Análisis de estabilidad de plásmidos con microfluídica de gotas de código abierto
27 de diciembre de 2024
Se presenta un flujo de trabajo microfluídico accesible y de código abierto para el análisis paralelizado de la retención de plásmidos en bacterias. Al emplear la microscopía de fluorescencia para cuantificar la presencia de plásmidos en microcolonias unicelulares dentro de microgotas de gel, este método proporciona una alternativa precisa, accesible y escalable al recuento tradicional de placas.
Desarrollamos métodos de CI microfílico de alto rendimiento para estudiar la diversidad de las poblaciones celulares y las interacciones célula-célula. En este contexto, las microgotas de gel nos permiten realizar pasos de protocolo útiles, como la manipulación del ADN con tinción por lisis y la microscopía de una manera altamente paralizada en células atrapadas. Los flujos de trabajo microfílicos de gotas son conocidos por su rendimiento ultra alto y versatilidad, pero la adopción a menudo está limitada por la necesidad de instrumentación de alta gama y experiencia especializada.
Nuestro protocolo mejora las técnicas tradicionales mediante el análisis de células individuales de alto rendimiento con tinción fluorescente y un flujo de trabajo de microscopía de código abierto accesible. Encapsula las células en microgotas de gel a través de la microfluídica para analizar minicélulas y microcolonias simultáneamente. Mientras que los cultivos a granel y en placa carecen de especificidad y resolución, este método proporciona estadísticas precisas y representativas de diversos fenómenos.
Nuestros protocolos combinan microfluídica de gotas, microscopía fluorescente y hardware de código abierto en un método basado en etiquetas. Este enfoque hace que el análisis de una sola célula sea más flexible y asequible, lo que permite a la comunidad científica abordar cuestiones científicas complejas relacionadas con las comunidades microbianas. Para comenzar, caliente agarosa a temperatura de gelificación ultra baja a una concentración de 2% a 90 grados Celsius en Luria Bertani, o caldo LB.
Agite la mezcla durante 10 minutos en un agitador de temperatura controlada, luego reduzca la temperatura del termoagitador a 39 grados centígrados para enfriar la solución de agarosa. Coloque el tubo de suspensión de Escherichia coli en el termoagitador durante cuatro minutos para calentarlo a 39 grados centígrados. Mezcle la suspensión de bacterias y la solución de agarosa en una proporción de uno a uno para lograr una concentración de agarosa del 1% con una suspensión celular de 3,1 veces 10 a la potencia de seis células por mililitro.
Prepare la solución de control negativo para el monitoreo de la contaminación utilizando LB y suspensión de agarosa en una proporción de uno a uno. Obtenga la plataforma de flujo de código abierto completa, incluidos los controladores de presión de gas y los sensores de flujo. Incluya un portaobjetos de vidrio y calentadores de punta de pipeta en la configuración para controlar la temperatura de la muestra de célula de agarosa a medida que ingresa al chip.
A continuación, coloque el chip microfluídico en la etapa de microscopía estroboscópica mejorada, asegurándose de que la unión de generación de gotas sea visible. Ajuste el calentador de punta de pipeta y el calentador de corredera de vidrio a 40 grados centígrados mediante la interfaz del software de control. Con una jeringa con tubo y un tapón de PDMS, cargue la mezcla de suspensión de pila de agarosa al 1 % en una punta de pipeta de 200 microlitros.
Inserte la punta en el calentador de puntas y colóquela en la entrada de la fase acuosa en el chip microfluídico. Cambie el sello PDMS de la punta por el que está conectado a la tubería del sistema de control de flujo. A continuación, inserte el tubo de aceite en la segunda entrada y el extremo del tubo de salida en un tubo de desagüe.
A continuación, ajuste la presión a 80 milibares para las fases de aquiescencia y aceite en la interfaz de usuario, e inicie la infusión de la suspensión celular y el aceite. Ajuste la fase de aceite a 320 milibares y la fase de aquiescencia a 180 milibares. Espere un minuto para estabilizar la generación de gotas.
