Name: Un modelo de ratón tumoral con cámara de ventana de pliegue cutáneo dorsal para la microscopía intravital combinada y la resonancia magnética en la investigación traslacional del cáncer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Aprende a integrar microscopía intravital con resonancia magnética en un modelo de cámara de ventana dorsal en ratón. Este método combina alta resolución óptica con penetración profunda para estudiar la respuesta tumoral a la radioterapia hipofraccionada y mejorar la traducción clínica.

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Agradecemos a la Dra. Carla Calçada (becaria postdoctoral, Princess Margaret Cancer Centre) y al Dr. Timothy Samuel (estudiante de doctorado, Princess Margaret Cancer Centre) por su ayuda con el cultivo de células tumorales y el desarrollo del protocolo de inoculación. La Dra. Kathleen Ma, la Dra. Anna Pietraszek y la Dra. Alyssa Goldstein (Centro de Investigación Animal, Centro Oncológico Princesa Margarita) ayudaron con el desarrollo del protocolo quirúrgico. Jacob Broske (tecnólogo de ingeniería médica, Princess Margaret Cancer Centre) y Wayne Keller (ejecutivo de clientes de hardware, Javelin Technologies, una empresa del grupo TriMech) imprimieron en 3D las cámaras de las ventanas. James Jonkman (Centro de Microscopía Óptica Avanzada, Red de Salud de la Universidad) proporcionó una valiosa orientación para la adquisición de imágenes de microscopía de campo claro y fluorescencia.

Inoculación tumoral guiada e imágenes multimodales en ratones

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Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

