Las solicitudes de microfluidos para el diagnóstico desechables

Mi nombre es Catherine CloudBridge y soy profesora de fabricación, ingeniería e ingeniería biomédica en la Universidad de Boston. Además, soy directora del Laboratorio de Microdispositivos y Microentornos Biomédicos. Nuestro trabajo se centra principalmente en el desarrollo de diagnósticos desechables para aplicaciones en entornos con recursos limitados.

Por eso utilizamos la microfluídica para fabricar esos dispositivos. Estamos interesados en realidad en dos campos de estudio. Principalmente, nos interesa analizar cómo las biomoléculas y las células interactúan con superficies de polímeros plásticos.

Ese es nuestro paraguas principal. Ese trabajo se concreta en aplicaciones microfluídicas para diagnósticos desechables. Así pues, en el laboratorio, lo que fabricamos son dispositivos microfluídicos.

En materiales termoplásticos, no utilizamos típicamente PDMS, que es el material elastomérico que la mayoría de las personas emplean para fabricar microfluidos en el laboratorio. Fabricamos nuestros dispositivos a partir de termoplásticos. Estamos interesados en utilizar estos dispositivos termoplásticos para realizar biología molecular a escala microscópica, de manera que dicha biología molecular pueda llevarse a cabo en el campo, lejos de un laboratorio centralizado.

Cómo funciona esto en el laboratorio es que estamos fabricando pequeñas tarjetas de plástico y dentro de esas pequeñas tarjetas hay columnas de extracción en fase sólida, columnas de lisis celular o columnas de mezclado. También realizamos la reacción en cadena de la polimerasa en el chip como técnica de detección. Todas estas funciones están integradas en un dispositivo pequeño que, a largo plazo y desde la perspectiva de la investigación, terminaría siendo un dispositivo integrado que podría usarse de forma portátil en el campo o en entornos donde no se dispusiera de un laboratorio a gran escala con centrífugas, incubadoras de calentamiento y demás equipos auxiliares.

Por lo tanto, nos gustaría poder comenzar idealmente con una muestra humana como sangre, orina, heces o un hisopo nasofaríngeo, por ejemplo, que sería moco. Y luego, a la salida del chip, obtener una respuesta afirmativa o negativa sobre si una persona está infectada o no con un microorganismo específico. La forma en que hacemos esto es buscando el ADN o ARN de ese microorganismo particular, según el caso, en la muestra del paciente.

Por lo tanto, los desafíos técnicos que surgen son principalmente en el aspecto de la preparación de la muestra en esa ecuación. Cuando se comienza con sangre, heces o orina, se debe pasar de una situación en la que se tiene una muestra humana compleja, con muchas partículas potenciales o inhibidores de la PCR u otras técnicas de amplificación, a obtener al final una muestra de ácidos nucleicos muy pura y eluida, que luego pueda utilizarse para amplificar o detectar un ADN o ARN específico que indique si el microorganismo que se busca estaba presente.

Por lo tanto, para limpiar esas muestras, debe realizar varias acciones. Primero, debe filtrar la muestra, lo cual, dependiendo del tipo de muestra, puede implicar una filtración gruesa o un breve paso de centrifugación antes de colocar la muestra en el chip. Así que siempre intentamos comenzar con las muestras tal como llegan del clínico.

Entonces, con orina, heces y hisopos nasofaríngeos, nuestro objetivo es que el clínico realice su trabajo como lo haría normalmente y tome la muestra del modo habitual. Luego, nosotros tomamos esa muestra y la colocamos en los chips. De modo que si en esa etapa se necesita alguna filtración adicional, dicha filtración ocurriría dentro del chip.

El segundo paso implica, dado que estamos realizando ensayos moleculares, que debemos lisar las células y los microorganismos presentes en esa muestra. Por lo tanto, realizamos un paso de lisis, que generalmente consiste en forzar la muestra a través de un filtro con un tamaño de poro pequeño. A veces, ese filtro también contiene nanopartículas como nanotubos de carbono, que tienen bordes afilados y pueden utilizarse para romper algunos de los organismos que poseen paredes celulares más resistentes, como C difficile, una bacteria grampositiva con la que trabajamos y que es muy difícil de lisar.

Por lo tanto, debemos tener columnas de lisis más resistentes. Pero normalmente realizamos una lisis química y mecánica combinada dentro del chip. Después de eso, nuestro objetivo es tomar el lisado y luego extraer los ácidos nucleicos purificados.

Así, pasamos la lisado, pasamos el lisado sobre una columna de extracción en fase sólida que está integrada en el chip microfluídico. Y esta columna de extracción en fase sólida está hecha de plástico y se fabrica mediante química iniciada por luz dentro del canal microfluídico después de que este ya haya sido construido. Además, generalmente está impregnada con partículas de sílice porque deseamos unir y liberar ácidos nucleicos.

