Imágenes de calcio en el colículo superior de ratón
21 de abril de 2023
Este protocolo detalla el procedimiento para obtener imágenes de las respuestas de calcio en el colículo superior (SC) de ratones despiertos, incluida la obtención de imágenes de la actividad de una sola neurona con microscopía de dos fotones mientras se deja la corteza intacta en ratones de tipo salvaje, y la obtención de imágenes de todo el SC con microscopía de campo amplio en ratones mutantes de corteza parcial.
Mi investigación se centra en la codificación neuronal y los mecanismos de procesamiento visual. Estamos tratando de responder cómo se codifica diversa información en el cerebro, especialmente en el colículo superior bajo los mecanismos neurológicos subyacentes. Para comprender el procesamiento visual, los científicos combinan varios enfoques, incluida la morfología neuronal, el rastreo anterógrado y retrógrado, la secuenciación de IL, el modelado neurológico y el aprendizaje automático.
El reto consiste en extraer el cráneo sobre el SSA, cortándolo y dejándolo en el hueso en una pieza más grande, es probable que falle porque el hueso está unido a la duramadre. Al combinar dos fotos en una imagen de calcio de campo amplio, nuestro trabajo reciente reveló la arquitectura de la función de la dirección del movimiento en el ratón SC tanto a una resolución de una sola célula como a escala global. Encontramos que las neuronas con preferencia similar forman parches de hasta 500 micrómetros por debajo del global al ascendente en el movimiento nasal.
Con nuestro protocolo, estamos abordando dos brechas de investigación. En primer lugar, los investigadores pueden realizar imágenes de moldeo a largo plazo en SC de ratón con una resolución de una sola célula sin romper la corteza. En segundo lugar, los investigadores pueden registrar la neuroactividad en todo el SC utilizando microscopio de campo amplio.
Nuestro protocolo proporciona una medida para obtener imágenes de la SC medial posterior con una resolución de una sola célula con una corteza intacta en ratones. Además, utilizamos un tapón biocompatible para exponer el SC, lo que reduce la infección para la obtención de imágenes crónicas. Nuestros resultados proporcionan una forma de estudiar la codificación neuronal de la información visual a través de un gran campo visual.
En combinación con la optogenética, se pueden estudiar las medias entradas de diferentes regiones cerebrales que modulan la neuroactividad en el SC.
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Resumen
Este estudio proporciona un protocolo para la obtención de imágenes de las respuestas de calcio en el colículo superior (SC) de ratones despiertos, utilizando microscopía de dos fotones para capturar la actividad de neuronas individuales mientras se preserva la corteza en ratones silvestres, y empleando microscopía de campo amplio para todo el SC en ratones mutantes con corteza parcial.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Técnicas de imagen
- Procesamiento visual
Antecedentes
- El colículo superior desempeña un papel crucial en el procesamiento de la información visual.
- Comprender el código neuronal en el CS es esencial para elucidar los mecanismos del procesamiento visual.
- Los métodos de imagen previos pueden alterar la integridad cortical, complicando los estudios de grabación a largo plazo.
- Este protocolo busca abordar estos desafíos mediante un enfoque mínimamente invasivo para la obtención de imágenes.
Objetivo del estudio
- Establecer un método confiable para la imagenología prolongada de calcio en el colículo superior del ratón.
- Facilitar la grabación de la actividad neuronal en todo el colículo superior sin alterar la corteza.
- Mejorar la comprensión de cómo se representa la información visual a nivel neuronal en el colículo superior.
Métodos Utilizados
- El estudio emplea técnicas de microscopía de dos fotones y de campo amplio.
- Se utilizan modelos de ratones de tipo silvestre y mutantes, empleando un virus adenoasociado para expresar GCaMP6m en la imagen de calcio.
- Las metodologías clave incluyen la implantación de una placa craneal, enfoques quirúrgicos para exponer el colículo superior y el uso de una copa de succión para imágenes crónicas.
- Después de la inyección viral, se observa un período de recuperación de tres semanas antes de iniciar la adquisición de imágenes.
- Los pasos quirúrgicos detallados garantizan un daño mínimo a los tejidos circundantes.
Resultados Principales
- El protocolo permite un examen detallado de la actividad neuronal asociada con preferencias de dirección del movimiento dentro del SC.
- Los hallazgos indican que las neuronas que exhiben preferencias similares pueden agruparse, afectando el procesamiento de señales visuales en áreas extensas.
- Es posible realizar imágenes crónicas manteniendo la integridad cortical, lo que facilita estudios continuos de la dinámica neuronal.
- La combinación de datos de imágenes con optogenética permite investigar las entradas moduladoras provenientes de otras regiones del cerebro.