Una vez que la generación de gotas se estabilice, transfiera el tubo de salida del tubo de desagüe al tubo de recolección. Continúe recolectando gotas en hielo hasta que el depósito de muestra esté vacío. Después de recolectar, coloque los tubos a cuatro grados centígrados durante una hora para que el gel de agarosa entre en las gotas.
Incubar las microgotas de gel que contienen bacterias y las gotas de control negativo a 37 grados centígrados durante cuatro horas o toda la noche para el crecimiento de la colonia. Después de la incubación, use una jeringa de tres mililitros con una aguja de calibre 21 para eliminar con cuidado la mayor cantidad de aceite posible de la base de la emulsión de microgotas de gel. Transfiera 50 microlitros de las microgotas de gel a un nuevo microtubo y guárdelo a cuatro grados centígrados para un análisis posterior de las gotas, agregue una mezcla uno a uno de aceite fluorado con PFO en un volumen igual a la emulsión restante.
A continuación, agregue aproximadamente 200 microlitros de tampón de cloruro de sodio al 0,9% encima de la emulsión. Agita la mezcla en vórtice y gírala brevemente en una centrífuga de velocidad fija. Retire con cuidado la fase oleosa de la parte inferior de la interfaz líquida y deseche 100 microlitros de solución de cloruro de sodio de la parte superior.
Transfiera dos microlitros de microgotas de gel a un portaobjetos de la cámara de imágenes y agregue cinco microlitros de aceite fluorado para ayudar a formar una monocapa de gotas para obtener imágenes óptimas. En el microscopio, active la iluminación de matriz LED blanca desde la parte superior para obtener imágenes de campo claro. Monte la corredera preparada.
Concéntrese en la muestra para localizar una monocapa de gotas y capturar una imagen de campo claro. A continuación, ajuste la rueda de filtros para alinearla con el filtro de longitud de onda verde. Cambie al LED de 470 nanómetros para la excitación y, sin mover la muestra, capture una imagen fluorescente de las colonias.
Transfiera dos microlitros de los microgeles teñidos con yoduro de propidio a un chip de cámara de imágenes y agregue cinco microlitros de solución de cloruro de sodio al 0,9% para formar una monocapa de microgeles. Selle la entrada y la salida del chip para evitar la evaporación durante la toma de imágenes. Ajuste el filtro de intervalo de longitud de onda roja para imágenes de yoduro de propidio y capture las imágenes fluorescentes y de campo claro.
La encapsulación celular en microgotas de gel se confirmó mediante microscopía de campo claro, que muestra gotas uniformes con distintas células encapsuladas. Las colonias que perdieron la fluorescencia codificada por plásmidos se identificaron mediante análisis de relación de fluorescencia. De 2.785 colonias analizadas, 100 colonias perdieron fluorescencia, lo que indica una tasa de pérdida de plásmidos del 3,6%
Descripción general
Este estudio presenta un protocolo microfluídico de código abierto para analizar la retención de plásmidos en bacterias mediante microscopía de fluorescencia. El método permite la cuantificación precisa de la presencia de plásmidos en microcolonias de una sola célula encapsuladas en microgotas de gel, ofreciendo una alternativa escalable al recuento tradicional en placas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la Ciencia
- Microfluídica
- Biología celular
- Microscopía de fluorescencia
Antecedentes
- Las técnicas microfluídicas permiten el análisis de alto rendimiento de poblaciones celulares.
- Los métodos tradicionales a menudo carecen de especificidad y resolución.
- Las microgotas de gel proporcionan una plataforma versátil para el análisis de células individuales.
- Los enfoques de código abierto pueden democratizar el acceso a metodologías avanzadas.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método de alto rendimiento para estudiar la retención de plásmidos en bacterias.
- Mejorar la accesibilidad y asequibilidad de las técnicas de análisis a nivel de célula individual.
- Proporcionar una alternativa escalable a los métodos tradicionales de cultivo.
Métodos Utilizados
- Preparación de microgotas de gel de agarosa que contienen células bacterianas.
- Uso de microfluídica para la generación y manipulación de gotas.
