Name: Análisis de estabilidad de plásmidos con microfluídica de gotas de código abierto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Aprende a analizar la retención de plásmidos en bacterias mediante microfluídica de gotas de código abierto. Este método de alta resolución permite cuantificar la pérdida de plásmidos en microcolonias individuales encapsuladas.

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<ol><li>Wein, T., Hülter, N. F., Mizrahi, I., Dagan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+plasmid+stability+under+non-selective+conditions+maintains+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Emergence of plasmid stability under non-selective conditions maintains antibiotic resistance.</a> Nat Commun. 10 (1), 2595(2019).</li>
<li>Rodríguez-Beltrán, J., DelaFuente, J., León-Sampedro, R., MacLean, R. C., Millán, ÁS. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+horizontal+gene+transfer%3A+The+role+of+plasmids+in+bacterial+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Beyond horizontal gene transfer: The role of plasmids in bacterial evolution.</a> Nat Rev Microbiol. 19 (6), 347(2021).</li>
<li>Wein, T., Dagan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmid+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasmid evolution.</a> Curr Biol. 30 (19), R1158-R1163 (2020).</li>
<li>Chen, S., Larsson, M., Robinson, R. C., Chen, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+and+convenient+measurement+of+plasmid+stability+in+lab+and+clinical+isolates+of+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Direct and convenient measurement of plasmid stability in lab and clinical isolates of E. coli.</a> Sci Rep. 7 (1), 4788(2017).</li>
<li>Rouches, M. V., Xu, Y., Cortes, L. B. G., Lambert, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plasmid+system+with+tunable+copy+number%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A plasmid system with tunable copy number.</a> Nat Commun. 13 (1), 3908(2022).</li>
<li>Silva, F., Queiroz, J. A., Domingues, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+metabolic+stress+and+plasmid+stability+in+plasmid+DNA+production+by+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Evaluating metabolic stress and plasmid stability in plasmid DNA production by Escherichia coli.</a> Biotechnol Adv. 30 (3), 691-708 (2012).</li>
<li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+novel+pJRD215-derived+plasmids+using+chloramphenicol+acetyltransferase+%28cat%29+gene+as+a+selection+marker+for+Acidithiobacillus+caldus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Construction of novel pJRD215-derived plasmids using chloramphenicol acetyltransferase (cat) gene as a selection marker for Acidithiobacillus caldus.</a> PLoS ONE. 12 (8), e0183307(2017).</li>
<li>Moragues, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet-based+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">Droplet-based microfluidics.</a> Nat Rev Methods Primers. 3 (1), 32(2023).</li>
<li>Vitalis, C., Wenzel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leveraging+interactions+in+microfluidic+droplets+for+enhanced+biotechnology+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Leveraging interactions in microfluidic droplets for enhanced biotechnology screens.</a> Current Opinion in Biotechnology. 82, 102966(2023).</li>
<li>Sinha, N., Subedi, N., Wimmers, F., Soennichsen, M., Tel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pipette-tip+based+method+for+seeding+cells+to+droplet+microfluidic+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A pipette-tip based method for seeding cells to droplet microfluidic platforms.</a> J Vis Exp. (144), e57848(2019).</li>