En este trabajo, hemos desarrollado un flujo de trabajo para realizar tanto microscopía intravital como imágenes clínicamente aplicables (TC, RM y PET) en el mismo animal. Esto se hizo con el objetivo de trasladar los hallazgos de la microscopía preclínica a la clínica mediante la correlación directa de la microscopía intravital con modalidades de imagen clínica como la resonancia magnética. Aunque los diseños convencionales de DSFC están hechos de metal 2,3, hemos adaptado el DSFC para que sea compatible con RM mediante el uso de cámaras de ventana impresas en 3D hechas de una resina plástica biocompatible. El registro de las modalidades se llevó a cabo mediante el uso de marcadores de referencia para las modalidades de imágenes clínicas y mediante la obtención de una imagen de microscopía de campo amplio para que coincida con las ubicaciones de los marcadores de referencia en el DSFC con los puntos de referencia vasculares que se pueden ver en la imagen de microscopía de campo amplio, así como en las imágenes microvasculares de microscopía intravital de alta resolución. Se desarrolló un código MATLAB para co-registrar las modalidades y se incluye en el Archivo Complementario 2.
Las DSFC no son nuevas en la investigación preclínica 2,3,27,29,30,31,32 y algunos estudios desarrollan DSFC compatibles con RM a partir de plásticos biocompatibles para microscopía intravital e imágenes clínicamente aplicables 27,29,30,31,32. Sin embargo, estos estudios realizan correlaciones a nivel de tumor completo con los hallazgos de la resonancia magnética y la microscopía intravital. La novedad de este trabajo es nuestra capacidad de co-registrar directamente imágenes de microscopía intravital con modalidades de imagen clínicamente aplicables utilizando un marcador fiducial adjunto al DSFC que permite el análisis de correlación espacial directa. Gaustad et al. también han realizado análisis de correlación espacial entre la resonancia magnética y la microscopía intravital; Sin embargo, no se incluyen pasos específicos detallados sobre el proceso de corregistro entre modalidades29. Este trabajo proporciona un protocolo para correlacionar espacialmente múltiples modalidades entre sí utilizando el accesorio de anillo marcador de referencia e incluye una canalización de MATLAB.
Hay varios detalles del diseño y el procedimiento de DSFC que ofrecen mejores características de imagen y crecimiento tumoral en comparación con otros estudios similares. En primer lugar, la mayoría de los métodos de cámara de ventana implican la inoculación del tumor después de la cirugía de cámara de ventana. Por lo general, esto se hace porque es más fácil centrar el tumor en el campo de visión de la cámara de la ventana; Sin embargo, trabajos previos han demostrado que esto no es óptimo, lo que conduce a un crecimiento tumoral monocapa "poco realista" con regresión espontánea en muchos casos33. En cambio, permitimos que el tumor crezca sin restricciones en la piel durante varias semanas antes de la implantación de DSFC, lo que permite un tumor 3D más realista con características de crecimiento mejoradas33.
Este diseño DSFC también es extremadamente ligero con 0,83 g con un gran FOV de ventana de imagen (cubreobjetos de vidrio de 1,2 cm de diámetro). Una característica única de nuestro diseño DSFC es que no incluye un anillo elástico para asegurar el cubreobjetos de vidrio al marco frontal. En su lugar, el cubreobjetos de vidrio se fija permanentemente con pegamento curado con UV, lo que permite que la parte inferior del marco frontal quede completamente plana. Además, el marco frontal está asegurado debajo de la piel del ratón. Esto se hizo para minimizar la posibilidad de que hubiera un espacio de aire entre la interfaz tumor-vidrio. Se ha observado en diseños anteriores que si hay un espacio en la interfaz tumor-vidrio, existe una alta probabilidad de acumulación de líquido en esta región. Esto tiene un impacto significativo en los resultados al atenuar la señal de microscopía intravital, lo que reduce la calidad de la imagen. Además, hace que sea más difícil dirigir los cortes de resonancia magnética al tumor, ya que esta acumulación de líquido aparecerá brillante en las exploraciones de localización T2w. Esto hace que sea difícil identificar qué cortes están tomando imágenes del tejido y qué cortes están tomando imágenes de la acumulación de líquido en la DSFC. Un inconveniente de este diseño es que si el cubreobjetos de vidrio se rompe, no se puede reemplazar fácilmente. También hemos diseñado un marco delantero que está hecho completamente de un plástico ópticamente transparente, eliminando así el problema de rotura de vidrio34.
A lo largo de este procedimiento, varios pasos cruciales son técnicamente más desafiantes que otros. Un paso que puede causar dificultades es durante la cirugía DSFC cuando se sutura el marco frontal a la piel (pasos del protocolo 3.18-3.24). Es importante mantener un poco de piel extra suelta a lo largo de la parte superior del marco delantero de la DSFC. Si esto no se hace, la piel de esta región perderá el suministro de sangre y se volverá necrótica, arruinando así la preparación. Otra tarea técnicamente desafiante es la orientación del paquete de cortes de resonancia magnética para incluir la parte más superficial del tejido debajo del vidrio. Si este corte no se dirige con precisión a la región, pueden producirse efectos de volumen parcial con el vidrio, lo que conduce a resultados erróneos de la resonancia magnética. Las superficies irregulares del tejido debajo del vidrio de la DSFC pueden hacer que esto sea aún más desafiante. Es importante asegurarse de que la piel esté tensa dentro de la DSFC para mantener la superficie del tejido lo más plana y uniforme posible para reducir esta fuente de error.
Aquí hemos demostrado el uso de este flujo de trabajo DSFC utilizando svOCT, que tiene un gran campo de visión de imagen de 6 x 6 mm2. Este gran campo de visión no es común en otros tipos de microscopía intravital, ya que muchos métodos de imagen tienen campos de visión de 1mm2 o más pequeños,13. Esto puede causar algunos desafíos al registrar conjuntamente la imagen de microscopía de campo amplio con las imágenes de microscopía intravital de alta resolución, ya que los puntos de referencia microvasculares pueden ser difíciles de identificar. Para superar esto, es posible que se requiera otra imagen de microscopía de campo amplio con un campo de visión más pequeño (~ 6 x 6 mm2) para actuar como un paso intermedio adicional de co-registro entre las modalidades de imagen para refinar aún más la región de interés con respecto a la imagen obtenida por microscopía intravital.
En este trabajo, nos hemos centrado en la obtención de imágenes de la microvasculatura tumoral, pero también se pueden obtener imágenes de otros componentes del microambiente tumoral utilizando este modelo. Por ejemplo, se ha demostrado que la microscopía intravital obtiene imágenes exitosas del estroma tumoral35, y los métodos de resonancia magnética con intensidad de difusión, como las imágenes de tensor de difusión o las imágenes de curtosis por difusión, pueden tener la capacidad de proporcionar información sobre la estructura del estroma tumoral 36,37. Este flujo de trabajo puede brindar oportunidades interesantes para traducir la información del tumor estromal a la clínica mediante el registro conjunto directo de imágenes de microscopía intravital de alta resolución del estroma tumoral con mediciones del estroma basadas en resonancia magnética. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que debido a que este método utiliza puntos de referencia vasculares para el corregistro, estos también deben estar presentes en las imágenes estromales de microscopía intravital.
El flujo de trabajo presentado puede resultar un paso importante para cerrar la brecha entre la microscopía intravital preclínica y las modalidades de imagen clínicamente aplicables. Este modelo se puede utilizar para validar métodos de imagen clínica con imágenes de microscopía intravital reales sobre el terreno, desarrollar nuevos métodos de imagen clínicamente aplicables mediante la comparación con la microscopía intravital y monitorear longitudinalmente la respuesta de los tratamientos utilizando múltiples modalidades de imagen.