- Microscopía de fluorescencia para la obtención de imágenes y cuantificación de la retención de plásmidos.
- Análisis de la fluorescencia de las colonias para determinar las tasas de pérdida de plásmidos.
Resultados principales
- Confirmación del encapsulamiento de células en microgotas de gel mediante microscopía de campo brillante.
- Identificación de una tasa de pérdida de plásmido del 3,6 % entre las colonias analizadas.
- Se demostró la eficacia del flujo de trabajo de código abierto para análisis de alto rendimiento.
- Se proporcionaron estadísticas precisas sobre la retención de plásmidos en poblaciones bacterianas diversas.
Conclusiones
- El método desarrollado mejora el estudio de comunidades microbianas.
- Ofrece un enfoque flexible y económico para el análisis de células individuales.
- Este flujo de trabajo puede ser adoptado por investigadores con diferentes niveles de experiencia.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La estabilidad del plásmido es un parámetro crítico en biología sintética e ingeniería microbiana, afectando directamente la fiabilidad de las cepas modificadas en la I+D de biofármacos. El análisis cuantitativo de alto rendimiento de la retención del plásmido sin selección con antibióticos permite una validación robusta de objetivos y reduce riesgos en las fases iniciales del descubrimiento. La microfluídica abierta basada en gotas democratiza el acceso a análisis avanzados a nivel de célula individual, apoyando decisiones escalables en carteras de proyectos y la continuidad traslacional.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la interrogación cuantitativa de la estabilidad del plásmido en poblaciones microbianas modificadas.
- Apoya la validación funcional de constructos genéticos en condiciones libres de selección.
- Proporciona datos de alta resolución para la reducción mecanicista de riesgos en circuitos sintéticos.
- Facilita la confianza predictiva en el desempeño de cepas para aplicaciones posteriores.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Prepara sistemas microbianos validados para flujos de trabajo de cribado de alto rendimiento.
- Proporciona resultados cuantitativos reproducibles para la normalización de ensayos.
- Permite el análisis paralelo de miles de microcolonias, aumentando el poder estadístico.
- Apoya plataformas de ensayo escalables y reutilizables para diversos constructos genéticos.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Alinea la estabilidad del sistema microbiano con estrategias de biomarcadores traslacionales cuando es pertinente.
- Garantiza la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante la cuantificación de la retención genética.
- Reduce el riesgo de fracaso en fases avanzadas debido a la inestabilidad del plásmido en cepas modificadas.
- Proporciona conocimientos mecanicistas para la reducción predictiva de riesgos en flujos de trabajo traslacionales.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este flujo de trabajo microfluídico de código abierto se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la fase preclínica, permitiendo análisis robustos a nivel de célula individual desde la validación inicial de objetivos hasta el desarrollo de ensayos e investigación traslacional.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de rutas al cuantificar la retención de plásmidos con resolución a nivel de célula individual.
- Selección: Proporciona resultados de ensayos reproducibles y de alto rendimiento para la evaluación fiable de compuestos o constructos.
- Análisis: Ofrece mediciones cuantitativas basadas en fluorescencia para comparar la estabilidad genética entre diferentes condiciones.
- Investigación Translacional: Conecta las fases de descubrimiento y preclínica al garantizar la fidelidad de cepas modificadas.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma flexible y de código abierto adaptable a diversos sistemas genéticos y microbianos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de cepas modificadas.
- Valor operativo: Estandariza y escala el análisis de célula individual mediante instrumentación accesible.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción de proyectos y la eficiencia del capital al proporcionar datos sólidos sobre estabilidad genética.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de proyectos de ingeniería microbiana.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en microfluídica, microscopía de fluorescencia y genética microbiana.
- Necesita hardware de código abierto para un control preciso del flujo y la temperatura.
- Exige estandarización entre equipos para la integración reproducible de datos.
- Adaptable a diversos modelos microbianos y construcciones genéticas con modificaciones mínimas.
- Limitado por la necesidad de lecturas basadas en fluorescencia y una infraestructura de imagenología compatible.
