Un inmunoensayo múltiple basado en perlas para cuantificar múltiples dianas citocinas

Tome una placa multipocillo con filtros en la base.

Agregue una muestra de prueba que contenga diferentes citocinas.

Agregue diferentes conjuntos de microesferas diferenciadas por tamaño e intensidad de fluorescencia interna.

Cada conjunto se conjuga con un anticuerpo dirigido a una citocina específica.

Incube la placa en la oscuridad bajo agitación.

Los anticuerpos se unen a sus citoquinas diana, inmovilizándolas en las microesferas.

Aplique una aspiradora para eliminar las citocinas no unidas. Las citocinas unidas a microesferas se retienen debido al tamaño de poro más pequeño de la membrana.

Agregue un cóctel de anticuerpos de detección conjugados con biotina que se unen a las citocinas unidas a microesferas.

Agregue una estreptavidina conjugada con reportero fluorescente e incube en la oscuridad bajo agitación. La estreptavidina se une a la biotina, inmovilizando al reportero en el complejo de microesferas.

Retire las moléculas no unidas y vuelva a suspender las microesferas.

Usando citometría de flujo, identifique las citocinas unidas determinando el tamaño y la fluorescencia interna de las microesferas.

Para determinar la cantidad de una citocina específica, mida la intensidad de fluorescencia del informador.

Para realizar el ensayo, deje que todos los reactivos se calienten a temperatura ambiente antes de usarlos.

En esta demostración se utilizan placas filtrantes de polipropileno. Es absolutamente esencial que la placa se mantenga en posición vertical durante todo el procedimiento de ensayo, incluidos los pasos de lavado, para evitar la pérdida de las perlas.

Humedezca previamente el papel de filtro agregando 100 microlitros de 1x tampón de lavado a cada pocillo y deje reposar la placa durante 1 minuto a temperatura ambiente. Elimine el volumen del tampón utilizando el colector de vacío. Seque el exceso de tampón de lavado del fondo del plato presionando el plato sobre una pila de toallas de papel limpias. Luego coloque la placa encima de la cubierta de la placa invertida.

Para muestras de sobrenadante de cultivo celular, agregue 25 microlitros de tampón de ensayo a todos los pocillos. Agregue 25 microlitros de cada estándar a los pocillos estándar. Finalmente, agregue 25 microlitros de cada muestra a los pocillos de muestra. Agite las perlas mezcladas durante 30 segundos. Luego, agregue 25 microlitros de las perlas mezcladas a cada pocillo, agitando la botella de perlas de forma intermitente para evitar que las perlas se asienten.

Selle la placa con un sellador de placas. Una vez sellado, envuelva todo el plato, incluida la cubierta del plato invertido, con papel de aluminio. Coloque el plato en un agitador de platos, asegúrelo y agite a aproximadamente 500 RPM durante dos horas a temperatura ambiente. Sin invertir, coloque la placa en el colector de vacío y aplique el vacío como antes. Luego, agregue 200 microlitros de 1x tampón de lavado a cada pocillo.

Retire el contenido de los pocillos de la placa de ensayo mediante filtración al vacío. Seque el exceso de tampón de lavado del fondo del plato con una almohadilla absorbente o toallas de papel antes de repetir este paso una vez más. A continuación, agregue 25 microlitros de anticuerpos de detección a cada pocillo. Después de sellar la placa con un sellador de placas nuevo, envuelva toda la placa, incluida la cubierta de la placa invertida, con papel de aluminio.

Coloque el plato en un agitador de platos y agite a aproximadamente 500 RPM durante 1 hora a temperatura ambiente. Sin aspirar, agregue 25 microlitros de reactivo de ficoeritrina de estreptavidina directamente a cada pocillo. Selle y envuelva el plato como antes. Entonces. coloque el plato en un agitador de platos y agite a aproximadamente 500 RPM durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Después de repetir el paso de filtración al vacío dos veces, agregue 200 microlitros de 1x tampón de lavado a cada pocillo. Vuelva a suspender las perlas en una coctelera de platos durante 1 minuto. Con una pipeta multicanal, transfiera las muestras de la placa de filtro a los tubos FACS para leer las muestras en un citómetro de flujo.