Name: La inducción de la encefalomielitis autoinmune experimental en ratones y evaluación de la distribución de la enfermedad dependiente de las células inmunes en diversos tejidos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Aprende a inducir encefalomielitis autoinmune experimental en ratones y evaluar la distribución de células inmunes mediante citometría de flujo y PCR cuantitativa. Este método permite estudiar los mecanismos moleculares de la esclerosis múltiple.

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Este trabajo fue apoyado por el Grupo de Formación en Investigación Traslacional - Pharma de la Fundación Else Kröner-Fresenius (EKFS) y por el "Landesoffensive zur Entwicklung wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz (LOEWE), Schwerpunkt: Anwendungsorientierte Arzneimittelforschung" del Estado de Hesse.

DECLARACIÓN DE ÉTICA: Nuestros procedimientos experimentales son aprobados por el Comité de Ética del Regierungspräsidium Darmstadt (Alemania) y confirmar con las regulaciones nacionales y europeas. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento de los animales y reducir el número de animales utilizados. EAE 1. Modelo <ol><li> La inducción de la EAE modelo <ol><li> Utilice / SvJae × C57BL / 6 ratones 129S4 femenina de 10 a 13 semanas de edad para la inducción de la EAE. </li><li> Dar a los ratones una inyección subcutánea, en la parte superior e inferior de la espalda, de la encefalitogénico MOG 35 - péptido 55 (mielina de los oligodendrocitos glicoproteína) (200 mg), emulsionado en adyuvante completo de 200 l Freund`s (CFA) que contiene 400 mg de Mycobacterium tuberculosis. Nota: Como control negativo simulado, la inducción de la enfermedad no-, adyuvante incompleto de Freund que contiene Mycobacterium tuberculosis, en el mismo volumen y por la misma ruta, se puede utilizar. </li><li> TherEDespués, y de nuevo 24 horas más tarde, dar a los ratones una inyección intraperitoneal de toxina pertussis (en total 0,2 g, diluido en 200 buffer fosfato salino-l, PBS). Usa los ratones no tratados como el grupo de control, para poder comparar enferma con animales sanos. Nota: También es posible inducir EAE con 200-300 mg MOG 35 - 55 péptido, 300-500 g de Mycobacterium tuberculosis en el CFA y 0,2-0,3 g de toxina pertussis en un volumen de 0,1 - 0,2 ml por inyección. </li><li> Comenzando una semana después de la inyección, los ratones examinan todos los días para los síntomas clínicos (ver paso 1.2.1) Nota: El día de inicio de la enfermedad varía en diferentes experimentos, pero en las condiciones en nuestro laboratorio, esto es alrededor del día 11 y por lo tanto, aquí el día 14 se define como 3 días después del inicio de la enfermedad. Todos los ratones en el presente estudio desarrollaron síntomas clínicos. </li></ol></li><li> La puntuación de los ratones <ol><li> Clasificar los síntomas clínicos de las puntuaciones clínicas de la siguiente manera:0) no hay signos, 0,5) parálisis distal de la cola, 1) parálisis completa de la cola, 1.5) cola flácida y debilidad leve de las patas traseras, 2) cola flácida y debilidad severa de las patas traseras, 2.5) de la cola cojera y parálisis de una pata trasera, 3) la cola cojera y parálisis de ambas patas traseras, 3,5) parálisis de ambas patas traseras y la debilidad de una extremidad delantera (ratones han alcanzado esta puntuación fueron sacrificados, de acuerdo con las pautas éticas locales). </li></ol></li></ol> 2. Preparación de las células individuales para el análisis de citometría de flujo Nota: La mezcla de anticuerpo consiste en 1 l CD45-Vioblue, 2 l CD8-eFluor650, 0,5 l CD11b-eFluor605, 0,5 l F4 / 80-PE-Cy7, 1 l CD3-PE-CF594, CD4-V500, 0,5 l CD11c -AlexaFluor700, 1 l CD19-APC-H7 y 1 l Ly6G-APC-Cy7. Nota: Si se toma la sangre, los ganglios linfáticos, el bazo y la médula espinal, entonces el procedimiento es el siguiente: Los ratones se anestesiaron profundamente con una combinación de isoflUrane (2% en carbógeno por minuto) y ketamina (100 mg / kg de peso corporal). A continuación abra el tórax, extraer la sangre con un