En algunos casos, hemos incorporado perlas con oligo DT si deseamos unir y liberar específicamente el ARNm, por ejemplo, o perlas que tienen anticuerpos particulares, si queremos unir y liberar proteínas específicas. Y podemos fabricar columnas de extracción que realicen todas esas funciones. Pero hoy les mostraremos cómo fabricar la columna de extracción sase con las perlas de sílice.

Entonces, después de haber hecho eso, pase el lisado sobre la columna de sílice; funciona exactamente como lo haría un kit kyogen en un laboratorio a escala macro. Luego realizamos lavados para eliminar todas las sustancias que no deseamos, como los carbohidratos, los lípidos y otros componentes presentes en el lisado celular y en el resto de la muestra humana que no necesitamos. Y al final, eluimos con agua.

Y lo bueno de estas columnas de extracción en fase sólida a microescala es que podemos eluir con una cantidad muy pequeña de agua, normalmente del orden de uno a cinco microlitros. Y estamos recuperando casi todos los ácidos nucleicos que introdujimos. Tenemos una eficiencia del 70 al 90 % en los primeros 10 microlitros que recuperamos de ese canal.

Entonces, si realizamos dos lavados con dos a 10 microlitros, recuperamos casi todos los ácidos nucleicos que colocamos allí. Por lo tanto, no solo se obtiene una muestra limpia apta para PCR, sino también una muestra mucho más concentrada de lo que se podría obtener con un kit estándar de banco de trabajo. Así, el objetivo final de todas estas técnicas de preparación de muestras es obtener productos compatibles con otros trabajos que las personas ya han realizado.

Excelente trabajo en el campo que demuestra que se puede realizar la amplificación por PCR en un chip. Se puede llevar a cabo la reacción de transcriptasa inversa en un chip si se trabaja con un virus de ARN o si se desea realizar un experimento de expresión génica. Nuestras técnicas de preparación de muestras pueden acoplarse directamente con la PCR en un chip, por lo que no sería necesario realizar ninguna de esas tareas de limpieza y preparación de muestras en el banco de trabajo.

Y, además, también el paso de concentración que sería necesario realizar para obtener los pequeños volúmenes necesarios para llevar a cabo una PCR multiplex en un chip pequeño. Así que los experimentos que les mostraremos hoy demuestran cómo ensamblamos el chip microfluídico, que está fabricado con termoplástico y no con PDMS. Por lo tanto, requiere un proceso de fabricación un poco diferente al que se utiliza habitualmente, así como también un método distinto para sellar esos chips.

Y luego, cómo realizamos la química iniciada por luz dentro del chip para formar monolitos poliméricos que se utilizan tanto para la lisis celular como para la extracción en fase sólida. Y al final de ese proceso, que actualmente son procesos modulares en el laboratorio, pero que pueden y han sido integrados, se obtiene una muestra altamente concentrada de ácidos nucleicos, ARN y ADN en agua, que luego puede dirigirse a un módulo de PCR o a otro módulo de amplificación donde puede producirse la identificación de un microorganismo o una infección. Así que en realidad tenemos una subvención en la que estamos trabajando actualmente, en la que ya hemos comenzado a recolectar muestras humanas del Centro Médico de Boston procedentes de pacientes que pueden o no estar infectados con Influenza A. Dado que es temporada de gripe, esas son las muestras que estamos recolectando.

Luego, en el laboratorio, realizamos los ensayos considerados estándar de oro para determinar si una persona está infectada con Influenza A, que básicamente consiste en un ensayo de cultivo, el cual requiere varios días para llevarse a cabo. Paralelamente, procesamos estas muestras a través de los módulos de nuestro chip. Así, las pasamos por la columna de lisis, luego por la columna de extracción en fase sólida y finalmente realizamos la PCR para evaluar nuestro desempeño en comparación con los métodos estándar de oro.

Entonces, esa es la etapa en la que nos encontramos actualmente. Si esos experimentos tienen éxito, creo que en los próximos, digamos, cuatro a seis años quizás estaremos en una situación en la que contemos con un chip integrado y un ensayo completo para la influenza A, y además estamos trabajando en el *Clostridium difficile* y en muestras de heces. Y estamos, estamos, también muy cerca de tener no solo el dispositivo integrado, sino también el ensayo integrado.

Por lo tanto, el desarrollo del ensayo y el diseño del chip deben avanzar de la mano. Así, para una aplicación específica dirigida al uso en el lecho del paciente, se trata realmente de un proceso orientado a un objetivo. Es necesario conocer la muestra con la que se comienza y el microorganismo que se busca, con el fin de optimizar el chip para su uso en el punto de atención.

Así que yo, yo no creo que estemos tan lejos de lograrlo de manera prototípica. Esos son nuestros objetivos finales, así que espero que lleguemos allí.