Name: Ingeniería de células asesinas naturales con receptor de antígeno quimérico dirigidas a infecciones fúngicas utilizando el sistema de transposones no viral de la Bella Durmiente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Aprende a generar células CAR-NK no víricas con el sistema de transposones Sleeping Beauty para combatir infecciones fúngicas invasivas por Aspergillus fumigatus. Este método ofrece una terapia celular escalable y accesible.

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<meta charset="utf8"></head><body>Enfoque de la Bella Durmiente para obtener células CAR-NK para atacar patógenos fúngicos

<ol><li>Fang, W., Latgé, J. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbe+profile%3A+Aspergillus+fumigatus%3A+A+saprotrophic+and+opportunistic+fungal+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+%28Reading%29%22%5BJournal%5D)">Microbe profile: Aspergillus fumigatus: A saprotrophic and opportunistic fungal pathogen.</a> Microbiology (Reading). 164 (8), 1009-1011 (2018).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>Tubos de fondo cónico de 15 ML</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td>PP, 17/120 MM, CELLSTAR, ESTÉRIL Tubos</td></tr><tr>de<td>fondo cónico de 50 ML</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227270</td><td>PP, 30/115 MM, CELLSTAR, ESTÉRIL</td></tr><tr><td>placa de cultivo celular de 6 y 96 pocillos</td><td>Corning Inc. LifeSciences</td><td>83-3736/ 83-3474</td><td>Placas de pocillos múltiples tratadas con TC, fondos planos, Tratados para una fijación óptima de las células, Esterilizado por irradiación gamma, BD</td></tr> <tr><td></td><td>Biosciences</td><td>559925</td><td>colorante de ácido nucleico fácil de usar para la exclusión de células no viables en ensayos de citometría de flujo</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anti-EGFR humano</td><td>Biolegend</td><td>352918</td><td>clon de Biolegend AY13</td></tr><tr><td>MicroBeads anti-biotina</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>13-105-637</td><td>MicroBeads ultrapuras conjugadas con anti-biotina de ratón monoclonal anticuerpos</td></tr><tr><td>Aspergillus fumigatus</td><td>ATCC</td><td>46645</td><td></td></tr><tr><td>Biosphere Puntas de filtro (20 y 100 &mu; L)&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>70.3030.365 / 70.3030.275</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime; s Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>&nbsp; Modificado, sin cloruro de calcio y cloruro de magnesio, líquido, filtrado estéril, apto para cultivo celular, endotoxina, probado</td></tr><tr><td>ELISA MAX Deluxe Set IFN-& gamma humano;</td><td>Biolegend</td><td>430104</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina disódica de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7889</td><td>para biología molecular, 0.5&nbsp; M en H2O, DNasa, RNasa, NICKasa y proteasa, no se detectó ninguna, 0,2 &mu; m filtrado.</td></tr><tr><td>FACS clean</td><td>BD Biosciences</td><td>340345</td><td></td></tr><tr><td>FACS Flow Sheath Fluid</td><td>BD Biosciences</td><td>342003</td><td></td></tr><tr><td>FACS Solución de enjuague BD</td><td>Bioscience</td><td>340346</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td>estéril filtrado, apto para cultivo celular, inactivado por calor antes de usar</td></tr><tr><td>Gibco, MEM &alpha;, nucleósidos</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>22571020</td><td>Rojo de fenol, ribonucleósidos, desoxirribonucleósidos, bicarbonato de sodio</td></tr><tr><td>Suero de caballo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16050122</td><td>Estéril Filtrado, inactivado por calor antes de usar</td></tr><tr><td>IL-2 IS humano, grado de investigación</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-742</td><td>Grado de investigación. El ED50 es &le; 0,3 ng/mL, correspondiente a una actividad de &ge; 3 y veces; 106</s> UI/mg.</td></tr><tr><td>Ionomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0634-1MG</td><td>de Streptomyces conglobatus, utilizada como control positivo para la secreción de citocinas&nbsp;</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W368401</td><td>para cultivo celular</td></tr><tr><td>MACS LS Column</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>&nbsp; Columnas y émbolos, embalados estériles</td></tr><tr><td>NK-92</td><td>DSMZ</td><td>ACC 488</td><td></td></tr><tr><td>Neon Transfektionssystem 100&nbsp; &mu; L-Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MPK10096</td><td>Tampón de resuspensión R, Tampón electrolítico E2, 100 &mu; L Puntas de neón, tubos de electroporación de neón</td></tr><tr><td>Phorbol-12-myristat-13-acetato (PMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585-1MG</td><td>utilizado como control positivo para la secreción de citocinas&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubo de poliestireno de fondo redondo, 5 mL</td><td>BD Bioscience</td><td>S-452400</td><td>utilizado para citometría</td></tr><tr><td>de flujo Tubo de reacción, 1,5 ML</td><td>Greiner Bio-One</td><td>7,26,90,001</td><td>PP, transparente, tapón adherido, con graduación inyectada. Esterilizado antes de usar.&nbsp;</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medio, GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>72400021</td><td>GlutaMax I,&nbsp; Rojo de fenol, HEPES, TipOne</td></tr><tr><td>1000 con filtro estéril &mu; L XL Punta de filtro graduada</td><td>StarLab</td><td>S1122-1730</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCalibur</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubadora C60&nbsp;</td><td>Labotect</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge 3SR</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HydroFLEX lavadora de microplacas&nbsp;</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoQuant Infinite M200 Pro</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neon Transfection System</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetas&nbsp;</td><td>Separador Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quadro MACS&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ingeniería de células asesinas naturales con receptor de antígeno quimérico dirigidas a infecciones fúngicas utilizando el sistema de transposones no viral de la bella durmiente