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<li>Shin, J. H., Choi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-source+and+do-it-yourself+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Sens+Actuators+B+Chem%22%5BJournal%5D)">Open-source and do-it-yourself microfluidics.</a> Sens Actuators B Chem. 347, 130624(2021).</li>
<li>Pryszlak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+gut+microbiome+strains+for+cultivation-free+genome+sequencing+using+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep+Methods%22%5BJournal%5D)">Enrichment of gut microbiome strains for cultivation-free genome sequencing using droplet microfluidics.</a> Cell Rep Methods. 2 (1), 100137(2021).</li>
<li>Pollak, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+loop+assembly%3A+open%2C+efficient+and+cross-kingdom+DNA+fabrication%5BTitle%5D)+AND+%22Biology%22%5BJournal%5D)">Universal loop assembly: open, efficient and cross-kingdom DNA fabrication.</a> Biology. 5 (1), (2020).</li>
<li>Volkmer, B., Heinemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Condition-dependent+cell+volume+and+concentration+of+Escherichia+coli+to+facilitate+data+conversion+for+systems+biology+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Condition-dependent cell volume and concentration of Escherichia coli to facilitate data conversion for systems biology modeling.</a> PLoS ONE. 6 (7), e23126(2011).</li>
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<li>Abate, A. R., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Faster+multiple+emulsification+with+drop+splitting%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Faster multiple emulsification with drop splitting.</a> Lab Chip. 11 (11), 1911-1915 (2011).</li>
<li>Lau, B. T. C., Malkus, P., Paulsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+quantitative+methods+for+measuring+plasmid+loss+rates+reveal+unexpected+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">New quantitative methods for measuring plasmid loss rates reveal unexpected stability.</a> Plasmid. 70 (3), 353-361 (2013).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>1H,1H,2H,2H-Perfluoro-1-octanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>370533-25G</td><td>Para romper la emulsión</td></tr><tr><td>etanol al 70%</td><td></td><td></td><td>Para la permeabilización celular</td></tr><tr><td>Agar-Agar</td><td>Winkler</td><td>9002-18-0</td><td></td></tr><tr><td>Punzón</td><td></td><td></td> de biopsia <td>0,75 mm y 1,8 mm</td></tr><tr><td>Transiluminador LED azul</td><td>IO Tubo de cultivo de rodeo</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Desecador</td><td></td><td></td> de 15 ml <td>Con bomba de vacío</td></tr><tr><td>Vaso</td><td></td><td></td> desechable <td>Para mezclar PDMS</td></tr><tr><td>Tenedor</td><td></td><td></td> desechable <td>Para mezclar PDMS Microscopio FluoPi</td></tr><tr><td>de cepa</td><td></td><td></td><td></td>TOP10 de E. coli</tr><tr><td></td><td>https://github.com/wenzel-lab/FluoPi</td><td></td><td>Sistema de imágenes de fluorescencia verde para analizar placas</td></tr><tr><td>Aceite fluorado</td><td>3M</td><td></td><td>Novec 7500</td></tr><tr><td>Calentador de vidrio</td><td>deslizante https://github.com/wenzel-lab/modular-microfluidics-workstation-controller/tree/master/module-heating-and-stirring</td><td></td><td>Para controlar la temperatura a 40 ° C de chip