palillo intracardiaca y la perfusión de los ratones por vía intracardiaca con PBS frío. A continuación, retire los ganglios linfáticos seguido de bazo y finalmente la médula espinal. Si no es necesario para perfundir los ratones por vía intracardiaca entonces la eutanasia a los ratones bajo anestesia profunda por luxación del cuello. <ol><li> Aislamiento de esplenocitos <ol><li> Anestesiar los ratones con una combinación de isoflurano (2% en carbógeno por minuto) y ketamina (100 mg / kg de peso corporal). </li><li> área de la incisión mojado con isopropanol al 80% para evitar cualquier contaminación con pelos y abrir el tórax longitudinal, sin perforar los tejidos más profundos, con unas tijeras. </li><li> Perfundir ratones intracardially de frío PBS pH 7,0 23. Nota: El bazo se encuentra en el cuadrante abdominal superior, izquierda debajo de la caja torácica. Si solamente se va a estudiar el bazo, este órgano puede ser removido antes de la perfusión con el fin de retain todos los tipos de células de interés. </li><li> Extirpar el bazo y corte aproximadamente 1/8 y pesarlo. Conservar la muestra en PBS en hielo. </li><li> Exprimir el tejido de bazo a través de un tamiz de malla de 70 micras (colocado sobre un tubo de 50 ml), utilizando el émbolo de una jeringa de 2 ml. </li><li> Se lava la malla con 5 ml de PBS. Se centrifuga a 1.800 g durante 3 min. Resuspender el precipitado en 500 l solución de lisis. Nota: En esta etapa, puede ser necesario hacer un recuento celular diferencial si, después, un método de análisis FACS alternativa que se utiliza no emplea perlas (véase la sección 3). </li><li> Incubar durante 10 min a temperatura ambiente (RT) y añadir 500 l de PBS. Centrifugar durante 6 min a 650 xg a temperatura ambiente (RT). </li><li> Repetir la etapa de lavado con 500 l de PBS. Descartar el sobrenadante, resuspender el sedimento celular en 100 l 0,2% de albúmina de suero bovino (BSA) / PBS, añadir 2 l Fc receptor-1 (FcRI) tampón de bloqueo e incubar durante 15 min a TA en la oscuridad. </li><li> Añadir 13 l unamezcla tibody, incubar 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad, añadir 500 l de PBS y centrifugar durante 6 minutos a 650 x g a temperatura ambiente. Descartar el sobrenadante. Nota: el procedimiento de tinción del fabricante recomienda un solo lavado, pero la reducción adicional de la tinción de fondo se puede lograr por repetir opcionalmente la etapa de lavado una o dos veces más. </li><li> Resuspender el sedimento celular en 500 l de PBS (o tampón posiblemente funcionamiento para la separación de proteínas, para reducir potencialmente la formación de grumos de células) y la transfiere a la citometría de flujo del tubo. Mantener las células en hielo. </li></ol></li><li> Aislamiento de células de nódulos linfáticos <ol><li> Anestesiar los ratones con una combinación de isoflurano (2% en carbógeno por minuto) y ketamina (100 mg / kg de peso corporal). </li><li> área de la incisión en húmedo con un 80% de isopropanol, y abrir el tórax longitudinalmente usando una tijera. Perfundir ratones intracardially de frío PBS pH 7,0 23. </li><li> Para aislar el ganglio linfático inguinal, retire con cuidado la piel en la región de la hip y recoger el ganglio linfático con cuidado del tejido graso con unas pinzas. Pesar el ganglio linfático inguinal y almacenar la muestra en PBS en hielo. Nota: Se utilizaron los ganglios linfáticos inguinales en nuestros estudios porque O&#39;Connor et al. encontraron que un alto número de monocitos activados, macrófagos, neutrófilos y células T estaban presentes en los ganglios linfáticos inguinales después de EAE inducción 24. </li><li> Exprimir el ganglio linfático a través de un tamiz de malla de 70 micras (colocado sobre un tubo de 50 ml) usando el émbolo de una jeringa de 2 ml. </li><li> Se lava la malla con 5 ml de PBS. Se centrifuga a 2.400 g durante 8 min. Resuspender el sedimento celular en 100 l 0,2% de BSA / PBS, añadir 2 l tampón de bloqueo FcRI y se incuba durante 15 min a TA en la oscuridad. </li><li> Añadir 13 l mezcla de anticuerpos, incubar 15 min a