La microvasculatura tumoral es un componente importante del microambiente tumoral que puede ser un objetivo para el tratamiento y un determinante de la respuesta al tratamiento. En el ámbito preclínico, la microvasculatura se estudia típicamente mediante microscopía intravital en modelos animales de cámara de ventana ortotópicos o heterotópicos 1,2. Esto tiene varias ventajas sobre los estudios histológicos, ya que las imágenes se realizan en tejidos vivos y el tumor puede ser monitoreado longitudinalmente durante varias semanas o incluso meses 2,3. Estos estudios pueden aprovechar las capacidades de imagen de alta resolución de la microscopía intravital para estudiar la administración de terapias al tumor 4,5, las causas de la resistencia al tratamiento6 y la respuesta de los microvasos a terapias como el tratamiento antiangiogénico 7,8 y la radioterapia 2,9.
La microscopía intravital desempeña claramente un papel importante en la investigación preclínica del cáncer; Sin embargo, ¿cómo se pueden medir las características microambientales del tumor en la clínica? La información microvascular sería útil en la clínica para medir el suministro de sangre y la hipoxia de las células tumorales, que es importante para determinar la resistencia al tratamiento en radioterapia10, así como la capacidad de la microvasculatura para administrar agentes quimioterapéuticos a las células tumorales circundantes11. Por ejemplo, en radioterapia, la información espacial sobre la estructura y función de la microvasculatura tumoral puede ayudar a personalizar el plan de tratamiento de un paciente ajustando el programa de fraccionamiento o aumentando preferentemente la dosis a las regiones avasculares y probablemente hipóxicas12.
La microscopía intravital puede medir estas importantes características microvasculares, ya que tiene una resolución muy alta (escala de μm); Sin embargo, su penetración profunda en el tejido está limitada a varios cientos de micras o unos pocos milímetros, lo que a lo sumo dificulta la implementación clínica. De hecho, existen algunas aplicaciones novedosas de la microscopía intravital en la clínica13; Sin embargo, todavía se limitan a exámenes de tejido a nivel de superficie como la piel14 o los revestimientos mucosos/endoteliales de varias cavidades corporales a través de catéteres/endoscopios flexibles15,16.
Más comúnmente, la microvasculatura se estudia utilizando modalidades de imagen como la TC17 o la RM18. Estas modalidades de imágenes clínicas pueden obtener imágenes a cualquier profundidad dentro del cuerpo, pero tienen una resolución espacial (escala milimétrica) mucho más baja. Por lo tanto, existe la necesidad de cerrar esta brecha de resolución entre la microscopía intravital preclínica y las modalidades de imagen clínica para llevar a la clínica información microvascular detallada y de alta resolución19. Se han desarrollado varios métodos de imagen funcional para mejorar las capacidades de imagen microvascular de las modalidades de imagen clínica, como la RM y la TC20 con contraste dinámico (DCE), y la RMN de movimiento incoherente intravoxel (IVIM)21. Sin embargo, estos son métodos basados en modelos que proporcionan mediciones indirectas de la microvasculatura y, por lo tanto, deben ser validados con mediciones apropiadas de la microvasculatura19,22.
Hemos desarrollado un modelo de ratón tumoral con cámara de ventana de pliegue cutáneo dorsal (DSFC) para cerrar esta brecha entre la microscopía intravital preclínica y las modalidades de imagen clínicamente aplicables, como la TC y la RM. El DSFC proporciona acceso directo al tumor para obtener imágenes de microscopía intravital de alta resolución a través de una ventana de vidrio, pero también imágenes clínicamente aplicables, como la resonancia magnética, ya que está hecho de materiales compatibles con la resonancia magnética (plástico y vidrio). Además, un código MATLAB incluido realiza el corregistro 3D multimodal para correlaciones espaciales directas entre la microscopía intravital preclínica y las modalidades de imagen clínicamente aplicables. Aquí describiremos el diseño y la cirugía para instalar el DSFC, así como el procedimiento para co-registrar la microscopía intravital y las modalidades de imagen clínicamente aplicables.

