Análisis exhaustivo de plaquetas procoagulantes que presentan características de necrosis, apoptosis y activación plaquetaria

Nuestra investigación se centra en comprender el metabolismo y la señalización de las plaquetas durante los estados protrombóticos, como el síndrome antifosfolípido y el cáncer, con la intención de identificar nuevos biomarcadores y dianas terapéuticas. Nuestro grupo ha estado a la vanguardia de un reciente aumento en el interés sobre cómo el metabolismo de las plaquetas contribuye a la activación plaquetaria y la trombosis. La caracterización precisa del estado de activación plaquetaria en la circulación de los pacientes para determinar el riesgo de trombosis, así como la eficacia terapéutica de los agentes antiplaquetarios, sigue siendo un desafío importante.

La glucólisis aeróbica, la vía del fosfato pentosa y la oxidación beta de los ácidos grasos se han desentrañado como las vías distintivas del metabolismo energético en las plaquetas y se ha establecido su potencial para la diana terapéutica. Este protocolo sirve para ayudar en la identificación y caracterización funcional precisa de las plaquetas procoagulantes, distintas de las plaquetas proagregadoras, así como de las plaquetas que sufren muerte celular por apoptosis o necrosis. Para empezar, suplementar las plaquetas humanas lavadas con 2,5 milimolares de calcio añadiendo 0,5 microlitros de solución de cloruro de calcio 0,5 molar a 100 microlitros de suspensión de plaquetas.

Mantenga una fracción de plaquetas sin estimular y estimule la fracción restante con una combinación de trombina y convulsivo durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de la estimulación, agregue un microlitro de anexina V, un paquete de uno y un anticuerpo anti-CD62P a 100 microlitros de suspensiones plaquetarias estimuladas. Incubar las plaquetas en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos.

Después de 30 minutos, fije las plaquetas agregando un volumen igual de formalina al 2% antes de analizar las muestras por citometría de flujo para cuantificar las plaquetas procoagulantes. Para la preparación de plaquetas, diluir las plaquetas humanas lavadas hasta una concentración de un millón de plaquetas por mililitro y complementar con 2,5 milimolares de calcio. Etiquete las plaquetas con cinco micromolares ROD2 para la detección de calcio mitocondrial e incube durante 30 minutos en la oscuridad.

Para la preparación de plaquetas para el ensayo de activación de caspasas, después de suplementar las plaquetas con calcio y estimular una fracción, agregue un matiz de marcaje de caspasa activo a las suspensiones de plaquetas estimuladas. Incubar las plaquetas durante 30 minutos en la oscuridad. Después de 30 minutos, fije las plaquetas agregando un volumen igual de formalina al 2% antes de analizar las plaquetas por citometría de flujo.

Los resultados muestran que la trombina indujo un aumento dependiente de la dosis en la proporción de plaquetas que expresan tanto fosfatidilserina como P-selectina. La estimulación de la trombina también causó un aumento dependiente del tiempo en los niveles de calcio mitocondrial en las plaquetas. Sin embargo, la estimulación de la trombina resultó en una reducción del potencial de membrana mitocondrial en las plaquetas.

La estimulación de la trombina activó la caspasa-8, pero no la caspasa-3 o 7 en las plaquetas.