Detección de Candidatus Liberibacter asiaticus desplegable en campo mediante amplificación de polimerasa recombinasa combinada con CRISPR-Cas12a

Huang long bing, abreviado como HLB. Es una enfermedad devastadora de los cítricos en todo el mundo. En los países más productores de cítricos, como China y los Estados Unidos, el HLB es causado por la bacteria restringida en floema Candidatus Liberibacter asiaticus, abreviada como CLas.

La detección temprana de CLas fue importante para los productores, facilitando la intervención temprana y previniendo la propagación de la enfermedad. Así que aquí desarrollamos un nuevo método para el diagnóstico rápido y portátil de HLB, combinado con la amplificación de polimerasa recombinasa y el sistema CRISPR-Cas12a. Lo llamamos CLas-DETECTR.

La sensibilidad de nuestra plataforma es mucho mayor que la PCR. Además, muestra un resultado similar con qPCR cuando se utilizaron las muestras de hojas. Compare con las detecciones convencionales de CLas, nuestro método se puede terminar en 90 minutos y funciona en condiciones isotérmicas.

El resultado también se puede visualizar a través de un dispositivo de detección fluorescente portátil en el campo. El CLas-DETECTR contiene cuatro pasos: preparación de la solución, aislamiento de ADN total cítrico, amplificación isotérmica del ADN y los resultados de la visualización. El esquema del ensayo CLas-DETECTR se ilustra aquí.

El tampón A, la solución B y la solución C se preparan como se describe en el protocolo. Para ahorrar tiempo y hacer que este método sea adecuado para la detección de CLas de campo, se utilizó el enfoque basado en polietilenglicol E. coli para obtener extractos de plantas crudas para la amplificación de ADN. Las hojas de cítricos se utilizan en la herramienta.

Perfora los pocos trozos de discos de hojas de hoja. Coloque los discos de hojas en un tubo Eppendorf de 1,5 mililitros. Luego, agregue 200 microlitros de tampón A en el tubo.

Moler los discos de hojas hasta que queden suaves con una varilla de plástico manualmente. Deje el tubo sin interrupciones durante 10 minutos. El sobrenadante se aplica posteriormente a la amplificación del ADN.

Para la amplificación isotérmica del ADN, agregue un microlitro de sobrenadante del paso 2.3 y un microlitro de acetato de magnesio en la solución B y mezcle bien. En el laboratorio, incubarlos en una incubadora simple a 37 grados durante 15 minutos. Para visualizar los resultados, agregue 10 microlitros de la mezcla del paso 3.2 en la solución C y mezcle bien.

Incubarlos en la incubadora de 37 grados durante 60 minutos. Use una gafa y observe la señal de fluorescencia verde a través de un dispositivo de detección fluorescente de mano. Para probar la especificidad de CLas-DETECTR, primeras colonias puras de Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp.

citri, que es el patógeno del cancro de los cítricos, y Burkholderia stabilis cepa 1440 aislada en nuestro laboratorio, se utilizaron para extraer su ADN genómico. Luego, este ADN genómico de tres bacterias y el ADN genómico de hojas de Newhall positivo para CLas se sometieron a la prueba CLas-DETECTR. Para probar la sensibilidad de CLas-DETECTR, se detectaron una serie de diluciones de fragmentos de ADN de CLas utilizando PCR, CLas-DETECTR y qPCR como se describe en el protocolo. Después de la especificidad y la prueba de sensibilidad, se utilizó el método CLas-DETECTR para detectar la presencia de CLas en campo.

Muestras de hojas recolectadas del naranjo dulce Newhall cultivado en el vivero de recursos de germoplasma en el campus de la Universidad Normal de Gannan, Jiangxi, China. También se aplicó qPCR, un método convincente de detección de CLas generalmente utilizado en el laboratorio. Las muestras de hojas del árbol de Newhall infectado con HLB y no infectado con HLB, en el que se confirmó la presencia del CLas en nuestro laboratorio, se sometieron a la prueba CLas-DETECTR.

La señal de fluorescencia verde se capturó en la muestra infectada con HLB, pero no en el control negativo y no infectado con HLB. Se determinó la especificidad de CLas-DETECTR utilizando ácidos nucleicos extraídos de otras bacterias. En el ensayo CLas-DETECTR, solo el ADNg extraído de hojas de Newhall positivas para CLas demostró señales fluorescentes verdes.

El ADNg extraído de Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp. citri y Burkholderia stabilis cepa 1440 no lo hicieron, lo que significa que el CLas-DETECTR puede detectar CLas específicamente. También probamos la sensibilidad de CLas-DETECTR utilizando una serie de diluciones de ADN CLas, enumeradas en el protocolo.

La PCR puede detectar 201 copias por megalitro. Por otro lado, CLas-DETECTR puede detectar 2,01 copias por megalitro, lo que sugiere su disponibilidad como un diagnóstico de campo sensible. qPCR puede detectar 0,201 copias por megalitro y el valor de Ct es superior a 36.

Por lo tanto, CLas-DETECTR es dos órdenes de magnitud más sensible que la PCR tradicional y un orden de magnitud menos sensible que la qPCR cuando se utilizaron amplicones específicos de CLas diluidos. Finalmente, se reexaminó la viabilidad del CLas-DETECTR para muestras de campo, y se comparó su sensibilidad con la qPCR. En cifras, vemos.

Podemos ver que el valor de Ct es superior a 36 cuando la concentración de CLas es inferior a 0,2 copias por megalitro, que es una concentración muy baja. Entre las 15 muestras, el valor de Ct de las muestras 1, 2, 3, 4, 8, 10, 13 y 14 detectadas por qPCR fue inferior a 36. Se observó una aparente señal de fluorescencia verde.

Por otro lado, cuando el valor de Ct de las muestras 6, 7, 9, 12 y 15 detectadas por qPCR fue indeterminado, no se observaron señales fluorescentes verdes. Además, se observaron señales fluorescentes verdes débiles cuando el valor de TC de las muestras 5 y 11 detectadas por qPCR fue superior a 36. Los resultados sugerirán que nuestra plataforma es una herramienta rápida, robusta y sensible para el diagnóstico de HLB en el campo.