Mapeo de la densidad absoluta de ADN en núcleos celulares mediante microscopía de localización de una sola molécula

El presente método permite mediciones de densidad absoluta de ADN en núcleos celulares para investigar las restricciones espaciales en las estructuras de cromatina que de otro modo solo se caracterizan por modificaciones de histonas posteriores a la traducción. La teselación de Voronoi combinada con SMLM permite estimaciones de densidad absoluta del ADN en términos de par de bases por micrómetro cuadrado. El único conocimiento a priori necesario es el contenido total de ADN del núcleo celular medido.

En futuros experimentos, sería interesante investigar si las diferencias absolutas de densidad se correlacionan con la información biológica de otros métodos, como la inmunofluorescencia de las modificaciones epigenéticas o los datos de Hi-C. Comience reconstruyendo el área escaneada colocando en mosaico las imágenes individuales pregrabadas. Abra CellProfiler y, a continuación, cargue la canalización cellcycleanalysis.cpproj.

En las imágenes del primer paso de la canalización, arrastre y suelte las imágenes, incluida la imagen de referencia. A continuación, defina una ubicación donde se almacenarán las imágenes de referencia. Luego haga clic en el icono Iniciar modo de prueba seguido de Ejecutar.

Una vez que se muestra el histograma de los núcleos en la imagen a analizar, determine los intervalos de intensidad para las fases G1, S y G2, y asegúrese de que se ingresen en los pasos posteriores del objeto de filtro de la tubería y que estos pasos estén activos. A continuación, haga clic en el botón Ejecutar de nuevo para continuar con la segunda mitad de la canalización. Mire las tres imágenes con las superposiciones que representan las diferentes etapas del ciclo celular, G1, S o G2, y seleccione los núcleos en G1 o G2 para obtener más imágenes para que se conozca la cantidad de ADN en los pares de bases de los núcleos de la imagen.

Reubique las células en el microscopio de localización de molécula única y asegure el parpadeo adecuado del proceso FPALM. Primero, grabe una pila 3D del núcleo elegido solo usando 500 cuadros por corte. Esto permite determinar la cantidad relativa de ADN en la sección media, que luego se visualiza con muchos más fotogramas para revelar su ultraestructura.

Comience la adquisición de la serie de imágenes utilizando un tiempo de exposición de 50 milisegundos, lo que da como resultado una velocidad de fotogramas de aproximadamente 20 fotogramas por segundo. Tome una pila Z a través del núcleo con intervalos de paso de 200 nanómetros y solo 500 cuadros por sección óptica de luz. Después de adquirir la pila, regrese a la posición z inicial y adquiera el conjunto de datos principal de 50, 000 fotogramas con el mismo tiempo de exposición de 50 milisegundos.

Abra el conjunto de datos FPALM en ImageJ. Para optimizar la configuración para la detección de señales parpadeantes, haga clic en ThunderSTORM, luego en Ejecutar análisis. Ahora, elija Configuración de la cámara.

Introduzca el tamaño de píxel correcto de los datos de la imagen, el recuento A/D, la eficiencia cuántica de la cámara utilizada, el nivel base y la ganancia EM y, a continuación, haga clic en Aceptar. Elija el algoritmo para determinar las coordenadas de localización ajustando las señales parpadeantes. En la sección Filtrado de imágenes, utilice el filtro Wavelet B-Spline con un B-Spline de orden 3 y una escala B-Spline 2. A continuación, establezca el Método de localización aproximada de moléculas en Máximo local, establezca el Umbral de intensidad máxima y la Conectividad en 8-vecindad.

En la sección Localización de moléculas de subpíxeles, como Método, elija PSF integrado gaussiano, establezca Radio de ajuste px en 3, seleccione Método de ajuste como Máxima verosimilitud y establezca Sigma inicial en 1.6. Luego haga clic en Aceptar para iniciar la detección de las señales y la reconstrucción de la imagen. Si la adquisición se divide en diferentes pilas de imágenes, concatene las tablas de localización en ThunderSTORM.

Para hacerlo, haga clic en Importar en la ventana emergente. Asegúrese de que la opción Anexar a la tabla actual esté activada y de que se utilice el número inicial correcto para evitar anular las localizaciones de la tabla. Luego seleccione la ruta del archivo y haga clic en Aceptar para importar un archivo tras otro.

Para evitar el recuento excesivo de señales en fotogramas consecutivos, combine los datos de localización utilizando una distancia máxima de 20 nanómetros, 1 fotograma máximo fuera y 0 fotogramas máximos por molécula y, a continuación, haga clic en Combinar. Para medir y corregir la deriva mediante subsecciones de datos de correlación cruzada, abra el menú Corrección de desviación y haga clic en las flechas. Agregue 3 contenedores y establezca la ampliación en 5.