<table><tbody><tr><td><Materiales > cultivo celular fuerte</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BxPC-3 Células de cáncer de páncreas humano</td><td>ATCC (Colección de cultivo tipo americano)</td><td>CRL-1687</td><td></td></tr><tr><td>Matriz de membrana basal Corning Matrigel , sin LDEV, 10 mL</td><td>Corning</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Corning Stripettor Ultra Pipet Controller</td><td>Corning</td><td>07-202-350</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco Solución salina tamponada con fosfato sin rojo, calcio, magnesio o fenol, 500 mL</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (Canadá), 500 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1051-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina 100x (líquido, estabilizado, filtrado estéril, probado en cultivo celular)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333-100ML</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medio 1640 (1x), líquido; con L-Glutamina, 500 mL</td><td>Gibco</td><td></td><td></td>11875093</tr><tr><td>Enzima TrypLE Express, 500 mL</td><td>Gibco</td><td>12605028</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Materiales de la cámara de ventana</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>12 mm Cubreobjetos de vidrio</td><td>Harvard Apparatus&nbsp; &nbsp;</td><td>CS-12R No. 1.5</td><td></td></tr><tr><td>Connex 500 Impresora 3D</td><td>Stratasys</td><td>N/A Resina</td><td></td></tr><tr><td>MED610 transparente biocompatible</td><td>Stratasys</td><td>&nbsp; RGD810</td><td></td></tr><tr><td>Loctite AA 3105 Pegamento curable UV</td><td>Loctite</td><td>LCT1214249</td><td></td></tr><tr><td>Marco trasero de la cámara de la ventana</td><td>Trimech Inc</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Marcador fiducial de la cámara de la ventana</td><td>Trimech Inc</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Marco delantero de la cámara de la ventana</td><td>Trimech Inc</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Clip de soporte de la cámara de la ventana</td><td>Trimech Inc</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td><Materiales > Inoculación y Cirugía Strong</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Jeringas de insulina SafetyGlide con agujas fijas permanentes, 0,5 ml, 29 g x 1/2"</td> <td>BD</td><td>CABD305932</td><td></td></tr><tr><td>Solución Betadine</td><td></td><td>Betadine AP-B002C2R98U</td><td></td></tr><tr><td>Cidex OPA Solución de 14 días 3.8 L</td><td>ASP</td><td>JOH20394</td><td></td></tr><tr><td>Almohadillas quirúrgicas desechables de 23 pulgadas x 24 pulgadas</td><td>Kendall</td><td>7134</td><td></td></tr><tr><td>Lubricante para ojos&nbsp; &nbsp;</td><td>Optixcare</td><td>50-218-8442</td><td></td></tr><tr><td>Crema depilatoria</td><td>Nair</td><td>&lrm; </td><td></td>061700222611</tr><tr><td>Halstead Pinzas Hemostáticas</td><td>Almedic</td><td>7742-A12-150</td><td></td></tr><tr><td>Almohadilla térmica</td><td>Sunbeam&nbsp;</td><td></td><td></td>B086MCN59R</tr><tr><td>Tijeras de iris</td><td>Almedic</td><td>7601-A8-690</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Sigma</td><td>792632</td><td></td></tr><tr><td>Metacam</td><td>; Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc</td><td>NDC 0010-6015-03</td><td></td></tr><tr><td>NOD. Cg-Rag1tm1Mom&nbsp; Il2rgtm1Wjl/SzJ</td><td>ratón el laboratorio Jackson</td><td>7799</td><td></td></tr><tr><td>Peanut Clipper & Recortadora</td><td>Wahl</td><td>8655-200</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; SOFSILK Sutura quirúrgica no absorbible #5-0 con aguja de punta cónica de 3/8" (17 mm) (recubierta de cera, seda negra trenzada, estéril)&nbsp;</td><td>&nbsp; Sinetura&nbsp;</td><td>&nbsp; VS880</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de astilla</td><td>Almedic</td><td>7725-A10-634</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>MR Imaging</fuerte>dispositivo de</td> inmovilización de cámara de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ventana impreso en 3D.</td><td></td><td></td><td>impreso en 3D personalizado, consulte la figura 3 para obtener más detalles.</td></tr><tr><td>Dispositivo de calentamiento por convección</td><td>3M Bair Hugger</td><td>70200791401</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de inyección de drogas</td><td>Harvard Apparatus&nbsp; &nbsp;</td><td>PY2 70-2131</td><td>PHD 22/2200 Bomba de jeringa compatible con resonancia magnética</td></tr><tr><td>Gadovist 1.0</td><td>Bayer</td><td>2241089</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de monitorización respiratoria</td><td>SAII</td><td>Modelo 1030</td><td>Sistema de monitorización y compuerta compatible con RM para pequeños animales.</td></tr><tr><td>Catéter de vena de cola (27 G 0.5")</td> <td>Terumo Medical Corp</td><td>15253</td><td></td></tr><tr><td>Optical Imaging</td>Etapa <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>de imagen impresa en 3D</td><td>Impresión 3D personalizada, consulte la figura complementaria 3 para obtener más detalles.</td></tr><tr><td>12 V 7 W Placa calefactora de poliimida flexible Adhesivo fino Película calefactora PI 25 mm x 50 mm</td><td>BANRIA&nbsp;</td><td>B09X16XCVS</td><td>Elemento calefactor utilizado para la regulación de la temperatura del cuerpo del ratón.</td></tr><tr><td>Fuente de alimentación de CC</td><td>BK Precission</td><td>1761</td><td>Se utiliza para alimentar el elemento calefactor.</td></tr>Sistema de imagen <tr><td></td><td></td><td></td> Leica MZ FLIII Leica Microsystems 15209 <td></td></tr><tr><td>svOCT</td> Sistema de imagen de fabricación propia.<td></td><td></td><td> Los detalles se pueden encontrar en la referencia 23.</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB Software</td><td>MathWorks</td><td>R2020A</td><td></td></tr></tbody></table>