TA en la oscuridad, añadir 500 l de PBS y centrifugar durante 6 min a 650 xg a TA. </li><li> Descartar el sobrenadante, resuspender el sedimento celular en 300 l de PBS (o un tampón de desarrollo adecuado) y transferirloa un tubo de citometría de flujo. </li></ol></li><li> Aislamiento de células de la sangre <ol><li> Añadir 50 l de HEPES 20 mM a 50 l de sangre (estabilizado con EDTA) y añadir 500 l solución de lisis. Incubar durante 10 min a TA y añadir 500 l de PBS. Centrifugar durante 6 min a 650 xg a TA. Desechar el sobrenadante y repetir el paso de lavado. </li><li> Resuspender el sedimento celular en 100 l 0,2% de BSA / PBS, añadir 2 l tampón de bloqueo FcRI y se incuba durante 15 min a TA en la oscuridad. </li><li> Añadir 13 l mezcla de anticuerpos, incubar 15 min a TA en la oscuridad, añadir 500 l de PBS y centrifugar durante 6 min a 650 xg a TA. Descartar el sobrenadante, resuspender el sedimento celular en 300 l de PBS y transferirlo a la citometría de flujo del tubo. </li></ol></li><li> Aislamiento de células de la médula espinal <ol><li> Anestesiar los ratones con una combinación de isoflurano (2% en carbógeno por minuto) y ketamina (100 mg / kg de peso corporal). </li><li> área de la incisión en húmedo con un 80% de isopropanol y abrir el tórax longitudinalmentecon unas tijeras. Perfundir ratones intracardially de frío PBS pH 7,0 23. </li><li> Mojar el área de la incisión en la parte posterior y hacer de nuevo un corte longitudinal con un bisturí y quitar la piel. </li><li> Cortar la parte lumbar de la columna vertebral (que inerva las patas traseras) y tirar de la cadena con una jeringa llena de PBS para extraer la médula espinal. Cortar aproximadamente 1/3 del cordón lumbar, pesar de esto y almacenar la muestra en PBS en hielo. </li><li> Centrifugar a 250 xg durante 2 minutos a 4 ° C. Descartar el sobrenadante, añadir 500 l solución de desprendimiento de las células y HBSS (1: 1). Añadir 3 mg / ml de colagenasa A y 1 unidad / ml de DNasa I, decollate las células por repetido pipeteo arriba y abajo y se incuba durante 30 min con agitación a 37 ° C a 400 rpm. Nota: Si se prefiere, la suspensión de células se puede borrar de la contaminación de la mielina y los desechos celulares por centrifugación en gradiente de densidad que puede mejorar la sensibilidad de la citometría de flujo de medición, por lo tanto, la reducción de un fondo de autofluorescenciad el número de eventos que necesitan ser adquirida (ver sección 3.5). </li><li> Centrifugar a 250 xg durante 2 min a TA. Descartar el sobrenadante, resuspender el precipitado en 1 ml 10% de suero de ternera fetal (FCS) / medio de Dulbecco mínimo esencial (DMEM) y decollate las células de nuevo por repetido hacia arriba y abajo de pipeteado. </li><li> Centrifugar a 250 xg durante 2 min a TA. Repita el paso de lavado. </li><li> Resuspender el sedimento celular en 1 ml de PBS y exprimir la médula espinal a través de un tamiz de malla de 70 micras (colocado sobre un tubo de 50 ml) usando el émbolo de una jeringa de 2 ml. </li><li> Se lava la malla con 4 ml de PBS. Centrifugar a 1800 xg durante 3 min a TA. Descartar el sobrenadante, resuspender el sedimento celular en 100 l 0,2% de BSA / PBS, añadir 2 l FcRI reactivo de bloqueo e incubar durante 15 min a TA en la oscuridad. </li><li> Añadir 13 l mezcla de anticuerpos, incubar 15 min a TA en la oscuridad, añadir 500 l de PBS y centrifugar durante 6 min a 650 xg a TA. </li><li> Descartar el sobrenadante, resuspender el pelle celulart en 500 l de PBS (o un tampón de desarrollo adecuado) y transferirlo a la citometría de flujo del tubo. </li></ol></li></ol> 3. Análisis de citometría de flujo <ol><li> Valorar todos los anticuerpos de antemano para determinar las concentraciones óptimas como se describe por Olesch et al. 25. </li><li> Utilizar bolas de compensación de anticuerpos de captura de compensación de un solo color de crear matrices de compensación de varios colores según las instrucciones del fabricante. </li><li> Controlar la calibración del instrumento todos los días usando cuentas