Engineering Chimeric Antigen Receptor-Natural Killer Cells Targeting Fungal Infections Using the Non-viral Sleeping Beauty Transposon System

Todo el proceso de generación de células Af-CAR NK-92, incluida la transfección, la recuperación, el enriquecimiento y la expansión, dura aproximadamente 14 días. Después de la transfección, las células se cultivan y se dividen cada dos días. La viabilidad celular puede disminuir durante la primera división dos días después de la transfección. Típicamente, las células se recuperan 4 días después de la transfección y comienzan a proliferar, con un tiempo de duplicación de 48 h.
Después de la recuperación, se miden las eficiencias de la transfección y se espera que alcancen el 10-20% (resultados representativos mostrados en la Figura 3). El enriquecimiento de células positivas para EGFR a través de MACS aumenta el porcentaje de células Af-CAR NK-92 a más del 95% (resultados representativos mostrados en la Figura 4).
Se utilizaron cultivos con más del 95% de células Af-CAR para ensayos funcionales. Aquí, cocultivamos las células con tubos germinativos de A. fumigatus durante 6 h y medimos la secreción de IFN-ɣ como marcador de activación. Como se muestra en la Figura 5, las células Af-CAR exhibieron una secreción significativa de citocinas (media = 340,6 ± 86,5 pg/mL) en comparación con las células Mock NK-92 (media = 75,6 ± 19,5 pg/mL), lo que indica una activación sustancialmente mayor de las células Af-CAR (valor p = 0,03).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67424/67424fig01.jpg"> 
Figura 1: Tubos germinativos de Aspergillus fumigatus. Imagen microscópica de A. fumigatus después de 16 h de incubación. Se observan tubos germinativos y pequeñas hifas que se distribuyen de manera homogénea alrededor del pocillo. Barra de escala = 400 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67424/67424fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67424/67424fig02.jpg"> 
Figura 2: Cocultivo de tubos germinales de Aspergillus fumigatus con células NK-92. Imagen microscópica del cocultivo. Las células NK-92 forman grupos y están en contacto con los tubos germinativos de A. fumigatus . Barra de escala = 400 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67424/67424fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67424/67424fig03.jpg"> 
Figura 3: Eficiencia de la transfección evaluada por tinción para el marcador de transfección EGFR. El día 5, después de la electroporación, las células NK-92 se tiñeron con 7-AAD y anti-EGFR. Los resultados se muestran para un experimento representativo para (A) células Mock y (B) Af-CAR NK-92. La columna de la izquierda muestra diagramas de puntos del tamaño de la celda frente a la granularidad de la celda; la puerta está colocada en las celdas NK-92. Las celdas muertas se eliminan mediante el etiquetado 7-AAD (segunda columna). En la tercera columna se muestra el porcentaje de células EGFR+ vivas. Abreviaturas: EGFR = receptor del factor de crecimiento epidérmico; 7-AAD = 7-aminoactinomicina D; CAR = receptor quimérico de antígenos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67424/67424fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67424/67424fig04.jpg"> 
Figura 4: Resultados de la tinción de la superficie celular después del enriquecimiento de las células NK-92 que expresan el transgén. A la izquierda, se muestran las celdas simuladas. A la derecha, se muestran las celdas Af-CAR-NK. Los histogramas rojos representan las células sin teñir. Los histogramas azules representan las células teñidas correspondientes. La puerta se establece en las celdas EGFR+ ; Los números muestran el porcentaje de celdas positivas. Abreviaturas: EGFR = receptor del factor de crecimiento epidérmico; CAR = receptor quimérico de antígenos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67424/67424fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67424/67424fig05.jpg"> 
Figura 5: Secreción de citocinas de células NK activadas por tubos germinativos de Aspergillus fumigatus . Los diagramas presentan los resultados de la secreción de IFN-ɣ de células Af-CAR y Mock en cocultivo con hongos medidos por ELISA después de 6 h de cocultivo. Los datos mostrados son la media ± DE de tres experimentos realizados de forma independiente (n = 3). Valor p calculado por la prueba t de Welch utilizando GraphPad Prism 10, * p &lt; 0,05. Abreviaturas: NK = asesino natural; IFN-ɣ = interferón gamma; CAR = receptor quimérico de antígenos; ELISA = ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67424/67424fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Nombre</td>
			<td>Compañía</td>
			<td>Concentración de existencias</td>
			<td>Referencia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transposasa</td>
			<td>SB100X Mini Círculo</td>
			<td>Fábrica de plásmidos</td>
			<td>1 μg/μL</td>
			<td>19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transposón</td>
			<td>Plásmido Af-CAR</td>
			<td>Producido internamente</td>
			<td>1 μg/μL</td>
			<td>6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 1: ADN utilizado en este protocolo.
Figura suplementaria S1: Mapa de plásmidos del transposón Af-CAR: Esquema del vector plásmido y diseño del transposón CAR. Abreviaturas: EF1 = factor de elongación-1 promotor alfa; ORI = origen bacteriano de la replicación; LIR = repetición invertida a la izquierda; RIR: repetición invertida a la derecha; Cyto = Citoplasmático; Tm = Transmembrana. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67424/figure%20S1.pdf" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Ingeniería de células asesinas naturales con receptor de antígeno quimérico dirigidas a infecciones fúngicas utilizando el sistema de transposones no viral de la Bella Durmiente