un modelo de ratón tumoral con cámara de ventana de pliegue cutáneo dorsal para la microscopía intravital combinada y la resonancia magnética en la investigación traslacional del cáncer

A Dorsal Skinfold Window Chamber Tumor Mouse Model for Combined Intravital Microscopy and Magnetic Resonance Imaging in Translational Cancer Research

Las imágenes intravitales preclínicas, como la microscopía y la tomografía de coherencia óptica, han demostrado ser herramientas valiosas en la investigación del cáncer para visualizar el microambiente tumoral y su respuesta al tratamiento. Estas modalidades de imagen tienen una resolución a escala micrométrica, pero tienen un uso limitado en la clínica debido a su poca profundidad de penetración en el tejido. Las modalidades de imagen más clínicamente aplicables, como la TC, la RMN y la PET, tienen una profundidad de penetración mucho mayor, pero tienen una resolución espacial (escala mm) comparativamente más baja. 
Para trasladar los hallazgos de las imágenes intravitales preclínicas a la clínica, se deben desarrollar nuevos métodos para cerrar esta brecha de resolución entre lo micro y lo macro . Aquí describimos un modelo de ratón tumoral con cámara de ventana de pliegue cutáneo dorsal diseñado para permitir la obtención de imágenes preclínicas intravitales y clínicamente aplicables (TC y RM) en el mismo animal, y la plataforma de análisis de imágenes que vincula estos dos métodos de visualización dispares. Es importante destacar que el enfoque de cámara de ventana descrito permite que las diferentes modalidades de imagen se registren conjuntamente en 3D utilizando marcadores de referencia en la cámara de ventana para una concordancia espacial directa. Este modelo se puede utilizar para la validación de los métodos de imagen clínica existentes, así como para el desarrollo de otros nuevos a través de la correlación directa con los hallazgos intravitales de alta resolución "ground truth". 
Por último, la respuesta tumoral a diversos tratamientos -quimioterapia, radioterapia, terapia fotodinámica- puede monitorizarse longitudinalmente con esta metodología utilizando modalidades de imagen preclínicas y clínicamente aplicables. Por lo tanto, el modelo de ratón tumoral con cámara de ventana de pliegue cutáneo dorsal y las plataformas de imágenes descritas aquí se pueden utilizar en una variedad de estudios de investigación sobre el cáncer, por ejemplo, para traducir los hallazgos de microscopía intravital preclínica a modalidades de imagen más aplicables clínicamente, como la TC o la RMN.

