Análisis de estabilidad de plásmidos con microfluídica de gotas de código abierto
December 27th, 2024
Se presenta un flujo de trabajo microfluídico accesible y de código abierto para el análisis paralelizado de la retención de plásmidos en bacterias. Al emplear la microscopía de fluorescencia para cuantificar la presencia de plásmidos en microcolonias unicelulares dentro de microgotas de gel, este método proporciona una alternativa precisa, accesible y escalable al recuento tradicional de placas.
Desarrollamos métodos de CI microfílico de alto rendimiento para estudiar la diversidad de las poblaciones celulares y las interacciones célula-célula. En este contexto, las microgotas de gel nos permiten realizar pasos de protocolo útiles, como la manipulación del ADN con tinción por lisis y la microscopía de una manera altamente paralizada en células atrapadas. Los flujos de trabajo microfílicos de gotas son conocidos por su rendimiento ultra alto y versatilidad, pero la adopción a menudo está limitada por la necesidad de instrumentación de alta gama y experiencia especializada.
Nuestro protocolo mejora las técnicas tradicionales mediante el análisis de células individuales de alto rendimiento con tinción fluorescente y un flujo de trabajo de microscopía de código abierto accesible. Encapsula las células en microgotas de gel a través de la microfluídica para analizar minicélulas y microcolonias simultáneamente. Mientras que los cultivos a granel y en placa carecen de especificidad y resolución, este método proporciona estadísticas precisas y representativas de diversos fenómenos.
Nuestros protocolos combinan microfluídica de gotas, microscopía fluorescente y hardware de código abierto en un método basado en etiquetas. Este enfoque hace que el análisis de una sola célula sea más flexible y asequible, lo que permite a la comunidad científica abordar cuestiones científicas complejas relacionadas con las comunidades microbianas. Para comenzar, caliente agarosa a temperatura de gelificación ultra baja a una concentración de 2% a 90 grados Celsius en Luria Bertani, o caldo LB.
Agite la mezcla durante 10 minutos en un agitador de temperatura controlada, luego reduzca la temperatura del termoagitador a 39 grados centígrados para enfriar la solución de agarosa. Coloque el tubo de suspensión de Escherichia coli en el termoagitador durante cuatro minutos para calentarlo a 39 grados centígrados. Mezcle la suspensión de bacterias y la solución de agarosa en una proporción de uno a uno para lograr una concentración de agarosa del 1% con una suspensión celular de 3,1 veces 10 a la potencia de seis células por mililitro.
Prepare la solución de control negativo para el monitoreo de la contaminación utilizando LB y suspensión de agarosa en una proporción de uno a uno. Obtenga la plataforma de flujo de código abierto completa, incluidos los controladores de presión de gas y los sensores de flujo. Incluya un portaobjetos de vidrio y calentadores de punta de pipeta en la configuración para controlar la temperatura de la muestra de célula de agarosa a medida que ingresa al chip.
A continuación, coloque el chip microfluídico en la etapa de microscopía estroboscópica mejorada, asegurándose de que la unión de generación de gotas sea visible. Ajuste el calentador de punta de pipeta y el calentador de corredera de vidrio a 40 grados centígrados mediante la interfaz del software de control. Con una jeringa con tubo y un tapón de PDMS, cargue la mezcla de suspensión de pila de agarosa al 1 % en una punta de pipeta de 200 microlitros.
Inserte la punta en el calentador de puntas y colóquela en la entrada de la fase acuosa en el chip microfluídico. Cambie el sello PDMS de la punta por el que está conectado a la tubería del sistema de control de flujo. A continuación, inserte el tubo de aceite en la segunda entrada y el extremo del tubo de salida en un tubo de desagüe.
A continuación, ajuste la presión a 80 milibares para las fases de aquiescencia y aceite en la interfaz de usuario, e inicie la infusión de la suspensión celular y el aceite. Ajuste la fase de aceite a 320 milibares y la fase de aquiescencia a 180 milibares. Espere un minuto para estabilizar la generación de gotas.
Una vez que la generación de gotas se estabilice, transfiera el tubo de salida del tubo de desagüe al tubo de recolección. Continúe recolectando gotas en hielo hasta que el depósito de muestra esté vacío. Después de recolectar, coloque los tubos a cuatro grados centígrados durante una hora para que el gel de agarosa entre en las gotas.
Incubar las microgotas de gel que contienen bacterias y las gotas de control negativo a 37 grados centígrados durante cuatro horas o toda la noche para el crecimiento de la colonia. Después de la incubación, use una jeringa de tres mililitros con una aguja de calibre 21 para eliminar con cuidado la mayor cantidad de aceite posible de la base de la emulsión de microgotas de gel. Transfiera 50 microlitros de las microgotas de gel a un nuevo microtubo y guárdelo a cuatro grados centígrados para un análisis posterior de las gotas, agregue una mezcla uno a uno de aceite fluorado con PFO en un volumen igual a la emulsión restante.
A continuación, agregue aproximadamente 200 microlitros de tampón de cloruro de sodio al 0,9% encima de la emulsión. Agita la mezcla en vórtice y gírala brevemente en una centrífuga de velocidad fija. Retire con cuidado la fase oleosa de la parte inferior de la interfaz líquida y deseche 100 microlitros de solución de cloruro de sodio de la parte superior.
Transfiera dos microlitros de microgotas de gel a un portaobjetos de la cámara de imágenes y agregue cinco microlitros de aceite fluorado para ayudar a formar una monocapa de gotas para obtener imágenes óptimas. En el microscopio, active la iluminación de matriz LED blanca desde la parte superior para obtener imágenes de campo claro. Monte la corredera preparada.