microfluídico</td></tr><tr><td>Portaobjetos</td><td></td><td></td><td></td>de vidrio</tr><tr><td>Placa calefactora</td><td>Mecánico</td><td></td><td>Para evaporación Aquapel</td></tr><tr><td>Software de análisis de imágenes</td><td>Fiji/ImageJ</td><td></td><td>2.14.0/1.54f</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Mundo Lab</td><td></td><td>MLAB Scientific / Para incubación de placas y microgeles&nbsp;</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td></td><td></td><td>Para limpiar portaobjetos de vidrio</td></tr><tr>Dispersión <td></td><td></td><td>en forma de L</td> de concentración de 100 ug/ml de <td>kanamicina</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> Para propagar bacterias en placas de agar <tr><td>Molde</td><td></td><td></td> maestro <td>Diseño de chip en obleas de silicona o vidrio</td></tr><tr><td>Microtubos Solución de</td><td></td><td></td> NaCl <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> de 2 ml <td>Sodio cloruro 0.9% p/v</td></tr><tr><td>Hardware de código abierto con luz estroboscópica mejorada</td><td>https://github.com/wenzel-lab/flow-microscopy-platform</td><td></td><td>Para microscopía de campo claro</td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Citotest</td><td>2303-1090</td><td>90 x 15 mm</td></tr><tr><td>Calentador de punta de pipeta</td><td>https://github.com/wenzel-lab/modular-microfluidics-workstation-controller/tree/master/module-heating-and-stirring</td><td></td><td>Para controlar la temperatura a 40 ° C de la punta de la pipeta</td></tr><tr><td>Limpiador de plasma</td><td>Diener Electronic</td><td>117056</td><td>Para unir PDMS con un portaobjetos</td></tr><tr><td>de vidrio pCA_Odd1</td><td></td><td></td> plásmido <td>Codifica sfGFP y resistencia a la kanamicina</td></tr><tr><td>Tubo de politetrafluoroetileno (PTFE) Adtech</td><td>Polymer Engineering Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medio premezclado Luria Bertoni</td> US <td>Biological Life Science</td><td>L1520</td><td></td></tr><tr><td>Propidium yoduro (PI)</td><td></td><td></td><td>Para tinción</td></tr> Sistema <tr><td>de control de presión y flujo basado en Raspberry Pi</td><td>https://github.com/wenzel-lab/modular-microfluidics-workstation-controller</td><td></td><td>Para controlar la presión y los caudales</td></tr><tr><td>Base de elastómero de silicona</td> Kit PDMS <td>Sylgard</td><td></td><td>- 184 Kit de elastómero de silicona</td></tr><tr><td>Agente de curado de elastómero de silicona</td> Kit PDMS <td>Sylgard</td><td></td><td>- 184 Kit de elastómero</td></tr><tr><td>de silicona Espectrofotómetro</td><td></td><td></td><td>Para medir la absorbancia</td></tr><tr><td>Microscopio SQUID</td><td>https://github.com/wenzel-lab/SQUID-bioimaging-platform</td><td></td><td>Sistema de imágenes de fluorescencia múltiple para analizar células teñidas</td></tr><tr><td>Asa</td><td></td><td></td> estéril <td>Para elegir una colonia y enchapar en rayas</td></tr><tr><td>Esfera de tensioactivo</td><td>Fluídica</td><td></td><td>Pico-Surf</td></tr><tr><td>Jeringas</td><td>NIPRO</td><td></td><td>Con filtros y tubos</td></tr><tr><td>Agitador con control de temperatura Mundo</td><td>Lab</td><td></td><td>DLAB HCM100-Pro</td></tr><tr><td>Pinza Agarosa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>a temperatura de gelificación ultrabaja</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2576-5G</td><td>Para generar perlas de hidrogel Solución</td></tr><tr><td>repelente al agua (fluoroalquilsilano)</td><td>Aquapel</td><td></td><td>Para tratar microcanales del dispositivo PDMS</td></tr></tbody></table>

