Perla base ensayo Multiplex para el análisis de perfiles de Cytokine de lágrima

El objetivo general de este protocolo es estudiar los perfiles de citocinas en muestras de lágrimas humanas recogidas por Schirmer Strips mediante un ensayo múltiple basado en perlas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la oftalmología, como el papel de las citocinas en diversas enfermedades oculares. La principal ventaja de esta técnica es que se puede utilizar para estudiar múltiples analitos en volúmenes de muestra más pequeños.

El encargado de demostrar el procedimiento será Praveen Balne, un postdoctorado de mi laboratorio. Después de recolectar lágrimas de un sujeto de acuerdo con el protocolo de texto, corte la tira de flujo lagrimal a una longitud de 0,5 centímetros y colóquela en un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mililitros. Agregue 30 microlitros de tampón de ensayo e incube el tubo a temperatura ambiente durante cinco minutos.

A continuación, centrifugar el tubo a 14.000 veces g durante un minuto. Transfiera el sobrenadante a otro tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y deseche la tira. A continuación, coloque el tubo que contiene la muestra en hielo y utilice la muestra lagrimal eluida inmediatamente para el perfil de citocinas.

Para llevar a cabo el ensayo multiplex basado en perlas, lleve todos los reactivos a temperatura ambiente y póngalos en vórtice durante cinco a 10 segundos. Si las muestras de lágrimas eluidas se almacenaron a menos 80 grados centígrados antes del ensayo, descongele los extractos de lágrimas congelados en hielo y centrifugue las muestras a 1.000 veces g durante cinco minutos. Prepare una hoja de trabajo de ensayo en una configuración vertical para trabajar con los estándares de citocinas humanas QC-1, QC-2 y muestras.

Agregue 200 microlitros de tampón de lavado 1X a cada pocillo de la placa y séllela con un sellador de placas. A continuación, incubar la placa en un agitador de placas a temperatura ambiente durante 10 minutos. A continuación, decantar el tampón de lavado 1X invirtiendo la placa y golpee la toalla absorbente varias veces para eliminar cualquier cantidad residual de tampón de lavado en los pocillos.

A continuación, añada 25 microlitros de cada citocina humana estándar QC-1, QC-2, el blanco con solo tampón de ensayo y las muestras en los pocillos adecuados. Agregue 25 microlitros de tampón de ensayo en cada pocillo. Luego, a los pocillos, agregue 25 microlitros de solución de cóctel de perlas de anticuerpos 1X.

Como la solución de perlas de anticuerpos es sensible a la luz, selle la placa y cúbrala con papel de aluminio y cubierta de la placa para protegerla de la luz durante el ensayo. Incubar la placa a cuatro grados centígrados en una coctelera durante la noche. Al día siguiente, coloque la placa en la rejilla de placas de una lavadora automática de placas magnéticas y déjela reposar durante un minuto para que se asienten las cuentas magnéticas en el fondo del pozo.

Aspire el contenido del pocillo y agregue 200 microlitros de tampón de lavado por pocillo utilizando una lavadora automática de placas magnéticas. Deje reposar el plato durante un minuto y luego aspire el contenido del pozo como antes y repita el lavado una vez más. Agregue 25 microlitros de solución de anticuerpos de detección en cada pocillo.

Selle la placa. Cúbralo con papel de aluminio y cubra la placa e incube a temperatura ambiente en una coctelera durante 60 minutos. Luego agregue 25 microlitros de solución de estreptavidina y ficoeritrina en cada pocillo y, después de sellar y cubrir la placa, incubarla a temperatura ambiente en un agitador durante 30 minutos.

Después de la incubación, coloque la placa en una arandela de placas magnética y déjela reposar durante un minuto. A continuación, aspire el contenido del pocillo y añada 200 microlitros de tampón de lavado por pocillo. Déjelo reposar durante un minuto, luego aspire el contenido del pozo antes de repetir el lavado una vez más.