Se realizó una tomografía de coherencia óptica de varianza moteada (svOCT) para obtener imágenes microvasculares 3D de gran campo de visión (FOV) (6 x 6 mm,2 laterales x 1 mm de profundidad). Para la obtención de estas imágenes, se utilizó un sistema OCT de fuente de barrido previamente descrito, basado en un interferómetro de cuadratura23 23. Las imágenes de OCT se adquirieron uniendo dos escaneos FOV de 3 x 6 mm2 adyacentes lateralmente. Cada B-scan constó de 400 A-scans y se realizó 24x por ubicación (con 25 ms de diferencia) para permitir un procesamiento preciso de la varianza de moteado, como se describe en nuestro trabajo anterior24.
Para registrar conjuntamente el conjunto de datos de resonancia magnética con el conjunto de datos de svOCT microvascular, se realizaron varios pasos. El primer paso se realizó en el paso 5.12 y se ilustra en la Figura 4. Este paso registra conjuntamente los dos conjuntos de datos a lo largo de la dirección de la profundidad (eje z en la Figura 4). Para registrar conjuntamente los conjuntos de datos a lo largo de las dimensiones laterales (plano xy en la Figura 4), se utiliza el anillo marcador fiducial junto con una serie de dos registros afines basados en puntos. En primer lugar, el conjunto de datos de resonancia magnética se registra conjuntamente en la imagen de microscopía de campo claro haciendo coincidir las ubicaciones de los marcadores de referencia en el anillo, con las hendiduras correspondientes alrededor del perímetro de la ventana de vidrio en el marco frontal (puntos verdes en la Figura 5B, C). A continuación, los puntos de referencia vasculares que son identificables tanto en el conjunto de datos microvasculares de svOCT como en la imagen de microscopía de campo claro se utilizan para registrar conjuntamente la imagen de campo claro (y el conjunto de datos de resonancia magnética correspondiente) en el conjunto de datos de svOCT (puntos azules en la Figura 5A, B). Por lo tanto, la imagen de microscopía de campo claro actúa como una imagen de resolución intermedia que contiene características tanto de la resonancia magnética (ubicaciones de divot para marcadores de referencia) como de la imagen microvascular svOCT (puntos de referencia microvasculares) para permitir el registro conjunto multimodal en resoluciones de imagen muy diferentes.
En la Figura 6A-C y en la Figura 6D-F, respectivamente, se muestran imágenes del éxito del registro conjunto entre las tres modalidades (imágenes microvasculares, microscopía de campo amplio y resonancia magnética) para un ratón de preparación en cámara de ventana sin tumor (piel desnuda sana) y un tumor. Una vez que las tres modalidades están co-registradas, se puede realizar un análisis de correlación. Para aprovechar los conjuntos de datos registrados conjuntamente, las correlaciones espaciales deben realizarse vóxel por vóxel o mediante el uso de técnicas de promediación adecuadas en volúmenes seleccionados de interés. En la figura 7 se muestran algunos resultados representativos de la correlación entre las métricas microvasculares derivadas de la svOCT y las métricas macrovasculares funcionales derivadas de la resonancia magnética. Estos gráficos incluyen los datos de dos ratones portadores de tumores y un ratón "sano" con piel desnuda. Estos gráficos se generaron utilizando una técnica de volumen de interés (VOI) de ventana corredera (VOI) de1 mm 2 lateral x 500 μm de profundidad con un tamaño de escalón lateral de 500 μm, con cada punto representando una posición de la VOI. Para el ratón sano, el análisis vascular se restringió a una región de interés de 3 x 3mm2 en el centro del campo de visión para que coincidiera con la extensión espacial 3D de los tumores examinados. Un estudio más detallado que involucra las correlaciones entre la svOCT y la RM utilizando este método de análisis se puede encontrar en nuestro trabajo reciente22.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66383/66383fig06.jpg"> Figura 6: Conjuntos de datos de imágenes sanas y tumorales corregistradas. La fila superior muestra la (A) imagen de microscopía de campo claro codificada en profundidad en color, (B) imagen de microscopía de campo claro corregistrada con la región de análisis mostrada por la línea de puntos azul y (C) mapa de parámetros DCE-MRI co-registrado para un ratón sano de piel desnuda. La fila inferior muestra la imagen de microscopía de campo claro codificada en profundidad en color (D) codificada en profundidad, (E) la imagen de microscopía de campo claro corregistrada con el contorno tumoral mostrado por la línea punteada azul y (F) el mapa de parámetros DCE-MRI registrado conjuntamente para un ratón portador de tumor. Los vóxeles negros en C y F están fuera de la región de análisis y del tumor, respectivamente, por lo que no se consideran. Barras de escala = 1 mm. Abreviaturas: svOCT = tomografía de coherencia óptica de varianza moteada; DCE-MRI = resonancia magnética dinámica con contraste. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66383/66383fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
La Figura 7A muestra el parámetro k transde la RM frente a la fracción de volumen vascular (FVV) medida por la svOCT. VVF es la proporción de tejido que está ocupado por vasos y ktrans es la constante de velocidad para el gadolinio que se mueve del espacio intravascular al espacio extravascular. ktransse obtiene ajustando el modelo de Toft a las curvas de concentración de tiempo de gadolinio sobre una base de vóxel a vóxel25,26. Las mediciones de VVF de svOCT muestran que los tumores tienen un VVF más pequeño que el tejido sano, lo que podría indicar la presencia de regiones mal vascularizadas dentro del tumor. Dado que la ktransdepende del flujo sanguíneo, la permeabilidad vascular y la superficie capilar25,26, se espera una correlación positiva entre la ktransy la FVV, ya que una FVV mayor implica una mayor superficie vascular y flujo sanguíneo. Sin embargo, se necesitan más estudios, como los experimentos de extravasación con dextrano, para dilucidar aún más el impacto de la permeabilidad de los vasos tumorales en esta relación27.