Concéntrese en la muestra para localizar una monocapa de gotas y capturar una imagen de campo claro. A continuación, ajuste la rueda de filtros para alinearla con el filtro de longitud de onda verde. Cambie al LED de 470 nanómetros para la excitación y, sin mover la muestra, capture una imagen fluorescente de las colonias.
Transfiera dos microlitros de los microgeles teñidos con yoduro de propidio a un chip de cámara de imágenes y agregue cinco microlitros de solución de cloruro de sodio al 0,9% para formar una monocapa de microgeles. Selle la entrada y la salida del chip para evitar la evaporación durante la toma de imágenes. Ajuste el filtro de intervalo de longitud de onda roja para imágenes de yoduro de propidio y capture las imágenes fluorescentes y de campo claro.
La encapsulación celular en microgotas de gel se confirmó mediante microscopía de campo claro, que muestra gotas uniformes con distintas células encapsuladas. Las colonias que perdieron la fluorescencia codificada por plásmidos se identificaron mediante análisis de relación de fluorescencia. De 2.785 colonias analizadas, 100 colonias perdieron fluorescencia, lo que indica una tasa de pérdida de plásmidos del 3,6%
Visión general
Este estudio presenta un flujo de trabajo microfluídico de código abierto para analizar la retención de plásmidos en bacterias utilizando microscopía de fluorescencia. El método permite una cuantificación precisa de la presencia de plásmidos en microcolonias de una sola célula encapsuladas en microgotas de gel, ofreciendo una alternativa escalable al recuento tradicional en placas.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Microfluidics
- Biología celular
- Microscopía de fluorescencia
Fundamentos
- Las técnicas microfluídicas permiten el análisis de alto rendimiento de poblaciones celulares.
- Los métodos tradicionales a menudo carecen de especificidad y resolución.
- Las microgotas de gel proporcionan una plataforma versátil para el análisis de una sola célula.
- Los enfoques de código abierto pueden democratizar el acceso a metodologías avanzadas.
Propósito del estudio
- Desarrollar un método de alto rendimiento para estudiar la retención de plásmidos en bacterias.
- Mejorar la accesibilidad y asequibilidad de las técnicas de análisis de una sola célula.
- Proporcionar una alternativa escalable a los métodos de cultivo tradicionales.
Métodos utilizados
- Preparación de microgotas de gel de agarosa conteniendo células bacterianas.
- Uso de microfluídica para la generación y manipulación de gotas.
- Microscopía de fluorescencia para la imagen y cuantificación de la retención de plásmidos.
- Análisis de la fluorescencia de colonias para determinar las tasas de pérdida de plásmidos.
Resultados principales
- Confirmó la encapsulación de células en microgotas de gel mediante microscopía de campo brillante.
- Identificó una tasa de pérdida de plásmidos del 3,6% entre las colonias analizadas.
- Demostró la efectividad del flujo de trabajo de código abierto para el análisis de alto rendimiento.
- Proporcionó estadísticas precisas sobre la retención de plásmidos en diversas poblaciones bacterianas.
Conclusiones
- El método desarrollado mejora el estudio de comunidades microbianas.
- Ofrece un enfoque flexible y asequible para el análisis de una sola célula.
- Este flujo de trabajo puede ser adoptado por investigadores con diferentes niveles de experiencia.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Plasmid stability is a critical parameter in synthetic biology and microbial engineering, directly impacting the reliability of engineered strains in biopharma R&D. High-throughput, quantitative analysis of plasmid retention without antibiotic selection enables robust target validation and de-risks early discovery workflows. Open-source droplet microfluidics democratizes access to advanced single-cell analytics, supporting scalable portfolio decisions and translational continuity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of plasmid stability in engineered microbial populations.
- Supports functional validation of genetic constructs under selection-free conditions.
- Provides high-resolution data for mechanistic de-risking of synthetic circuits.
- Facilitates predictive confidence in strain performance for downstream applications.
Screening & Assay Development
- Prepares validated microbial systems for high-throughput screening workflows.
- Delivers reproducible, quantitative outputs for assay standardization.
- Enables parallel analysis of thousands of microcolonies, increasing statistical power.
- Supports scalable and reusable assay platforms for diverse genetic constructs.
Translational & Preclinical Research
- Aligns microbial system stability with translational biomarker strategies when relevant.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by quantifying genetic retention.
- Reduces risk of late-stage failure due to plasmid instability in engineered strains.
- Provides mechanistic insights for predictive de-risking in translational workflows.
Pipeline & Workflow Integration
This open-source microfluidic workflow integrates into the discovery-to-preclinical continuum, enabling robust single-cell analytics from early target validation through assay development and translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying plasmid retention at single-cell resolution.
- Screening: Delivers reproducible, high-throughput assay outputs for reliable compound or construct evaluation.
- Analytics: Provides quantitative fluorescence-based measurements to compare genetic stability across conditions.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by ensuring engineered strain fidelity.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible, open-source platform adaptable to various genetic and microbial systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in engineered strain validation.
- Operational Value: Standardizes and scales single-cell analysis with accessible instrumentation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust genetic stability data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of microbial engineering projects.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics, fluorescence microscopy, and microbial genetics.
- Needs open-source hardware for precise flow and temperature control.
- Demands cross-team standardization for reproducible data integration.
- Adaptable to various microbial models and genetic constructs with minimal modification.
- Limited by the need for fluorescence-based readouts and compatible imaging infrastructure.
