La inducción de la encefalomielitis autoinmune experimental en ratones y evaluación de la distribución de la enfermedad dependiente de las células inmunes en diversos tejidos
8 de mayo de 2016
Este manuscrito describe los métodos para la inducción y puntuación del modelo experimental de encefalomielitis autoinmune (EAE), junto con la evaluación de la distribución de células inmunitarias y los niveles de citocinas de ARNm en ganglios linfáticos, bazo, sangre y médula espinal mediante citometría de flujo y PCR cuantitativa, respectivamente, en varias fases de la enfermedad.
El objetivo general del modelo de encefalomielitis autoinmune experimental o EAE es facilitar el estudio de los posibles mecanismos moleculares que subyacen al desarrollo de la esclerosis múltiple. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la esclerosis múltiple, como, ¿en qué etapa de la enfermedad infiltran las células inmunitarias el sistema nervioso central? La principal ventaja de esta técnica es que el modelo EAE imita muchas de las características principales de la esclerosis múltiple, tales como la desmielinización y la infiltración de células inmunitarias.
Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento de la esclerosis múltiple porque los fármacos probados con este método ya han sido aprobados para esta enfermedad. En general, las personas nuevas en este método tendrían dificultades porque existen condiciones detalladas que deben tenerse en cuenta al inducir la EAE. Los ratones deben mantenerse en un entorno libre de estrés, y la toxina pertúsica debe prepararse recientemente.
La demostración oficial de este método es fundamental, ya que el aislamiento de los ganglios linfáticos y la extracción de la médula espinal son difíciles de aprender únicamente mediante descripción. Comience inyectando por vía subcutánea en ratones hembra de 10 a 13 semanas de edad 200 microgramos de glicoproteína oligodendrocítica de mielina, emulsionados en 200 microlitros de adyuvante completo de Freund, que contiene 400 microgramos de Mycobacterium tuberculosis.
Inmediatamente y 24 horas después, inyecte a los ratones por vía intraperitoneal 0,2 microgramos de toxina de la pertussis en 200 microlitros de PBS. Es fundamental que los ratones hayan sido adaptados tanto al manejo como al entorno experimental antes de la inducción de la EAE, con el fin de reducir el estrés, el cual puede impedir el desarrollo de síntomas clínicos. Una semana después de la inyección, examine diariamente a los ratones en busca de síntomas clínicos, tal como se describe en la tabla.
Para evaluar la población de células inmunitarias de los ganglios linfáticos inducidos por EAE, en el momento adecuado tras la inducción, humedezca el área de incisión con isopropanol al 80% y retire cuidadosamente la piel de la región de la cadera. Usando pinzas, extraiga cuidadosamente el ganglio linfático inguinal del tejido adiposo. Luego pese el ganglio y coloque la muestra en PBS sobre hielo.
Para analizar las células de la médula espinal, humedezca la parte posterior del animal con isopropanol y use un escalpelo para realizar un corte longitudinal a lo largo de la columna vertebral. Luego retire la piel y diseque la porción lumbar de la columna vertebral, que inerva las extremidades traseras. Lave la columna vertebral con una jeringa llena de PBS para extraer la médula espinal.
Después de retirar aproximadamente 1/3 de la médula lumbar, pese el fragmento espinal y almacene el tejido en PBS sobre hielo. Para analizar la población de células inmunitarias del bazo, abra el tejido para acceder a la parte inferior del abdomen. A continuación, retire el bazo y corte aproximadamente 1/8 del tejido.
Pese el fragmento de bazo y almacene el tejido en PBS sobre hielo. Luego, utilice el émbolo de una jeringa de dos mL para macerar el resto del tejido a través de un tamiz de malla de 70 micrones colocado sobre un tubo de 50 mililitros, seguido de un lavado del colador con cinco mililitros de PBS. Centrifugue las células filtradas.
Re-suspender el precipitado en 500 microlitros de tampón de lisis celular y transferir las células a un tubo de 1,5 mililitros. Después de 10 minutos a temperatura ambiente, lavar las células dos veces con 500 microlitros de PBS. Tras el segundo lavado, re-suspender el precipitado en 100 microlitros de BSA al 0,2 % en PBS y añadir dos microlitros de tampón bloqueante del receptor Fc uno a las células.
Después de 15 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente, marque las células con 13 microlitros de cóctel de anticuerpos durante otros 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Al final de la incubación, lave las células al menos dos veces en 500 microlitros de PBS, y resuspenda el pellet final en 500 microlitros de PBS fresco. Luego transfiera las células a un tubo para citometría de flujo sobre hielo.