Chimeric antigen receptor (CAR)-based cell therapies have shown impressive efficacy in the treatment of hematological malignancies. Recently, these ...

engineering-chimeric-antigen-receptor-natural-killer-cells-targeting

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video muestra una técnica para la modificación genética mediada por la ribonucleoproteína Cas9 de células asesinas naturales primarias (NK). Una ribonucleoproteína Cas9, que consiste en una endonucleasa Cas9 unida a un ARN guía (ARNg) formado por el emparejamiento de bases de un ARN CRISPR (ARNcr) y un ARNc transactivador (ARNtrac), se introduce en las células asesinas naturales primarias mediante electroporación. La ribonucleoproteína se dirige y escinde el ADN del huésped en el sitio...

Una técnica para la edición de genes en células asesinas naturales utilizando CRISPR Cas9

Las células T que expresan un receptor CD19 específico de antígeno quimérico (CAR) se infunden como tratamiento de investigación de células B malignas en nuestros primero en humanos ensayos de terapia génica. Se describe la modificación genética de las células T utilizando...

Aplicación clínica de<em&gt; La Bella Durmiente</em&gt; Artificial y células presentadoras de antígenos para modificar genéticamente las células T de la sangre del cordón umbilical y periférica

El objetivo de este estudio fue elaborar tecnologías que permiten la transducción génica exitosa en natural killer (NK) las células primarias. La transducción lentivirales dextrano-mediada de humanos o resultados primarios de las células NK del ratón en una mayor eficiencia de expresión génica. Este método de transducción génica mejorará enormemente la manipulación genética de la célula NK.

Dextrano mejora la eficiencia de transducción lentivirales de las células NK primaria murinas y humanas

Este protocolo describe un método para lograr la integración estable del gen de interés en el genoma humano por el sistema transcripcionalmente regulado de La bella durmiente . Preparación de la integración de vectores lentivirales defectuosos, la transducción en vitro de las células humanas y el análisis molecular de células transduced se divulgan.