análisis de estabilidad de plásmidos con microfluídica de gotas de código abierto

Plasmid Stability Analysis with Open-Source Droplet Microfluidics

Validación de encapsulación celular y formación de microcolonias
La encapsulación celular se puede confirmar visualmente mediante la realización de microscopía de campo claro en las microgotas de gel antes de romper la emulsión y lavar los microgeles. En la Figura 4 se muestra un resultado representativo de la emulsión en este paso.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67659/67659fig4.jpg"> 
Figura 4: Sección de una imagen de superposición de microscopía de fluorescencia. Después de la incubación durante la noche, microcolonias representativas de sfGFP expresan colonias de E. coli dentro de microgotas de gel. Se utilizó un objetivo de microscopio con aumento de 10x y 0,30 NA. Barra de escala: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67659/67659fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Resultados del análisis de imágenes
Una vez que los microgeles se tiñen y se obtienen el campo claro, así como los canales de fluorescencia adquiridos en varias posiciones, se pueden visualizar las colonias identificadas como negativas en las imágenes originales (ver Figura 5A). Los datos extraídos de todas las imágenes de un experimento se pueden trazar para mostrar la relación de fluorescencia de varias colonias, destacando aquellas que perdieron la fluorescencia codificada por plásmidos (ver Figura 5B). Los resultados indican que 100 colonias perdieron su funcionalidad plásmida o plásmido de un total de 2785 microcolonias analizadas, lo que corresponde al 3,6%.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67659/67659fig5.jpg"> 
Figura 5: Cuantificación de microcolonias negativas. (A) Sección de una imagen de superposición de microscopía de fluorescencia. Después de la eliminación del aceite y la tinción, las colonias representativas en los microgeles que expresaban sfGFP y dos colonias negativas mostraron la fluorescencia roja de la tinción de ADN (con un círculo negro). Barra de escala: 100 μm. (B) Diagrama de dispersión de los valores de fluorescencia de microcolonias individuales extraídos de 16 imágenes de microscopía multicanal. Las colonias sin fluorescencia verde se contaron como negativas, como se indica en rojo en el gráfico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67659/67659fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Cuantificación en placa de agar
Las imágenes de las placas triplicadas se muestran en la Figura 6, con colonias no fluorescentes indicadas por flechas blancas. La primera placa (Figura 6A) mostró un total de 213 colonias, de las cuales 1 no era fluorescente. La segunda placa (Figura 6B) tenía un total de 49 colonias, sin colonias no fluorescentes. La tercera placa (Figura 6C) mostró un total de 252 colonias, 6 de las cuales no eran fluorescentes. Estos resultados corresponden a una tasa media de pérdida de plásmidos de colonias del 2,3%, con una gran desviación estándar de 3,2.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67659/67659fig6.jpg"> 
Figura 6: Identificación de colonias negativas en placas. (De la A a la C) Colonias de E. coli fluorescentes y no fluorescentes en placas de agar LB (diámetro: 90 mm, altura: 15 mm). El inóculo, derivado de E. coli con sfGFP de -80 °C, se estregó el día 1, se cultivó con antibiótico el día 2 y se diluyó 1:100 diariamente desde el día 3 hasta el día 6 para permitir la pérdida de plásmidos. Las colonias se incubaron a 37 °C durante 24 h y se tomaron imágenes en una cámara FluoPi. Las colonias no fluorescentes se mejoraron con GIMP y se indicaron con flechas blancas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67659/67659fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Análisis de estabilidad de plásmidos con microfluídica de gotas de código abierto

Plasmids play a vital role in synthetic biology by enabling the introduction and expression of foreign genes in various organisms, thereby facilitating ...

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Monitorización del crecimiento bacteriano en formulaciones de medios distintos con un microbioractor automatizado

En este protocolo se introduce la fabricación, configuración y operación básica de un biorreactor de picolitros microfluídico (PLBR) para el análisis de microorganismos procariotas de una sola célula. Se analizaron microorganismos de relevancia industrial como prueba de principio, lo que permitió conocer la tasa de crecimiento, la morfología y la heterogeneidad fenotípica durante ciertos períodos de tiempo, lo que difícilmente es posible con los métodos convencionales.

Biorreactor de picolitro microfluídico para análisis microbiano de una sola célula: fabricación, configuración del sistema y operación

Describimos un ensayo digital de punto final para cuantificar ácidos nucleicos con una lectura simplificada (analógica). Medimos la fluorescencia masiva de ensayos digitales basados en gotas utilizando una máquina de qPCR estándar en lugar de instrumentación especializada y confirmamos nuestros resultados mediante microscopía.

Lectura granel simple de Digital ácidos nucleicos Cuantificación ensayos

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Este protocolo presenta un flujo de trabajo estándar de cribado de alto rendimiento para microorganismos industriales. Consiste en construir una biblioteca mutante mediante mutagénesis ARTP, realizar cribado positivo de gotas con microfluidica automatizada y, posteriormente, verificar los resultados. La fiabilidad del flujo de trabajo se validó mediante el cribado de cepas de B. coagulans de alto rendimiento.

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