientras que la expresión del ARNm beta de IL-1 no se ve afectada hasta el inicio de la enfermedad.

En la sangre, la expresión de solo el ARNm de TNF-alfa está regulada al alza y de una manera dependiente de la enfermedad. En la médula espinal lumbar, el TNF-alfa, la IL-1 beta y el interferón gamma se inducen durante la fase aguda, mientras que la IL-6 se regula al alza solo durante la fase de inicio de la enfermedad. Una vez dominado, el modelo EAE, el posterior aislamiento celular y el análisis de efectos se pueden completar en ocho horas para diez ratones si se realizan correctamente.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como Western Blot o ELISA para confirmar los resultados del análisis de expresión de ARNm. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la esclerosis múltiple exploraran el mecanismo de la desmielinización en el sistema nervioso central. Después de ver este vídeo, deberías tener una buena comprensión de cómo inducir el modelo EAE y cómo aislar células inmunitarias para obtener resultados de citometría de flujo reproducibles.

No olvide que trabajar con el adyuvante completo de Freund puede ser extremadamente peligroso, y agregue precauciones como levantar la piel del ratón y garantizar la penetración completa de la piel con la jeringa mientras realiza este procedimiento.