Uso de reactivos de referencia para confirmar la solidez de los ensayos de liberación de citocinas para la predicción de la seguridad de los anticuerpos monoclonales

Las pruebas de seguridad de los nuevos fármacos son fundamentales, y este protocolo describe cómo utilizar los estándares validados para evaluar la reproducibilidad, la solidez y las posibles limitaciones de una plataforma CRS. Esta técnica ha sido validada con estos reactivos en 11 laboratorios diferentes y se ha observado un estudio colaborativo internacional con patrones de respuesta similares, mejorando así los esfuerzos en armonización y reproducibilidad. Las aplicaciones de esta técnica se extienden hacia la mejora de las pruebas de riesgo de CRS de nuevos anticuerpos terapéuticos, y también ayudará a estar preparado para el manejo clínico de los posibles efectos secundarios.

Este trabajo tiene como objetivo mejorar la reproducibilidad y la armonización, y una demostración visual aumenta las posibilidades de reproducibilidad. Comience reconstituyendo el contenido de las ampollas de reactivo de referencia en un mililitro de agua destilada estéril y permitiendo de 5 a 10 minutos de rehidratación. Luego, mezcle cada solución de anticuerpos adecuadamente antes de transferirla a un tubo estéril con tapa.

A continuación, diluya cada anticuerpo reconstituido y pruebe el anticuerpo a 10 microgramos por mililitro en PBS estéril. Tome una placa de microtitulación de polipropileno de 96 pocillos estéril, sin tratamiento con TC, con fondo en U, y agregue 100 microlitros de la solución de anticuerpos diluida deseada a los pocillos designados de la placa. Luego, incube la placa durante la noche a cuatro grados centígrados antes de realizar el ensayo de fase sólida.

Después de recolectar un mínimo de 30 mililitros de sangre entera periférica en un tubo heparinizado, inviértalo varias veces para asegurar una mezcla adecuada de la muestra de sangre con heparina de sodio. Reserve 15 mililitros de la muestra de sangre total en un tubo separado para su uso posterior en la fase acuosa: análisis de sangre completa. Diluya los 15 mililitros restantes de sangre entera agregando un volumen igual de PBS o medios RPMI 1640 sin suero.

Coloque suavemente la sangre diluida en capas sobre 15 mililitros de un medio de gradiente de densidad en un tubo de 50 mililitros. Centrifugar el tubo con un rotor basculante sin freno y con una aceleración reducida a 500 G y temperatura ambiente durante 20 minutos para separar la sangre en sus diferentes componentes. Después de la centrifugación, el gradiente de densidad se separará como una capa superior de plasma, seguida de una capa delgada de capa leucocitaria que contiene PBMC y una capa inferior que contiene glóbulos rojos y granulocitos polimorfonucleares, incluidos neutrófilos y eosinófilos.

Retire con cuidado la capa superior de plasma, seguida de la siguiente capa, para recolectar los PBMC. Para el lavado, vuelva a suspender la capa leucocitaria cosechada en 10 mililitros de PBS o medios RPMI 1640 sin suero. Centrifugar el tubo a partir de 500 G durante 10 minutos para granular las células.

Deseche el sobrenadante y repita el lavado nuevamente. A continuación, vuelva a suspender el pellet resultante en dos mililitros de medio RPMI completo. Cuente las células con un hemocitómetro y ajuste la concentración de PBMC a 1 millón de células por mililitro en RPMI completo.

Para el ensayo de liberación de citocinas de sangre entera en fase acuosa, se debe tomar la muestra de sangre entera previamente reservada, agregar 190 microlitros de la muestra a los pocillos de una placa de poliestireno de fondo en U de 96 pocillos, anticuerpos de tratamiento térmico y reactivos de referencia prediluidos a 100 microgramos por mililitro en PBS, y agregar 10 microlitros del anticuerpo diluido deseado a los pocillos designados que contienen 190 microlitros de sangre completa. Incubar la placa durante 48 horas en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados. Para el ensayo de liberación de citocinas PBMC en fase sólida, obtenga las placas recubiertas previamente preparadas.

Con una pipeta multicanal, deseche la solución de anticuerpos de las placas recubiertas. Después de llenar un depósito de reactivo con PBS, lave la placa tres veces con 200 microlitros de PBS para eliminar los anticuerpos monoclonales no unidos. Agregue 200 microlitros de la suspensión de PBMC previamente preparada a cada pocillo.

Incubar la placa durante 48 horas en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Después de la incubación de 48 horas con anticuerpos monoclonales de control y prueba, centrifugar las placas a 400 G durante cinco minutos. Recoja el medio condicionado a la célula o el plasma sin alterar la célula de la célula.

Congele el sobrenadante o plasma recolectado a menos 20 grados centígrados. Los resultados del ensayo de fase sólida PBMC demostraron que los anticuerpos de control positivo indujeron niveles significativamente altos de citocinas en comparación con los controles de isotipo emparejados. También se observó que el superagonista anti-CD28 indujo un cambio significativamente mayor en la liberación de interleucina-2, o IL-2, que su isotipo emparejado, mientras que el anti-CD3 y el anti-CD52, aunque siguen induciendo la expresión de IL-2, dieron lugar a cambios en los pliegues inferiores.

En el ensayo de fase acuosa de sangre total, el nivel de citocinas detectables fue relativamente menor que en el ensayo de fase sólida, pero se caracterizó por una mayor sensibilidad a la estimulación por anti-CD52.