Detección de anticuerpos que neutralizan la absorción celular de terapias de reemplazo enzimático con un ensayo basado en células

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de inmunogenicidad y bioanalítica sobre el impacto de los anticuerpos neutralizantes en la seguridad de los fármacos, la eficacia y los perfiles farmacocinéticos y farmacodinámicos. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona un método celular sensible y biológicamente relevante para medir los anticuerpos neutralizantes específicos del fármaco de forma semicuantitativa. En esta técnica, las enzimas marcadas con fluoróforos ingresan a las células Jurkat a través de la unión de un residuo de manosa-6-fosfato al receptor de manosa-6-fosfato independiente del catión o CI-M6PR.

Los anticuerpos neutralizantes que impiden la interacción entre el receptor enzimático inducen una disminución de la fluorescencia medida por citometría de flujo. Para empezar, siembre 7,5 veces 10 a la cuarta células Jurkat en 100 microlitros de medio de crecimiento celular por pocillo en una placa de cultivo celular de fondo redondo de 96 pocillos para una incubación de 14 a 20 horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono con 95% de humedad. Diluya primero las muestras de ensayo en un medio libre de suero en una proporción de uno a 2,5.

A continuación, añada 60 microlitros de cada muestra a los pocillos correspondientes de una placa de polipropileno no vinculante de fondo redondo blanco de 96 pocillos. Esta será la placa de incubación de la muestra. En el caso de las muestras que han dado positivo y necesitan ser confirmadas, se debe colocar un vial de perlas de terapia de reemplazo enzimático o ERT y agregar el número adecuado de perlas a un tubo cónico de 15 mililitros para otro vórtice.

A continuación, coloque el tubo en una rejilla magnética para tubos durante dos minutos y retire con cuidado el sobrenadante. Después del cuarto lavado, agregue 100 microlitros de perlas a los pocillos apropiados de una nueva placa de polipropileno no vinculante de fondo redondo blanco de 96 pocillos. Cuando se hayan plateado todas las cuentas, coloque la placa en un imán con faldón lateral de 96 pocillos y permita que las cuentas formen una bolita antes de retirar con cuidado el sobrenadante transparente.

A continuación, agregue 140 microlitros de cada muestra en los pocillos apropiados y selle la placa con una película de plástico para agitar durante al menos 60 minutos en un agitador giratorio a aproximadamente 800 RPM a temperatura ambiente. A continuación, coloque la placa de confirmación en el imán con faldón lateral de 96 pocillos para permitir que las perlas formen otro gránulo y añada 60 microlitros de muestra a los pocillos correspondientes de una placa de incubación de muestras de polipropileno no vinculante de fondo redondo blanco de 96 pocillos. En el caso de las muestras que se han examinado y se confirma que son positivas, se puede realizar una serie de títulos.

Para preparar una serie de títulos, diluya en serie la muestra en la matriz combinada un número suficiente de veces para cruzar el punto de corte de título predeterminado y agregue 60 microlitros de cada muestra diluida a los pocillos apropiados de la placa de incubación de muestras y 60 microlitros de las concentraciones apropiadas de ERT marcado con fluoróforos a los pocillos apropiados de una nueva placa de polipropileno no vinculante de fondo redondo blanco de 96 pocillos de acuerdo con el protocolo de texto. A continuación, pipetear la solución de muestra de fluoróforo ERT varias veces para mezclar y envolver las placas en papel de aluminio para una incubación de 14 a 20 horas a dos a ocho grados centígrados. A la mañana siguiente, caliente las placas de muestra en un baño de perlas a 37 grados Celsius durante 10 a 15 minutos y revise las células plateadas en un microscopio invertido para confirmar que las células estén sanas y distribuidas uniformemente en los pocillos.

Cuando las placas se hayan calentado, agregue 100 microlitros de muestra y mezcla de ERT marcada con fluoróforos a la placa celular de acuerdo con el mapa de placas experimentales y devuelva las células a la incubadora de cultivo celular durante otras tres horas y 15 minutos. Al final de la incubación, granule las células por centrifugación y confirme la presencia de un pellet en el fondo de cada pocillo. Sosteniendo la placa en un ángulo de 30 a 45 grados, retire con cuidado el sobrenadante en cada pocillo sin alterar los gránulos y lave las celdas tres veces en 200 microlitros de DPBS por pocillo por centrifugación.

Después del último lavado, agregue 100 microlitros de tinte de muertos vivos a cada pocillo para una incubación de 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Al final de la incubación, granule las células por centrifugación y lave las células con 200 microlitros de DPBS por pocillo. Vuelva a suspender los gránulos lavados en 100 microlitros de dos a ocho grados centígrados con 1% de paraformaldehído por pocillo y selle la placa para un vórtice de pulso suave.

Luego envuelva la placa en papel de aluminio para una fijación de 10 minutos a dos a ocho grados centígrados. Para analizar la viabilidad de la célula mediante citometría de flujo, mezcle las células con 50 microlitros de DPBS por pocillo para lograr una suspensión de una sola célula y lea las células en un citómetro de flujo de acuerdo con los protocolos estándar de citometría de flujo. La absorción de ERT conjugada con fluoróforos se puede evaluar de acuerdo con la intensidad de fluorescencia media o MFI de las células individuales vivas.

Antes de ser probadas en el ensayo, se calcula un punto de corte de cribado experimental como umbral para determinar las muestras positivas y negativas. En este ejemplo, se muestran controles de calidad enriquecidos con cantidades altas o bajas de anticuerpos neutralizantes. A continuación, las muestras positivas se analizan en un ensayo confirmatorio en el que se utilizan perlas magnéticas conjugadas con fármacos para agotar el anticuerpo específico del fármaco de las muestras.

Las muestras con una tasa de recuperación superior al punto de corte confirmatorio se consideran positivas. Las muestras que dieron positivo y se confirmaron positivas se diluyen en serie y se analizan en el ensayo de titulación para determinar la titulación relativa de anticuerpos neutralizantes en cada muestra. El título es el valor interpolado entre dos diluciones que cruzan el punto de corte del título.

En la imagen, las IMF de células individuales vivas evaluaron la captación de ERT conjugada con fluoróforos. Por ejemplo, en este experimento, la matriz enriquecida con el anticuerpo de control positivo inhibió la captación de ERT conjugada con fluoróforos, lo que resultó en una intensidad de fluorescencia media baja. Por el contrario, las células incubadas con la matriz en ausencia del anticuerpo de control positivo exhibieron una intensidad de fluorescencia mediana más alta, lo que demuestra la absorción del ERT conjugado con fluoróforos.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener ventanas de incubación estrictas para obtener resultados confiables y consistentes. También es importante optimizar el ensayo para cada terapia de reemplazo enzimático. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los científicos especializados en inmunogenicidad y bioanálisis en el desarrollo de fármacos exploraran el impacto de los anticuerpos neutralizantes de la captación celular en la seguridad y eficacia de la ERT.

No olvide que trabajar con muestras humanas puede ser extremadamente peligroso y que todas las muestras deben tratarse como si fueran potencialmente infecciosas mientras realiza este procedimiento.