Perfilado de O-glicanos de mucina permetilada mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo de desorción/ionización láser asistida por matriz

Estamos estudiando la glicobiología de las interacciones entre microbios del huésped en el tracto gastrointestinal, con especial atención al papel de la capa mucosa que cubre el tracto gastrointestinal, y en particular, las mucinas y sus glicanos en la salud y la enfermedad. Cada vez se reconoce más los mucinos glicanos como factores importantes en las interacciones huésped-microbio, ya que proporcionan nutrientes y sitios de unión para las bacterias. Una alteración en el perfil de glicosilación puede provocar alteraciones en la composición microbiótica y viceversa, fenotipos que se observan comúnmente en estados patógenos.

Sin embargo, las mucinas son notoriamente difíciles de estudiar porque están muy glicosiladas. Las innovaciones en técnicas de muestreo y el análisis bioinformático de seguimiento pueden impulsar el campo, así como nuevos enfoques de procesamiento de muestras para aumentar el rendimiento y reducir el tiempo desde la recogida hasta los resultados. Otras técnicas analíticas permiten una caracterización estructural más detallada de glicanos, pero requieren un tiempo de ejecución y análisis prolongados.

La técnica descrita aquí mediante espectrometría de masas MALDI-TOF tiene ventaja de velocidad, lo que la hace de alto rendimiento y adecuada para el cribado y el perfilado. Para empezar, mezcla mucinas purificadas con 250 microlitros del tampón de eliminación beta en un frasco de vidrio de cuatro mililitros. Sella el vial herméticamente con una tapa revestida de politetrafluoroetileno e incuba la reacción a 45 grados Celsius durante 16 horas.

Sobre hielo, añade un mililitro de la solución de ácido acético al 5% a la mezcla de reacción de forma a gota. Para dessalinizar la muestra, tapa una pipeta de cristal con una pequeña cantidad de lana de vidrio. Añade 1,5 mililitros de la suspensión de resina a la pipeta de cristal desde arriba, y luego deja que se asiente y drene.

Ahora, lava la resina con dos mililitros de ácido acético al 5% y descarta el flujo directo. Luego, añade la muestra de mucina a la columna de desalación y recoge el flujo en un tubo de cinco mililitros. Lava la columna dos veces con un mililitro de ácido acético al 5% para recoger el flujo de paso.

Luego, utilizando un evaporador centrífugo, retira el ácido acético y concentra la muestra a cinco milibares y 30 grados Celsius durante dos horas. Disuelva la muestra en 0,5 mililitros de ácido acético metanolo y sécala bajo un chorro de nitrógeno. Usando una jeringuilla de cristal, añade cuatro mililitros de DMSO al vial que contiene la mezcla de hidróxido de sodio y metanol.

Tras el vórtice, centrifuga la solución a 2.000 G durante dos minutos. Decanta cuidadosamente el sobrenadante y retira las sales sin alterar el gel. Después de asegurarse de que no se forman más sales, resuspende el gel en cuatro mililitros de DMSO anhidro para preparar la suspensión de la base de permetilación.

Después, a la muestra seca de mucina, añade DMSO anhidro y base de permetilación seguidas inmediatamente de iodometano. Incuba la reacción de permetilación durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitaciones vigorosas. Luego, añade 0,5 mililitros de agua para terminar la reacción.

Cuando la muestra se torne turbia, enjuágala con nitrógeno hasta que se despeje. Carga la muestra sobre una placa de extracción de equilibrio lipofílico hidrofílico de 96 pozos. Aplicar presión positiva para empujar las muestras a través de la fase sólida a un caudal de aproximadamente un mililitro por minuto.

Después de descartar el flowthrough, lava los pozos dos veces con un mililitro de agua. Eluye los glicanos de la placa dos veces con un mililitro de metanol. Aplica presión solo hasta que el metanol empiece a salir de la placa, y luego permite que el flujo por gravedad mantenga la tasa requerida.

Seque la muestra usando un evaporador centrífugo y disuelva en 10 microlitros de TA50. Después de mezclar un microlitro de muestra y la matriz, cárgala sobre una placa objetivo de acero MALDI y déjala secar. Para el análisis de datos, carga el archivo ASCII exportado del espectro de masas en GlycoWorkbench.

Tras realizar la corrección de la línea base, calcular los centroides pico y, en la ventana emergente, seleccionar el rango de masa adecuado, la relación señal-ruido mínima y la intensidad máxima mínima de espectrometría de masas. Luego, utiliza la herramienta Glyco-Peakfinder para identificar las composiciones estructurales que coinciden con la lista de picos. Elige perMe como derivización, redEnd como extremo reductor, y establece el número mínimo y máximo de residuos esperados.

Para las mucinas, selecciona Hexosa, N-Acetil-Hexosamina, Deoxi-Hexosa y N-Acetilneuramínico. Para glicanos sulfatados, usa la opción de otro residuo con una masa de 87,9. Para los datos MALDI-TOF, fije el número máximo de iones y cargas de sodio a uno cada uno, y fije la precisión en 0,5 Dalton.

Selecciona todas las anotaciones correctas con la tecla Control y haz clic en cada una de ellas. Haz clic derecho en las anotaciones seleccionadas y elige Añadir a la lista de picos anotados. Para generar un informe comparando múltiples espectros anotados, ve a Herramientas seguida de Informes y crea un informe comparando diferentes perfiles.

Imprime el informe en formato PDF para guardarlo. Para el análisis de espectros de fragmentación, carga los espectros en GlycoWorkbench y genera la lista de picos como se ha demostrado anteriormente. Dibuja estructuras de glicanos supuestas que correspondan a las composiciones de glicanos anotadas.

Para generar fragmentos para cada estructura, haz clic derecho para seleccionar Copiar fragmentos en lienzo y selecciona Calcular fragmentos en la herramienta Fragmentos. Para un análisis de fragmentación adicional, haz clic en un pico de interés en el visor de espectro. Haz clic derecho y selecciona Buscar todas las estructuras que coinciden con los picos para consultar la relación de carga maestra del pico seleccionado con bases de datos en línea.

Selecciona las estructuras supuestas de interés y haz clic derecho para copiarlas a la ventana del lienzo con la opción correspondiente. Para calcular posibles fragmentos de cada estructura glicana, selecciona la estructura en el lienzo. Luego, en herramientas y fragmentos, selecciona fragmentos de cálculo para la estructura actual.

Si se han calculado fragmentos para más de una estructura de glicano, ve a la vista de la tabla de Fragmentos bajo la pestaña Resumen para ver la tabla comparativa. Selecciona los fragmentos que coinciden con la lista de picos para cada posible estructura de glicano. Haz clic derecho y elige Copiar fragmentos al lienzo desde el menú desplegable.

Por último, en la pestaña de Herramientas, ve a Perfilador seguido de Anotar picos con todas las estructuras. Luego selecciona Herramientas, Informes y Crea un informe con las anotaciones. La desalación por intercambio iónico resultó en una mejor recuperación de glicanos más grandes, ya que estas estructuras mayores representan el 31% del total de glicanos, en comparación con el 21% de la extracción con PGC.

Entre las estructuras de glicanos identificadas, un glicano solo se identificó mediante la muestra desalizada por intercambio iónico. Además, la desalación por intercambio iónico y eliminación de borato llevó a espectros con mayores relaciones señal-ruido en comparación con los producidos tras la desalación mediante extracción en fase sólida con PGC. Los tiempos de reacción de permetilación de 30 y 90 minutos llevaron a la identificación de 33 picos de glicano, mientras que una reacción de cinco minutos identificó solo 31 picos.