Conclusiones
- Este estudio establece un método robusto para analizar la señalización de calcio en el colículo superior, contribuyendo significativamente a la comprensión de los mecanismos de procesamiento visual.
- Las técnicas de imagen descritas prometen avances en estudios longitudinales de la actividad neuronal en animales despiertos.
- Dichas metodologías mejorarán la investigación de los mecanismos neuronales y sus implicaciones en el comportamiento visual y en los trastornos asociados.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La imagen de calcio de alta resolución en el colículo superior (SC) del ratón permite la interrogación directa del código neural subyacente al procesamiento visual, apoyando la reducción de riesgos mecanicistas en la etapa de validación de objetivos. La capacidad de capturar tanto la actividad a nivel de célula individual como de toda la estructura en animales despiertos proporciona una confianza predictiva para carteras de neurociencia traslacional y neurofarmacología. Este enfoque a doble escala fortalece las decisiones iniciales de descubrimiento e informa el desarrollo de ensayos posteriores para objetivos del sistema visual.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la cartografía funcional de los circuitos de procesamiento visual a nivel celular y de red.
- Apoya la reducción mecanicista de riesgos al distinguir entre codificación neural heredada y de novo en el colículo superior.
- Proporciona datos cuantitativos de actividad neuronal para orientar la selección y validación de objetivos.
- Facilita la interrogación basada en hipótesis del codificado de características visuales en sistemas relevantes para la enfermedad.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Establece plataformas de imagen validadas para la medición reproducible de las respuestas neuronales.
- Proporciona lecturas cuantitativas y escalables adecuadas para el cribado de compuestos en modelos de la vía visual.
- Permite la estandarización de las condiciones del ensayo para lograr comparabilidad entre estudios y entre equipos.
- Apoya el desarrollo de ensayos de cribado fenotípicos robustos para compuestos neuroactivos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Alinea mediciones de actividad neuronal con biomarcadores traslacionales de la función visual.
- Proporciona continuidad desde la codificación neural en etapa de descubrimiento hasta la validación preclínica de intervenciones en el sistema visual.
- Permite el avance ajustado al riesgo de dianas en la vía visual basado en datos funcionales in vivo.
- Apoya estudios mecanicistas de modulación de circuitos mediante integración optogenética.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este protocolo de imagen permite conectar el descubrimiento inicial con la investigación preclínica, al posibilitar la comprobación de hipótesis, la aclaración de vías y el análisis cuantitativo en la SC. Está diseñado para integrarse desde la validación de dianas hasta la identificación de compuestos líderes y los estudios traslacionales.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la medición directa del código neuronal y la función de las vías en el SC.
- Selección: Proporciona resultados cuantitativos y reproducibles de imágenes para el desarrollo de ensayos y la evaluación de compuestos.
- Análisis: Ofrece datos de alto contenido sobre la actividad neuronal, permitiendo comparaciones estadísticas entre condiciones experimentales.
- Investigación Traducional: Conecta la actividad neuronal in vivo con posibles biomarcadores para trastornos del sistema visual.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma de imágenes reutilizable y adaptable a otras regiones cerebrales y preguntas de investigación.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos y reduce la ambigüedad mecanicista en la investigación del procesamiento visual.
- Valor operativo: Estandariza los flujos de trabajo de imagenología para garantizar la reproducibilidad y escalabilidad entre estudios.
- Valor estratégico: Mejora la toma de decisiones de avance/no avance y la eficiencia del capital al proporcionar datos funcionales sólidos desde las primeras etapas del proceso.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de objetivos en el sistema visual y respalda las decisiones de avance con evidencia cuantitativa.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en imágenes in vivo, preparación quirúrgica y análisis de datos.
- Exige acceso a plataformas de microscopía de dos fotones y de campo amplio, así como a la infraestructura de apoyo.
- Necesita la estandarización entre equipos en el manejo de animales, la administración viral y los protocolos de imagen.
- Adaptable a otras regiones cerebrales con modificaciones del protocolo según lo indicado por la fuente.
- La estabilidad a largo plazo en las imágenes y la localización precisa son consideraciones prácticas para estudios crónicos.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:41
Preparation of a Suction Cup and Plugs for Calcium Imaging in Mouse
4:30
Viral Construct (AAV) Injection in Mouse Superior Colliculus for Calcium Imaging
5:48
Implantation of the Headplate in Mouse for Calcium Imaging
6:40
Implanting the Plug in the Mouse for Calcium Imaging
8:06
Two‐Photon Calcium Imaging of Mouse Superior Colliculus Neurons
9:37
Wide‐Field Calcium Imaging of Mouse Superior Colliculus Neurons