específicas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Directamente antes de la citometría de flujo medida, añadir 30 l de citometría de flujo estándar recuento absoluto de las células (para el aislamiento véase la sección 2.1, 2.2, 2.3, 2.4) para determinar el recuento de células absolutos. En lugar de utilizar las células contar bolas se pueden contar. </li><li> Toma de muestras (células de bazo, los ganglios linfáticos y sangre: 100.000 eventos, la médula espinal: 500.000 eventos) en un citómetro de flujo de unand analizar el uso de software específico de citometría de flujo. <ol><li> Abra el software de citometría de flujo y añadir FCS 3.0 archivos pulsando el botón &quot;añadir muestras&quot;. </li><li> Abra el archivo añadido haciendo doble clic. Ajustar los canales para las direcciones x y el eje y. Para seleccionar las poblaciones de células de interés crear una puerta (véase la figura 4). </li></ol></li></ol> 4. Análisis Cuantitativo PCR <ol><li> Aislamiento del ARNm y la transcripción en ADNc <ol><li> Extraer el ARNm de médula espinal lumbar (1/3), el bazo (1/8) y los ganglios linfáticos inguinales con fenol-cloroformo y precipitar con etanol 26. <ol><li> Para esto, homogeneizar el tejido en 1 mezcla de tiocianato de guanidinio-fenol ml, se incuba durante 10 min. Añadir 200 l de cloroformo y se incuba de nuevo durante 10 min. </li><li> Tras una etapa de centrifugación (18.000 xg durante 15 min a 4 ° C), se lava la fase acuosa superior es con isopropanol 500 l y se centrifuga (18.000 xg durante 4 min a 8DO). </li><li> Lavar el precipitado con 500 l de etanol y después de una etapa de centrifugación (18.000 xg durante 5 min a 4ºC), secar el precipitado en el concentrador de vacío (5 minutos a 30 ° C). A partir de entonces, resuspender el precipitado en 30 l de agua. </li></ol></li><li> Para extraer el mRNA a partir de sangre, de centrifugación 500 l de sangre EDTA estabilizado (300 xg 10 min 4 ° C). <ol><li> Tomar la capa leucocitaria, que contiene células blancas de la sangre, y se diluye en 1 ml de solución (mM NaHCO 150 mM NH 4 Cl, 100 3, 0,1 mM Na-EDTA pH 7,4) lisar. </li><li> Después de 10 min de incubación a RT, centrifugar las células a 650 xg durante 6 min y después se lava dos veces con PBS. </li><li> Extraer el ARNm de las células blancas de la sangre (glóbulos blancos) utilizando un kit para la extracción de ARN de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li></ol></li><li> Realizar la síntesis de cDNA utilizando un kit para síntesis de ADNc incluyendo hexámeros aleatorios de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Utilice 200 ng de ARNm para el CDNUna síntesis. </li></ol></li><li> Quantitative PCR <ol><li> Para cuantificar la cantidad de un ARNm específico, utilice 1 cDNA l, 1 M de cebador de avance / retroceso y un ADN fluorescente colorante de unión de acuerdo con las instrucciones del fabricante 27. Ver Tabla 1 para las secuencias para los conjuntos de cebadores. Medir las CT-valores de IL-1β, IL-6, IL-23, IFN, TNF y PPIA (peptidil prolil isomerasa) usando un sistema de PCR cuantitativa. </li><li> Para determinar la expresión relativa del mRNA utilizar el método comparativo CT (ciclo umbral) 27. <ol><li> Para esto, normalizar CT-valores de los genes diana a los niveles de expresión de PPIA restando la media CT-valor de PPIA del gen diana, como se describe en estudios previos (Barthelmes et al. 28, Schiffmann et al. 29, Schiffmann et al. 30). Posteriormente, el cálculo de los llamados ΔΔCT-valores, con el que, a normalizar los-valores Ctde los genes diana de ratones EAE al nivel de expresión de los genes diana de los ratones no tratados, de nuevo restando la media Ct-valor en los ratones sin tratar de la Ct-valor en los ratones EAE. </li><li> Para obtener la expresión de ARNm relativa del gen diana, calcular la relación utilizando la siguiente fórmula: 2 - ΔΔct. </li></ol></li></ol></li><li> Probar la especificidad de cada cebador. Determinar el tamaño de los fragmentos amplificados utilizando un gel de agarosa al 2% 31. El tamaño del fragmento se muestra en la Tabla 1. </li></ol>

