Análisis de subpoblaciones de plaquetas mediante citometría de flujo multicolor

Nuestra investigación utiliza la citometría de flujo multicolor para identificar y caracterizar las subpoblaciones plaquetarias, con el objetivo de comprender los roles, los patrones de activación y la relevancia clínica en la trombosis, la inflamación y el contexto específico de la enfermedad. El ensayo de citometría de flujo multicolor establecido permitió observar el , un agonista plaquetario induce un patrón de activación distinto y, en comparación con el péptido relacionado con el colágeno, genera un procoagulante y una subpoblación. El ensayo multicolor permite la medición simultánea de la activación, adhesión, agregación y potencial apoptótico de plaquetas de una sola plaqueta dentro de una población de plaquetas humanas aisladas en un solo tubo.

[Instructor] Para comenzar, prepare todos los reactivos necesarios para el procedimiento. Ahora, mezcle 10 mililitros de tampón 10x Tyrode con 90 mililitros de agua destilada. Agregue 0,1 gramos de glucosa y ajuste el pH del volumen completo con hepes para llegar a 7,4. Primero, establezca el pH de 10 mililitros del tampón en 7.4 y luego ajuste el pH de los 90 mililitros restantes con un ácido clorhídrico normal a 6.5. Para la recolección de muestras de sangre, prepare una jeringa de 10 mililitros para cada donante con dos mililitros de anticoagulante ACD. Deje que la jeringa se equilibre a temperatura ambiente. Después de recolectar sangre del donante en una jeringa ACD precalentada, transfiera lentamente la sangre tratada con ACD a un tubo de reacción de 15 mililitros. Centrifugar la sangre tratada con ACD a 209G durante 20 minutos a temperatura ambiente sin usar el descanso. Mientras tanto, prepare 25 mililitros de tampón Hepes de Tyrode, pH 6.5 en un tubo de reacción de 50 mililitros. Después de la centrifugación, transfiera suavemente la capa superior de plasma rico en plaquetas al tubo que contiene el tampón Hepes de Tyrode. Para evitar la contaminación, deje aproximadamente un mililitro de plasma rico en plaquetas por encima de la capa leucocitaria y la capa de eritrocitos. Luego, centrifuga la suspensión a 430G durante 10 minutos a temperatura ambiente para granular las plaquetas. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender con cuidado el sedimento de plaquetas en 200 a 300 microlitros de tampón de Tyrode, ajustado a pH 7.4. Mida el recuento de plaquetas con un contador de células antes de ajustarlo a 200.000 plaquetas por microlitro con el tampón Hepes de Tyrode a pH 7,4. Para los receptores que no requieren activación antes de la tinción, incluidos CD61, CD42B, CD41, CXCR7 y CXCR4, prepare una muestra sin teñir y una teñida por anticuerpo. Para receptores o marcadores que requieren activación como PAC-1, CD63, CD62P, NXN5 y NIR zombie. Active la muestra con 10 microgramos por mililitro de CRPXL y prepare muestras activadas y no activadas. Para activar las plaquetas, incubarlas con 10 microgramos por mililitro de CRPXL durante 30 minutos. Luego, incube la plaqueta aislada con concentraciones variables del anticuerpo conjugado con fluorocromo o muera durante 30 minutos. Luego, agregue 300 microlitros de tampón de unión de anexina a cada muestra para diluirlo. Mida 10.000 eventos para cada muestra con un citómetro de flujo. Calcule el índice de tinción para cada anticuerpo para determinar la separación óptima entre poblaciones positivas y negativas. Represente el índice de tinción contra las concentraciones de anticuerpos para identificar la concentración óptima para cada anticuerpo Para la tinción, disuelva el polvo de hemen en hidróxido de sodio 1,4M para crear una solución 3M. Caliente la solución a 96 grados centígrados durante cinco minutos a 450 revoluciones por minuto. Diluirlo con agua destilada para obtener una solución de tallo de tres milimolares. Después de ajustar el recuento de plaquetas a 1 millón de plaquetas por muestra, active las plaquetas como se demostró anteriormente. Agregue 43,3 microlitros de cóctel de anticuerpos a cada muestra e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de la incubación, diluir cada muestra con 300 microlitros de un X y X en tampón de unión compuesto por hidróxido de sodio Hepes de 10 milimolares a pH 7,4. Mida cada muestra teñida inmediatamente con el citómetro de flujo. Para la compensación con perlas, prepare 150 microlitros de PBS para cada fluoróforo y agregue una gota de perlas y un microlitro del anticuerpo conjugado de fluorescencia. Para compensar la anexina V, use siete perlas PECY7B marcadas con CD 62L antihumano conjugado con el mismo fluoróforo que la anexina V. Use perlas de compensación reactiva de aminas para el colorante reactivo de amina mezclando dos gotas de perlas positivas y una gota de perlas negativas en 150 microlitros de PBS con un microlitro de troquel. Confirme que las perlas positivas reaccionan y muestran una señal y las perlas negativas no. Prepare una fluorescencia menos un control para cada marcador. Los diagramas de dispersión mostraron un claro cambio en la población de plaquetas. Con hemina formando más plaquetas con baja dispersión hacia adelante que otros agonistas. El tratamiento con trombina ADP y CRPXL dio como resultado que entre el 40 y el 60% de las plaquetas CD42 fueran positivas, mientras que la hemina redujo significativamente esta población. Todos los agonistas plaquetarios no tuvieron ningún efecto sobre la expresión superficial de CD41 y CD61. Solo el hemen aumentó significativamente la expresión de la superficie CXCR4 y CXCR7. Además, la exposición a la fosfatidilserina también se mejoró bajo el tratamiento con hemina, lo que resultó en una mejora de las células positivas de anexina V. Los análisis de gráficos UMAP y fenol definieron 27 grupos de plaquetas distintos, que variaron según el tipo de agonista. La hemina causó el cambio más dramático en los patrones de racimos. Las subpoblaciones de plaquetas en reposo se conservaron más con ADP y se arrendaron con hemina.