Un método de transposición eficiente In Vitro por un sistema de belleza durmiente transcripcionalmente regulada en un Vector lentivirales defectuosa integración

Aquí, presentamos un protocolo para modificar genéticamente las células primarias o ampliadas humano naturales del asesino (NK) usando Cas9 ribonucleoproteínas (Cas9/RNPs). Mediante este protocolo, hemos generado las células NK humanas deficientes para el receptor 2 del factor de crecimiento-b de transformación (TGFBR2) y la hipoxantina fosforribosiltransferasa 1 (HPRT1).

Generación de células NK humano primario y ampliado de Knock-out utilizando ribonucleoproteínas Cas9

Aquí, presentamos un método para expandir el asesino natural de sangre periférica (PBNK), las células NK de los tejidos hepáticos y las células NK del receptor de antígeno quimérico (CAR) derivadas de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) o sangre del cordón umbilical (CB). Este protocolo demuestra la expansión de las células NK y CAR-NK utilizando células alimentadoras 221-mIL-21, además de la pureza optimizada de las células NK expandidas.

Método de expansión celular Natural Killer (NK) y CAR-NK utilizando línea de células B modificada con IL-21 unida a la membrana

Aquí, presentamos un método para diferenciar y expandir las células asesinas naturales que expresan el receptor de antígeno quimérico (CAR) derivado de iPSC humano con una matanza mejorada contra varias neoplasias malignas. Este protocolo demuestra la diferenciación y expansión de células CAR-NK derivadas de iPSC optimizadas para asesinos naturales (NK) y la medición de la actividad antitumoral frente a varias líneas celulares tumorales.

Avances en células asesinas naturales que expresan receptores de antígenos quiméricos derivados de células madre pluripotentes humanas

Este protocolo describe un procedimiento detallado para generar células T con receptor de antígeno quimérico transitorio (CAR) utilizando ARNm no integrador para la inmunoterapia contra el cáncer y proporciona métodos confiables para evaluar las células CAR-T y su función citotóxica.

Un enfoque no viral para generar células T receptoras de antígenos quiméricos transitorios mediante ARNm para la inmunoterapia contra el cáncer

Se proporciona un protocolo detallado para el uso de la tecnología CRISPR/Cas9 para lograr un knock-in dirigido altamente eficiente de grandes construcciones multicistrónicas en células T humanas primarias a través de la vía de reparación del ADN de unión de extremos mediada por homología (HMEJ). Las células T diseñadas con este protocolo adaptable a las buenas prácticas de fabricación actuales mantienen una excelente expansión celular, citotoxicidad y producción de citocinas.

Ingeniería no viral de células T humanas primarias mediante la integración dirigida de grandes plantillas de ADN mediada por homología

Este protocolo describe los pasos esenciales para el cultivo de células T primarias, incluyendo su aislamiento, activación, expansión y transfección transitoria mediante electroporación de ARNm. Además, se propone un flujo de trabajo y un panel de anticuerpos para el análisis citométrico de flujo del fenotipo, marcadores de activación, viabilidad y expresión del receptor quimérico de antígenos (CAR).

Aislamiento, cultivo y transfección transitoria de células T humanas primarias para generar células T del Receptor de Antígenos Quiméricos (CAR)

Este protocolo proporciona un flujo de trabajo estandarizado in vitro. para la medición consistente de la citotoxicidad natural, mediada por receptores de antígenos quiméricos y dependiente de anticuerpos en células humanas natural killer mediante imagen de células vivas y citometría de flujo.

Cuantificación de la citotoxicidad de células NK potenciada por receptores de antígenos quiméricos y anticuerpos terapéuticos mediante imagen de células vivas y citometría de flujo

Aprende a generar células CAR-NK no víricas con el sistema de transposones Sleeping Beauty para combatir infecciones fúngicas invasivas por Aspergillus fumigatus. Este método ofrece una terapia celular escalable y accesible.

Ingeniería de células asesinas naturales con receptor de antígeno quimérico dirigidas a infecciones fúngicas utilizando el sistema de transposones no viral de la Bella Durmiente (Video) | JoVE Journal

Ingeniería de células asesinas naturales con receptor de antígeno quimérico dirigidas a infecciones fúngicas utilizando el sistema de transposones no viral de la Bella Durmiente

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