MJP es consultor de Xellia y Leo Pharmaceuticals.

El modelo de EAE aquí descrito ha recibido la mayor atención como un modelo de MS y se usa rutinariamente en el ensayo de estrategias terapéuticas para MS 32. La enfermedad de ratón exhibe muchas características clínicas e histológicas de MS y es causado por la inducción de la autoinmunidad a los antígenos neuronales. La sensibilización a antígenos de mielina se asocia con disfunción hematoencefálica barrera y por lo tanto, infiltración de células inmunes en el SNC. Nuestros resultados muestran que células in...

La esclerosis múltiple (MS) y su modelo animal correspondiente, la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE), muestran cambios de neuroinflamación autoinmunes en el sistema nervioso central (SNC). Early lesiones de la EM y la EAE activos se caracterizan por la presencia de células inmunes infiltradas. La etiología de la EM se desconoce, pero se considera ampliamente implicar la destrucción de la mielina mediada por las células T autorreactivas. Estas células T autorreactivas secretan citoquinas pro-inflamatorias y quimiocinas que atraen otras células inmunes tales como células B, monocitos y neutrófilos de la circulación. Los monocitos se diferencian en macrófagos. El interferón gamma (IFN) secretado por las células T autorreactivas polariza los macrófagos en los macrófagos pro-inflamatorios. Las citoquinas pro-inflamatorias de liberación de los macrófagos y las especies reactivas de oxígeno que promueven la apoptosis en oligodendrocitos. La muerte de los oligodendrocitos conduce a la desmielinización. Además, las células B se diferencian en pLasma células y autoanticuerpos contra la liberación de la vaina de mielina, en última instancia resulta en la degradación de la mielina. La pérdida de la mielina conduce a la degradación de los axones y las neuronas y por lo tanto a la formación de sitios de lesión en el SNC cuales representan la principal característica de 1 MS. En la periferia, las células T y células B se activan en los ganglios linfáticos, que proliferan en el bazo y migran a través de la circulación en el sistema nervioso central. Los monocitos y neutrófilos proliferan en la médula ósea y también migran a través de la circulación en el sistema nervioso central. La extravasación de leucocitos desde la médula ósea, el bazo y los ganglios linfáticos en la sangre o de la circulación sanguínea en el SNC es un proceso de múltiples etapas que depende de varios factores, incluyendo las interacciones moleculares entre leucocitos y endotelio mediadas por quimiocinas y receptores de quimiocinas. La producción de quimiocinas por diversos tipos de células puede ser inducida durante la Reactio inmunen por citoquinas como factor de necrosis tumoral-α (TNF), IFN y la interleucina-6 (IL-6), que posteriormente se recluta células inmunitarias al sitio de la inflamación 2,3. Las células inmunes presentan un subconjunto de receptores de quimioquinas en su superficie, dependiendo del tipo celular y vía de migración al sitio de la inflamación. Por lo tanto, CXCR2, CCR1 y CXCR1 se expresan en los neutrófilos maduros de la médula ósea y la sangre 4, y la unión de sus ligandos, CXCL2, CCL5 o CXCL6, respectivamente, activa neutrófilos y promueve su adherencia al endotelio y, posteriormente, la migración de las células en los tejidos 5-9. CCL2 y CCL20 atraen monocitos y células Th1 / Th17 10, que expresan CCR2 11 y CCR6 12, respectivamente. CCR1 y CCR5, expresada por diferentes tipos de células, incluyendo las células T, monocitos y macrófagos 13, se unen CCL3, CCL5 y CCL7 y se upregulated durante MS 14. CXCR3 se expresa en las células T y se une CCL9, CCL10 yCCL11 15. Una estrategia principal en el tratamiento de MS es el agotamiento de las células inmunes o la prevención de la infiltración de células inmunes en el SNC. Por lo tanto, el bloqueo de los receptores de quimiocinas específicos ha sido investigado en EAE. El antagonismo o la eliminación genética de CCR1 16, CCR2 17, CCR7 18 o CXCR2 19 reduce la patología EAE, mientras que el antagonismo o la eliminación genética de CCR1 20, CCR5 20 o CXCR3 21 no redujo la patología. Por lo tanto, la expresión de receptores específicos de quimioquinas en leucocitos es crucial para la infiltración de este último en el SNC y dicta el curso de la EAE. El agotamiento de las células inmunes es una estrategia de tratamiento eficaz para los pacientes con EM, porque las células inmunes infiltradas liberan citoquinas, tales como TNF, IL-6 y IL-1β, que, a su vez, promueve el proceso inflamatorio o la degradación de las neuronas 22. Además, auto-Las células Th1 reactivas liberan IFN, que a su vez estimula los macrófagos para liberar TNF, IL-1β y IL-23. Este manuscrito describe la inducción de la EAE, la determinación de la distribución de las células inmunes y los niveles de citoquinas (ARNm) en diversos tejidos en ratones EAE. Las células se aislaron en diferentes momentos durante el curso de la enfermedad para proporcionar una visión general dependiente del tiempo de los procesos inflamatorios que finalmente conducen a la formación de lesiones en el SNC.