Finalmente, para analizar las muestras mediante citometría de flujo, justo antes de la medición en citometría de flujo, agregue 30 microlitros de estándar de recuento absoluto para citometría de flujo a las células para determinar los recuentos absolutos de células. Luego analice las muestras en el citómetro de flujo. Como ilustra esta figura, se observa un aumento transitorio en todas las poblaciones de células inmunitarias dentro de los ganglios linfáticos durante la fase aguda de la inducción de EAE.
En el bazo, sin embargo, solo los macrófagos, células B, células T y neutrófilos muestran una infiltración aumentada. En la sangre, todas las poblaciones de células inmunitarias muestran un aumento transitorio en su circulación periférica durante la fase preclínica, lo que corresponde a un aumento similar dependiente de la enfermedad en la médula espinal lumbar durante la fase aguda de la enfermedad, excluyendo a la población de monocitos, que presumiblemente se diferencian en macrófagos tras ingresar a la médula espinal. Aquí se muestra la estrategia de selección para la evaluación de las diferentes poblaciones celulares.
Los números de células están relacionados con la cantidad de tejido o volumen sanguíneo analizado, reflejando el recuento absoluto de células. En los ganglios linfáticos, la expresión de ARNm de IL-23 aumenta durante la fase preclínica, mientras que la expresión de IL-6 aumenta de manera dependiente de la enfermedad. En el bazo, la expresión de IL-6 y IL-23 aumenta en la fase preclínica, mientras que la expresión de ARNm de IL-1 beta no se ve afectada hasta el inicio de la enfermedad.
En la sangre, la expresión del ARNm de solo la TNF-alfa se incrementa y de manera dependiente de la enfermedad. En la médula espinal lumbar, la TNF-alfa, la IL-1 beta y el interferón gamma se inducen durante la fase aguda, mientras que la IL-6 se incrementa únicamente durante la fase de inicio de la enfermedad. Una vez dominado, el modelo de EAE, el aislamiento celular subsiguiente y el análisis de efectos pueden completarse en ocho horas para diez ratones si se realizan adecuadamente.
Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el Western Blot o el ELISA para confirmar los resultados del análisis de expresión de ARNm. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la esclerosis múltiple exploraran el mecanismo de desmielinización en el sistema nervioso central. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo inducir el modelo de EAE y cómo aislar células inmunitarias para obtener resultados reproducibles de citometría de flujo.
No olvide que trabajar con el adyuvante completo de Freund puede ser extremadamente peligroso, y se deben tomar precauciones como levantar la piel del ratón y asegurar una penetración completa de la piel mediante la jeringa durante la realización de este procedimiento.
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Descripción general
Este manuscrito describe los métodos para la inducción y puntuación del modelo de encefalomielitis autoinmune experimental (EAE). También abarca la evaluación de la distribución de células inmunitarias y los niveles de citocinas en ARNm en diversos tejidos mediante citometría de flujo y PCR cuantitativa.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Inmunología
- Autoinmunidad
Antecedentes
- El modelo EAE se utiliza para estudiar la esclerosis múltiple.
- Este imita características clave de la enfermedad, como la desmielinización.
- Comprender la infiltración de células inmunitarias es fundamental para el desarrollo de terapias.
- Las condiciones adecuadas son esenciales para una inducción exitosa del EAE.
Objetivo del estudio
- Investigar los mecanismos moleculares de la esclerosis múltiple.
- Determinar el momento de la infiltración de células inmunitarias en el sistema nervioso central.
- Evaluar la eficacia de terapias potenciales para la esclerosis múltiple.
Métodos Utilizados
- Inducción de la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE).
- Citometría de flujo para la evaluación de la distribución de células inmunitarias.
- PCR cuantitativa para medir los niveles de citocinas en mRNA.
- Análisis en diversas fases de la enfermedad.
Resultados principales
- Caracterización de la distribución de células inmunitarias en ganglios linfáticos, bazo, sangre y médula espinal.
- Cuantificación de los niveles de ARNm de citocinas en diferentes etapas de la enfermedad.
- Información sobre el momento de las respuestas inmunitarias durante la progresión de la EAE.
- Validación del modelo de EAE como una herramienta confiable para la investigación de la esclerosis múltiple.
Conclusiones
- El modelo EAE es eficaz para estudiar los mecanismos de la esclerosis múltiple.
- Los hallazgos contribuyen a comprender la dinámica de las células inmunitarias en la enfermedad.