La Figura 7B muestra la correlación entre el tiempo hasta el aumento del contraste máximo (TTP) de la RMN frente a la distancia media de la svOCT al vaso más cercano (<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66383/66383eq02.jpg" style="margin: auto;">). El TTP es una métrica semicuantitativa que mide el tiempo necesario para que la curva de concentración de tiempo de gadolinio alcance su valor máximo y se calcula vóxel por vóxel26. Se <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66383/66383eq02.jpg" style="margin: auto;"> trata de una métrica microvascular svOCT que mide la distancia media al vaso más cercano dentro del volumen analizado22. En general, hay un menor <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66383/66383eq02.jpg" style="margin: auto;"> tamaño en el tejido sano en comparación con el tejido tumoral, lo que indica que la microvasculatura sana está más densamente empaquetada, lo que conduce a un tejido oxigenado más uniforme, y el tejido tumoral está menos vascularizado28. Los valores más altos <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66383/66383eq02.jpg" style="margin: auto;"> en el tejido tumoral pueden indicar la presencia de regiones de tejido avascular. La figura 7B muestra una correlación positiva entre TTP y <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66383/66383eq02.jpg" style="margin: auto;">. Esto demuestra que el tejido sano está bien vascularizado con el lavado de gadolinio dentro y fuera del tejido de manera eficiente y rápida. Sin embargo, la microvasculatura tumoral es más malformada con mayores distancias intervasculares, lo que aumenta el tiempo para que el gadolinio llegue al tejido, lo que resulta en un aumento de la TTP.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66383/66383fig07.jpg"> Figura 7: Correlaciones espaciales entre resonancia magnética y svOTT, macro y microvascular. Estos gráficos contienen los hallazgos de dos ratones portadores de tumores y un ratón sano con piel desnuda utilizando un VOI de ventana corredera de x 1 x 1 mm2 lateral × 500 μm de profundidad con un tamaño de paso de 500 μm, donde cada punto representa los valores promedio de la métrica dada para una posición de la VOI de ventana corredera. Abreviaturas: svOCT = tomografía de coherencia óptica de varianza moteada; DCE-MRI = resonancia magnética dinámica con contraste; VOI = volumen de interés. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66383/66383fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Archivo complementario 1: Archivos STL 3D de componentes de la cámara de ventana. Un archivo zip que contiene los 4 componentes de la cámara DSFC (marco frontal, marco trasero, clip de soporte y anillo marcador de referencia), que se utilizó para imprimir en 3D las piezas. Abreviatura: DSFC = cámara de ventana del pliegue cutáneo dorsal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66383/Supplementary%20file%201.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo complementario 2: Script de MATLAB para el co-registro de imágenes multimodales. Este script de MATLAB (Multimodal_Image_Register.m) toma la microscopía de campo claro, los datos de imágenes microvasculares y las imágenes de RM estructurales y funcionales (mapas de parámetros DCE y/o IVIM) y genera todos los conjuntos de datos registrados conjuntamente en el conjunto de datos microvasculares. El script de MATLAB está escrito para admitir los siguientes formatos de archivo: MRI - .dcm, svOCT - .mat y microscopía - .jpg, o . TIF. El código de MATLAB se escribe para acomodar los tamaños/resoluciones de archivo que se describen en la sección de protocolo: MRI - Campo de visión de 32 x 32 mm con matriz de 64 x 64 para una resolución en el plano de 0,5 x 0,5 mm; 10 cortes de imagen contiguos, microscopía - imagen 2D con un campo de visión de &gt;1,5 cm2 (cualquier resolución aceptable) y svOCT - campo de visión de 6 x 6 mm con resolución de 7,5 μm. El código de MATLAB debe modificarse si se utilizan diferentes formatos de archivo, resolución de imagen o campos de visión de imagen. Abreviaturas: DCE = contraste dinámico mejorado; IVIM = movimiento incoherente intravóxel; RM = imágenes por resonancia magnética; svOCT = tomografía de coherencia óptica con varianza moteada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66383/Multimodal_Image_Register.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura suplementaria S1: Suturas temporales para fijar la cámara de la ventana a la piel del ratón. La sutura comienza en (1) y atraviesa la parte frontal de la piel del ratón y atraviesa el marco frontal de la cámara de la ventana. (2) Luego, la sutura atraviesa la piel posterior del ratón y sale por el marco trasero de la cámara de la ventana. A continuación, la sutura se enhebra de nuevo a través del marco posterior, (3) en la piel de la parte trasera, a través del marco delantero y (4) de vuelta fuera de la piel delantera. (5) A continuación, la sutura se devuelve a través de los marcos DSFC y las capas de la piel. (6) Finalmente, la sutura se devuelve a través del orificio superior de la cámara de la ventana y todas las capas de la piel. A continuación, el conjunto de piel DSFC + se une apretando y anudando las suturas en (1). Abreviatura: DSFC = cámara de ventana del pliegue cutáneo dorsal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66383/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura complementaria S2: Colocación óptima de las suturas permanentes. Las suturas permanentes deben enhebrarse a través de la piel/marco delantero fuera de la piel/marco posterior, volver a través de todo el conjunto y anudarse en el frente. Cada número representa una sutura individual. Las suturas deben colocarse en el orden de los números para aplicar presión de manera uniforme a todo el conjunto a medida que se asegura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66383/Supplementary%20Figure%202.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura suplementaria S3: Platina impresa en 3D para la obtención de imágenes de microscopía intravital. (A) Se utiliza una platina impresa en 3D con un accesorio de anestesia de gas isoflurano para la obtención de imágenes de microscopía intravital. (B) La cámara de la ventana está asegurada al escenario por tres pernos para inmovilizarla y eliminar cualquier movimiento respiratorio. (C) Dos elementos calefactores conectados en serie a una fuente de alimentación de CC están pegados a la parte inferior de la platina para mantener la temperatura corporal del ratón mientras está anestesiado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66383/Supplementary%20Figure%203.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