<table><tbody><tr><td>Sistema de detección de secuencia ABI Prism 7500&nbsp;</td><td>Applied Biosystems, Austin, EE. UU.</td><td></td><td>sistema de PCR cuantitativo</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma Aldrich Múnich, Alemania</td><td>A6964</td><td>solución de desprendimiento de células</td></tr><tr><td>CD3-PE-CF594</td><td>BD, Heidelberg, Alemania</td><td>562286</td><td></td></tr><tr><td>CD4-V500</td><td>BD, Heidelberg, Alemania</td><td>560782</td><td></td></tr><tr><td>CD8-eFluor650</td><td>eBioscience, Frankfurt, Alemania</td><td>95-0081-42</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-eFluor605</td><td>eBioscience, Frankfurt, Alemania</td><td>93-0112-42</td><td></td></tr><tr><td>CD11c-AlexaFluor700</td><td>BD, Heidelberg, Alemania</td><td>560583</td><td></td></tr><tr><td>CD19-APC-H7&nbsp;</td><td>BD, Heidelberg, Alemania</td><td>560143</td><td></td></tr><tr><td>CD45-Vioblue&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania</td><td>130-092-910</td><td></td></tr><tr><td>CompBeads</td><td>BD, Heidelberg, Alemania</td><td>552843</td><td>perlas de compensación</td></tr><tr><td>Colagenasa A</td><td>Sigma Aldrich Múnich, Alemania</td><td>C0130</td><td></td></tr><tr><td>Estándar de recuento absoluto citométrico&nbsp;</td><td>Polyscience, Eppelheim, Alemania</td><td>BLI-580-10</td><td></td></tr><tr><td>Configuración del citómetro y perlas de seguimiento&nbsp;</td><td>BD, Heidelberg, Alemania</td><td>642412</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma Aldrich Munich, Alemania</td><td>D5025</td><td></td></tr><tr><td>EAE Kit</td><td>Hooke Laboratories, Lawrence, EE. UU</td>. <td>EK2110</td><td></td></tr><tr><td>F4/80-PE-Cy7&nbsp;</td><td>BioLegend, Fell, Alemania</td><td>123114</td><td></td></tr><tr><td>primer kit de síntesis de ADNc de hebras&nbsp;</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Alemania</td><td>Tampón de bloqueo del receptor 1 K1612</td><td></td></tr><tr><td>Fc&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>Estándar de recuento absoluto por citometría de flujo</td><td>Polyscience, Eppelheim, Alemania</td><td>580</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo software v10&nbsp;</td><td>Treestar, Ashland, EE. UU</td><td></td>. <td>SOFTWARE DE CITOMETRÍA DE FLUJO</td></tr><tr><td>LSRII/Fortessa&nbsp;</td><td>BD, Heidelberg, Alemania</td><td></td><td>citómetro de flujo</td></tr><tr><td>Ly6G-APC-Cy7&nbsp;</td><td>BD, Heidelberg, Alemania</td><td>560600</td><td></td></tr><tr><td>Solución de lisis&nbsp;</td><td>BD, Heidelberg, Alemania</td><td>349202</td><td></td></tr><tr><td>Maxima SYBR Green&nbsp;</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Alemania</td><td>K0221</td><td>tinte fluorescente de unión al ADN&nbsp;</td></tr><tr><td>Mini kit RNeasy&nbsp;</td><td>Qiagen, Hilden, Alemania</td><td>74104</td><td>Kit de extracción de ARN</td></tr></tbody></table>

la inducción de la encefalomielitis autoinmune experimental en ratones y evaluación de la distribución de la enfermedad dependiente de las células inmunes en diversos tejidos