Luego haga clic en Aplicar y aparecerá la ventana que muestra la deriva x e y. Para determinar la cantidad de señal que es proporcional al contenido de ADN en cada segmento de la pila 3D pregrabada con 500 fotogramas para cada corte, elija Plugins, luego ThunderSTORM, seguido de Importar/Exportar, e importe la tabla de resultados para el primer segmento de la pila. Para evitar el recuento excesivo de señales de otros planos de imagen de la pila 3D, es necesario eliminar las señales de fuera del intervalo de paso de 200 nanómetros en z entre los cortes.

Pulse Trazar histograma y, en el cuadro de diálogo Distribución abierto, elija z y pulse OK. Determine la posición del pico y use el campo de filtro para seleccionar las señales con un tamaño de paso óptico de 200 nanómetros. Haga clic en Visualización y elija la opción Histogramas, luego haga clic en Aceptar. Guarde la imagen resultante en una carpeta en formato TIFF. Abra todos los sectores y combínelos usando Imagen seguido de Pilas y luego Imágenes para apilar.

Después de seleccionar toda el área de la imagen, vaya a Analizar, haga clic en Herramientas y seleccione el Administrador de ROI. Haga clic en Agregar, luego haga clic en Analizar, seguido de Establecer medidas y seleccione Densidad integrada. Ahora, elija la opción Más, seleccione Multi Measure, marque Measure all stacks y One row per slice.

Haga clic en Aceptar y aparecerán los resultados. La suma de las intensidades de todos los cortes es proporcional al contenido de ADN de todo el núcleo de la misma manera que las intensidades de los cortes individuales son proporcionales a su fracción de todo el genoma. Después de abrir la tabla de resultados del plano central que contiene las señales de 50, 000 cuadros, fíltrela hasta un grosor de 100 nanómetros.

Cree el histograma de las señales resultantes como se demostró anteriormente y mida la densidad integrada de la sección central. Convierta la gran tabla de localización de ThunderSTORM que contiene la información ultraestructural de la sección central del formato csv al formato ORTE ejecutando el script de MATLAB TS2orte. m, que transforma la tabla de localización en una matriz de MATLAB y la guarda en el formato mat.

Vaya a la carpeta LAND-voronoi y, en la subcarpeta coreAlgorithm, abra el archivo voronoicluster. m y ajustar el contenido de ADN, la fracción de la sección central observada de toda la fracción del núcleo ADN y las localizaciones, y el factor de conversión de acuerdo con el tipo de célula utilizada y la etapa del ciclo celular para los cálculos de densidad absoluta. Edite el script que inicia el análisis voronoi.m.

Ajuste la ruta del archivo a los datos de localización de orte y la carpeta de salida de los archivos de resultados. Especifique las coordenadas que definen el área en la que se debe realizar la teselación. Defina varias áreas para calcular dentro del mismo dataset de entrada.

Después de ejecutar el script, busque la imagen que muestra las densidades absolutas de ADN junto con otros archivos que contienen gráficos que muestran el histograma de la distribución del área y las densidades. m que contiene las densidades de cada celda de Voronoi calculada en la carpeta de salida. La medición de FPALM que consta de 50.000 fotogramas dio como resultado 2,68 veces 10 a la potencia de 6 localizaciones detectadas dentro de una sección media de 100 nanómetros de espesor.

La precisión de localización de la imagen reconstruida fue de 10 nanómetros. El gran número de localizaciones permitió la combinación de imágenes de superresolución al tiempo que mostraba densidades absolutas de ADN. Era evidente que las densidades de ADN medidas no se distribuían uniformemente por el núcleo y cubrían un amplio rango dinámico.

Los aumentos más altos de áreas dentro del núcleo que muestran células de Voronoi más grandes indicaron bajas densidades de ADN, mientras que las células más pequeñas indicaron altas densidades de ADN. Las densidades de ADN medidas en un medio núcleo G1C3H10T mostraron la distribución absoluta de la densidad del ADN dentro del núcleo de un tipo y especie diferentes. Aunque la organización básica se parecía al núcleo G1 HeLa temprano, también poseía grupos constitutivos de heterocromatina paracéntrica.

No se observaron cambios arquitectónicos dramáticos en un núcleo G2 a pesar de un tamaño nuclear ligeramente mayor. El núcleo HeLa tratado con TSA mostró diferencias notables con respecto a la topografía nuclear y la densidad del ADN. A excepción de la heterocromatina periférica, que mostraba islas de mayor densidad de ADN, el resto de la cromatina parecía mucho más homogénea y descondensada.