Agregue 150 microlitros de líquido de vaina a cada pocillo. A continuación, coloque la placa en un agitador durante cinco minutos a temperatura ambiente para volver a suspender las perlas de anticuerpos antes de proceder a leer la placa y analizar las concentraciones de citocinas. Para leer la placa de ensayo de acuerdo con el protocolo de texto, abra la página de lotes y haga clic en la pestaña crear un nuevo lote a partir de un protocolo existente.

En el cuadro Nombre de lote, escriba el nombre del lote y escriba una descripción sobre el lote en el cuadro Introducir descripción opcional. Haga clic en el protocolo generado anteriormente y luego haga clic en siguiente. La siguiente pestaña que se abre es la pestaña de normas y controles.

Vea los detalles de los estándares de ensayo y seleccione siguiente. En la pestaña Diseño de placa, asigne comandos de pozo para el lote y haga clic en Guardar para guardar la información del lote en la lista de lotes pendientes. Cargue la placa en el lector de placas de ensayo multiplex basado en cordones y ejecute el lote desde la lista de lotes pendientes.

Inicie el software de conversión RBX y, en seleccionar archivos de exponente, seleccione el archivo csv generado a partir del software de ensayo multiplex basado en cordones. A continuación, haga clic en el botón Generar. Se guardará un archivo rbx en la carpeta de salida seleccionada.

Ahora, inicie el software de análisis y abra el archivo rbx. Luego, usando el ajuste de curva 4PL-5PL, optimice las curvas estándar. Para optimizar las curvas estándar, seleccione lo siguiente en la pestaña curva estándar, tipo de regresión, logística 5PL y registro de transformación de acceso X, lineal Y. A continuación, marque las siguientes casillas, mostrar líneas de rango de concentración, mostrar muestras desconocidas, mostrar muestras de control, aplicar en todos los analitos y mostrar informe después de la optimización.

Haga clic en el botón optimizar para la optimización automática. En la pestaña Introducir información de ejemplo, etiquete las identidades de ejemplo. Finalmente, obtenga las concentraciones observadas en la pestaña de la tabla del informe y haga clic en exportar la tabla del informe para generar los datos en un archivo de hoja de cálculo para su posterior análisis.

Se recolectaron muestras de lágrimas de ocho ojos de cuatro hombres sanos de 36 a 52 años. De las 41 citocinas analizadas mediante el ensayo multiplex basado en perlas, se detectaron 31 en todas las muestras de lágrimas. Por ejemplo, se detectaron IL-17A, MIP-1b y TNFa en siete ojos de cuatro sujetos y IL-4 en seis ojos de cuatro sujetos.

Además, se detectó interferón gamma en seis ojos de tres sujetos. Se detectó interleucina-1a en cinco ojos de tres sujetos. Se detectaron eotaxina e interleucina-9 en tres ojos de dos sujetos.

Se detectó interleucina-3 en un ojo y MIP-1a en ninguna de las muestras. Las concentraciones medias de más o menos desviación estándar de las 41 citocinas detectadas se ilustran en este diagrama de dispersión. La interleucina-1ra se expresó altamente en todas las muestras.

Las citocinas IP-10, GRO, MCP-1, PDGF-AA, fractalkina, interleucina-a, EGF, PDGF-BB, VEGF y G-CSF también se expresaron en niveles de nanogramos por mililitro y las citocinas restantes se expresaron en niveles de picogramos por mililitro. Como se ve aquí, la concentración más baja medida de citocina lagrimal fue TNF-a con una desviación estándar media de más o menos de 27,25 más o menos 19,97 picogramos por mililitro. En las 31 citocinas que se detectaron en todas las muestras, ninguna mostró una diferencia estadísticamente significativa en la concentración entre el ojo derecho y el izquierdo mediante la prueba T.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 1-1/2 días si se realiza correctamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar un ensayo múltiplex basado en perlas para el perfil de citocinas lagrimales.