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

La esclerosis múltiple se presume que es una enfermedad autoinmune inflamatoria, que se caracteriza por la formación de lesiones en el sistema nervioso central (CNS) que resulta en el deterioro cognitivo y motor. la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es un modelo animal útil de la EM, debido a que también se caracteriza por la formación de lesiones en el SNC, el deterioro motor y también es impulsado por reacciones autoinmunes e inflamatorias. Uno de los modelos de EAE se induce con un péptido derivado de la proteína de mielina de oligodendrocitos (MOG) 35 a 55 en ratones. Los ratones con EAE desarrollar un curso de la enfermedad progresiva. Este curso se divide en tres fases: la fase preclínica (día 0 - 9), la aparición de la enfermedad (día 10 - 11) y la fase aguda (día 12 - 14). MS y EAE son inducidas por las células T autorreactivas que se infiltran en el SNC. Estas células T secretan citocinas y quimiocinas que conducen al reclutamiento de más células inmunes. Por lo tanto, la distribución de células inmunes en la médula espinal durante las tres fases de la enfermedad fue investigada. Para poner de relieve el punto de la enfermedad a la que empieza la activación / proliferación / acumulación de células T, células B y monocitos tiempo, se evaluó también la distribución de células inmunes en los nódulos linfáticos, el bazo y la sangre. Además, se determinaron los niveles de varias citoquinas (IL-1, IL-6, IL-23, TNF, IFN) en las tres fases de la enfermedad, para profundizar en los procesos inflamatorios de la enfermedad. En conclusión, los datos proporcionan una visión general del perfil funcional de células inmunes durante la patología EAE.

La figura 1 muestra una visión esquemática de los diferentes métodos que se describen en este artículo. 1) Los ratones reciben una inyección de antígeno MOG 35-55 y desarrollar síntomas clínicos iniciales después de 10.7 ± 0.3 los días 28. Un curso de la enfermedad representante de ratones EAE se muestra en la Figura 1. 2) Los varios tejidos (bazo, los ganglios linfáticos, la médula espin...

Este manuscrito describe los métodos para la inducción y puntuación del modelo experimental de encefalomielitis autoinmune (EAE), junto con la evaluación de la distribución de células inmunitarias y los niveles de citocinas de ARNm en ganglios linfáticos, bazo, sangre y médula espinal mediante citometría de flujo y PCR cuantitativa, respectivamente, en varias fases de la enfermedad.

La inducción de la encefalomielitis autoinmune experimental en ratones y evaluación de la distribución de la enfermedad dependiente de las células inmunes en diversos tejidos