- Los resultados podrían orientar estrategias terapéuticas para la esclerosis múltiple.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El modelo EAE proporciona una plataforma mecanicista para investigar las vías autoinmunes en la esclerosis múltiple, permitiendo la validación de objetivos mediante el perfilado de células inmunitarias y la dinámica de citoquinas. Al mapear la infiltración inmunitaria temporal en diferentes tejidos, el método apoya la reducción de riesgos preclínicos de candidatos inmunomoduladores. Esto facilita decisiones basadas en datos de avance o detención en las líneas de descubrimiento de fármacos para enfermedades neuroinflamatorias.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar el tráfico de linfocitos T, linfocitos B y monocitos para identificar los factores que impulsan la inflamación del SNC.
- Valor operativo: El aislamiento estandarizado de células inmunitarias de ganglios linfáticos, bazo, sangre y médula espinal favorece ensayos de interacción con el blanco reproducibles.
- Valor predictivo: La cuantificación del ARNm de citocinas (IL-6, IL-23, TNF-α, IFN-γ, IL-1β) en distintas fases de la enfermedad orienta la selección de biomarcadores para la reducción de riesgos mecanicistas.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Listo para el ensayo: Los protocolos de citometría de flujo con estándares de conteo absoluto permiten el perfilado cuantitativo de células inmunitarias para la estandarización de ensayos.
- Reproducibilidad: Las fases definidas de la enfermedad (preclínica, inicio, aguda) proporcionan ventanas temporales para un monitoreo inmunitario consistente durante la evaluación de compuestos.
- Escalabilidad: Los flujos de trabajo de procesamiento de tejidos (maceración del bazo, lavado de la médula espinal) permiten el análisis por lotes de poblaciones inmunitarias en estudios preclínicos.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: La distribución de células inmunitarias en la médula espinal refleja la patología del SNC, lo que permite correlacionar biomarcadores periféricos con la interacción con el objetivo.
- Continuidad traslacional: La cinética de expresión de citocinas en sangre y tejidos linfoides aporta información para modelar predictivamente los efectos del fármaco sobre el tráfico inmunitario.
- Reducción de riesgos: El perfil inmunitario longitudinal reduce la ambigüedad mecanicista durante la optimización de fármacos candidatos para indicaciones neuroinflamatorias.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El modelo EAE se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento al proporcionar lecturas de fenotipos mediados por el sistema inmunitario entre las etapas de validación del objetivo y optimización del fármaco líder.
- Biología del Descubrimiento: Permite la comprobación de hipótesis sobre mecanismos autoinmunes mediante el seguimiento temporal de células inmunitarias en órganos linfoides secundarios y en el sistema nervioso central.
- Selección: Rendimientos estandarizados de células inmunitarias provenientes del bazo y ganglios linfáticos facilitan la selección de alto rendimiento mediante citometría de flujo de inmunomoduladores.
- Análisis: Las cuentas absolutas de células y los niveles de citocinas en mRNA proporcionan resultados cuantitativos para comparar los efectos del tratamiento en distintas fases de la enfermedad.
- Investigación Traducional: La correlación de células inmunitarias desde la sangre hasta la médula espinal apoya la progresión basada en biomarcadores, desde el descubrimiento hasta estudios preclínicos de eficacia.
- Reutilización Empresarial: Los procedimientos operativos estándar para la inducción de EAE y la recolección de tejidos permiten su reutilización entre proyectos en programas de enfermedades autoinmunes.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de dianas autoinmunes mediante perfiles inmunitarios longitudinales.
- Valor operativo: Protocolos estandarizados de procesamiento de tejidos y citometría de flujo garantizan una cuantificación inmunitaria reproducible entre diferentes centros.
- Valor estratégico: La identificación temprana de biomarcadores inmunitarios mejora la eficiencia del capital al reducir riesgos en candidatos antes de realizar estudios costosos de penetración en el sistema nervioso central.
- Impacto en la cartera: Los datos de cinética inmunitaria permiten la priorización ajustada al riesgo de inmunomoduladores basada en evidencia de interacción con la diana.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de roedores, disección quirúrgica de tejidos y citometría de flujo para garantizar la integridad de las muestras.
- Depende de la preparación estéril del adyuvante completo de Freund y de la toxina pertúsica para una inducción constante de la enfermedad.
- Necesita una cronometría estandarizada en la recolección de tejidos en relación con la puntuación clínica para alinear los datos inmunitarios con las fases de la enfermedad.
- Requiere infraestructura de citometría de flujo con capacidades de conteo absoluto para una cuantificación precisa de células inmunitarias.
- Se ve limitado por la variabilidad entre animales en el inicio de la enfermedad, lo que exige un análisis estadístico basado en cohortes para obtener conclusiones robustas.