La traslación de los hallazgos de la microscopía intravital se ve desafiada por su poca profundidad de penetración en el tejido. Aquí describimos un modelo de ratón de cámara de ventana dorsal que permite el registro conjunto de la microscopía intravital y las modalidades de imagen clínicamente aplicables (p. ej., TC, RM) para la correlación espacial directa, lo que podría agilizar la traducción clínica de los hallazgos de la microscopía intravital.

Un modelo de ratón tumoral con cámara de ventana de pliegue cutáneo dorsal para la microscopía intravital combinada y la resonancia magnética en la investigación traslacional del cáncer

Preclinical intravital imaging such as microscopy and optical coherence tomography have proven to be valuable tools in cancer research for visualizing the ...

Las imágenes intravitales preclínicas tienen una resolución muy alta, pero una penetración de profundidad limitada en el tejido, lo que las hace muy buenas para estudios de imágenes preclínicas. Por otro lado, la resonancia magnética es mucho más aplicable clínicamente y tiene una penetración en mayor profundidad, pero una resolución espacial muy baja. El objetivo de este estudio es correlacionar estas dos modalidades entre sí con el fin de traducir mejor nuestros hallazgos de la microscopía intravital preclínica a la clínica a través de imágenes de resonancia magnética.Los métodos de imagen sensibles a la perfusión en resonancia magnética y biofotónica, incluido nuestro sistema de tomografía de coherencia óptica y geografía, están revelando cómo la microvasculatura afecta la respuesta tumoral a la radioterapia hipofraccionada. La impresión 3D también está ayudando a través de la fabricación rentable de herramientas personalizadas, lo que facilita los estudios longitudinales. Por último, el análisis de imágenes de IA está facilitando la identificación de nuevos biomarcadores predictivos de radioterapia.Hemos hecho varios hallazgos sobre la respuesta tumoral a la radioterapia hipofraccionada, incluyendo más recientemente, la cinética temporal de las métricas de respuesta tisular derivadas de la IA radiobiológicamente significativas y abstractas. Además, hemos demostrado la promesa de que las imágenes multimodales se realicen con mayor precisión, correlacionando tanto la resonancia magnética, la tomografía de coherencia macroscópica y óptica, la microscopía y las métricas derivadas de la angiografía. Al ampliar la duración efectiva de los estudios longitudinales, podemos identificar mejor los biomarcadores predictivos de la respuesta al tratamiento tumoral a largo plazo.Además, al mejorar la solidez del corregistro entre las modalidades de imágenes macroscópicas clínicamente disponibles y las modalidades de imágenes microscópicas preclínicas, podemos mejorar la traducibilidad de nuestros hallazgos de la mesa de trabajo a la cabecera del paciente. Durante una radioterapia corporal estereotáctica, las dosis altas de radiación administran un número reducido de fracciones. Un posible objetivo radiobiológico asociado con el aumento de la muerte celular en la RVSIS es la microvasculatura tumoral.Al combinar la angiografía óptica de alta resolución y la resonancia magnética, queremos permitir la obtención de imágenes microvasculares funcionales por resonancia magnética para la planificación del tratamiento de SVRT específico del paciente y mejorar los resultados.

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Aprende a integrar microscopía intravital con resonancia magnética en un modelo de cámara de ventana dorsal en ratón. Este método combina alta resolución óptica con penetración profunda para estudiar la respuesta tumoral a la radioterapia hipofraccionada y mejorar la traducción clínica.

Un modelo de ratón tumoral con cámara de ventana de pliegue cutáneo dorsal para la microscopía intravital combinada y la resonancia magnética en la investigación traslacional del cáncer (Video) | JoVE Journal

Un modelo de ratón tumoral con cámara de ventana de pliegue cutáneo dorsal para la microscopía intravital combinada y la resonancia magnética en la investigación traslacional del cáncer

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