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

El objetivo general del modelo de encefalomielitis autoinmune experimental o EAE es facilitar el estudio de los posibles mecanismos moleculares que subyacen al desarrollo de la esclerosis múltiple. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la esclerosis múltiple, como, ¿en qué etapa de la enfermedad infiltran las células inmunitarias el sistema nervioso central? La principal ventaja de esta técnica es que el modelo EAE imita muchas de las características principales de la esclerosis múltiple, tales como la desmielinización y la infiltración de células inmunitarias.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento de la esclerosis múltiple porque los fármacos probados con este método ya han sido aprobados para esta enfermedad. En general, las personas nuevas en este método tendrían dificultades porque existen condiciones detalladas que deben tenerse en cuenta al inducir la EAE. Los ratones deben mantenerse en un entorno libre de estrés, y la toxina pertúsica debe prepararse recientemente.La demostración oficial de este método es fundamental, ya que el aislamiento de los ganglios linfáticos y la extracción de la médula espinal son difíciles de aprender únicamente mediante descripción. Comience inyectando por vía subcutánea en ratones hembra de 10 a 13 semanas de edad 200 microgramos de glicoproteína oligodendrocítica de mielina, emulsionados en 200 microlitros de adyuvante completo de Freund, que contiene 400 microgramos de Mycobacterium tuberculosis.Inmediatamente y 24 horas después, inyecte a los ratones por vía intraperitoneal 0,2 microgramos de toxina de la pertussis en 200 microlitros de PBS. Es fundamental que los ratones hayan sido adaptados tanto al manejo como al entorno experimental antes de la inducción de la EAE, con el fin de reducir el estrés, el cual puede impedir el desarrollo de síntomas clínicos. Una semana después de la inyección, examine diariamente a los ratones en busca de síntomas clínicos, tal como se describe en la tabla.Para evaluar la población de células inmunitarias de los ganglios linfáticos inducidos por EAE, en el momento adecuado tras la inducción, humedezca el área de incisión con isopropanol al 80% y retire cuidadosamente la piel de la región de la cadera. Usando pinzas, extraiga cuidadosamente el ganglio linfático inguinal del tejido adiposo. Luego pese el ganglio y coloque la muestra en PBS sobre hielo.Para analizar las células de la médula espinal, humedezca la parte posterior del animal con isopropanol y use un escalpelo para realizar un corte longitudinal a lo largo de la columna vertebral. Luego retire la piel y diseque la porción lumbar de la columna vertebral, que inerva las extremidades traseras. Lave la columna vertebral con una jeringa llena de PBS para extraer la médula espinal.Después de retirar aproximadamente 1/3 de la médula lumbar, pese el fragmento espinal y almacene el tejido en PBS sobre hielo. Para analizar la población de células inmunitarias del bazo, abra el tejido para acceder a la parte inferior del abdomen. A continuación, retire el bazo y corte aproximadamente 1/8 del tejido.Pese el fragmento de bazo y almacene el tejido en PBS sobre hielo. Luego, utilice el émbolo de una jeringa de dos mL para macerar el resto del tejido a través de un tamiz de malla de 70 micrones colocado sobre un tubo de 50 mililitros, seguido de un lavado del colador con cinco mililitros de PBS. Centrifugue las células filtradas.Re-suspender el precipitado en 500 microlitros de tampón de lisis celular y transferir las células a un tubo de 1,5 mililitros. Después de 10 minutos a temperatura ambiente, lavar las células dos veces con 500 microlitros de PBS. Tras el segundo lavado, re-suspender el precipitado en 100 microlitros de BSA al 0,2 % en PBS y añadir dos microlitros de tampón bloqueante del receptor Fc uno a las células.Después de 15 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente, marque las células con 13 microlitros de cóctel de anticuerpos durante otros 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Al final de la incubación, lave las células al menos dos veces en 500 microlitros de PBS, y resuspenda el pellet final en 500 microlitros de PBS fresco. Luego transfiera las células a un tubo para citometría de flujo sobre hielo.Finalmente, para analizar las muestras mediante citometría de flujo, justo antes de la medición en citometría de flujo, agregue 30 microlitros de estándar de recuento absoluto para citometría de flujo a las células para determinar los recuentos absolutos de células. Luego analice las muestras en el citómetro de flujo. Como ilustra esta figura, se observa un aumento transitorio en todas las poblaciones de células inmunitarias dentro de los ganglios linfáticos durante la fase aguda de la inducción de EAE.En el bazo, sin embargo, solo los macrófagos, células B, células T y neutrófilos muestran una infiltración aumentada. En la sangre, todas las poblaciones de células inmunitarias muestran un aumento transitorio en su circulación periférica durante la fase preclínica, lo que corresponde a un aumento similar dependiente de la enfermedad en la médula espinal lumbar durante la fase aguda de la enfermedad, excluyendo a la población de monocitos, que presumiblemente se diferencian en macrófagos tras ingresar a la médula espinal. Aquí se muestra la estrategia de selección para la evaluación de las diferentes poblaciones celulares.Los números de células están relacionados con la cantidad de tejido o volumen sanguíneo analizado, reflejando el recuento absoluto de células. En los ganglios linfáticos, la expresión de ARNm de IL-23 aumenta durante la fase preclínica, mientras que la expresión de IL-6 aumenta de manera dependiente de la enfermedad. En el bazo, la expresión de IL-6 y IL-23 aumenta en la fase preclínica, mientras que la expresión de ARNm de IL-1 beta no se ve afectada hasta el inicio de la enfermedad.En la sangre, la expresión del ARNm de solo la TNF-alfa se incrementa y de manera dependiente de la enfermedad. En la médula espinal lumbar, la TNF-alfa, la IL-1 beta y el interferón gamma se inducen durante la fase aguda, mientras que la IL-6 se incrementa únicamente durante la fase de inicio de la enfermedad. Una vez dominado, el modelo de EAE, el aislamiento celular subsiguiente y el análisis de efectos pueden completarse en ocho horas para diez ratones si se realizan adecuadamente.Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el Western Blot o el ELISA para confirmar los resultados del análisis de expresión de ARNm. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la esclerosis múltiple exploraran el mecanismo de desmielinización en el sistema nervioso central. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo inducir el modelo de EAE y cómo aislar células inmunitarias para obtener resultados reproducibles de citometría de flujo.No olvide que trabajar con el adyuvante completo de Freund puede ser extremadamente peligroso, y se deben tomar precauciones como levantar la piel del ratón y asegurar una penetración completa de la piel mediante la jeringa durante la realización de este procedimiento.

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La inducción de la encefalomielitis autoinmune experimental en ratones y evaluación de la distribución de la enfermedad dependiente de las células inmunes en diversos tejidos (Video) | JoVE Journal

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