Visualización de proteínas de baja abundancia y modificaciones postraduccionales en embriones vivos de Drosophila mediante inyección de anticuerpos fluorescentes

Este protocolo describe el marcaje de fluorescencia personalizado basado en anticuerpos y la inyección en embriones tempranos de Drosophila para permitir la obtención de imágenes en vivo de proteínas de baja abundancia o modificaciones postraduccionales que son difíciles de detectar utilizando los enfoques tradicionales de GFP/mCherry-tag.

Nuestro objetivo es comprender cómo las señales mecánicas y bioquímicas correlacionan la morfogénesis animal, incluida la detección y la respuesta a las fuerzas de las células y las moléculas. Se han descubierto más moléculas que son mecanosensibles, que funcionan de manera diferente bajo diferentes niveles de tensión. Sin embargo, el contexto fisiológico y la función de estos eventos sensibles a la fuerza siguen siendo en gran medida desconocidos.

Debido a la naturaleza dinámica de los eventos sensibles a la fuerza, nuestro campo se basa en gran medida en imágenes de fluorescencia de alta velocidad y grabación de lapso de tiempo para capturar comportamientos moleculares y celulares. Muchas proteínas marcadas con fluorescencia no son lo suficientemente brillantes como para ser fotografiadas, y requiere una resolución espacio-temporal sin una decoloración significativa. Por otro lado, los métodos tradicionales de inmunofluorescencia solo pueden capturar una instantánea de la fijación molecular y celular después de la fijación.

Este método allana el camino para rastrear dinámicamente la localización de muchos receptores de proteínas de baja abundancia de las principales vías de señalización, como las vías Notch, Wnt y BMP. Eventualmente, además de las cascadas de señalización lineal tradicionales, podemos identificar y dónde ocurren los eventos de señalización a escalas subcelulares.