Name: Extracción de ADN micobacteriano mediante batido de perlas en tampón personalizado seguido de un flujo de trabajo NGS (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-13T14:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Aprenda a extraer ADN de Mycobacterium tuberculosis mediante batido de perlas y purificación con cuentas magnéticas. Este método rápido y estandarizado es compatible con secuenciación de próxima generación en entornos con recursos limitados.

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Este estudio se llevó a cabo en la Universidad de California en San Francisco (UCSF) bajo la aprobación del Comité Institucional de Bioseguridad (BUA #BU198320-01GBUA/BABB) y sigue las pautas de ética de investigación de la UCSF. Obtuvimos muestras de esputo remanente recolectadas por Discovery Life Sciences bajo un protocolo de Renuncia de Consentimiento aprobado por el IRB de personas con afecciones respiratorias no relacionadas con la tuberculosis.
1. Preparación de tampones
<ol>
	<li>Tampón Triton personalizado (Tabla 1): Para preparar 100 mL de tampón Triton personalizado, comience combinando 2 mL de NaCl 5 M, 1 mL de Tris-HCl (pH 8), 1 mL de Triton X-100 y 0,2 mL de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 0,5 M. Agregue agua ultrapura para llevar el volumen total a 100 mL. Filtre y esterilice antes de usar. El tampón final contiene 100 mM de NaCl, 10 mM de Tris-HCl, 1 mM de EDTA y 1% de Triton X-100.</li>
	<li>TE de EDTA bajo (Tabla 2): Para preparar 100 mL de tampón de TE de EDTA bajo, combine 1 mL de Tris-HCl 1M (pH 8) y 0,02 mL de EDTA 0,5 M. Agregue agua ultrapura para llevar el volumen total a 100 mL. El tampón final contiene 10 mM de Tris-HCl y 0,1 mM de EDTA.</li>
</ol>
2. Preparación de tubos de lisis
<ol>
	<li>Con una hoja de bisturí, corte con cuidado la parte inferior de un tubo con tapón de rosca de 1,5 ml justo debajo del punto de inflexión.</li>
	<li>Corta la punta de una punta P1000, corta una cuña en forma de V cerca del extremo y coloca en ella la parte inferior preparada del tubo del tapón de rosca. Consulte la Figura 1 para ver un diagrama de la cuchara.</li>
	<li>Llene un recipiente estéril (por ejemplo, un depósito o una placa de Petri) con perlas de silicato de circonio de 0,1 mm y utilice la cuchara preparada para distribuir una cucharada de perlas (~200 mg) en tubos con tapón de rosca de 1,5 ml.</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68037/68037fig1.jpg"> 
Figura 1: Cuchara de distribución de cuentas interna. La cuchara fue diseñada para la fácil transferencia de ~ 200 mg de perlas de circonio de 0,1 mm a los tubos de procesamiento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68037/68037fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
3. Preparación de los insumos
NOTA: Toda la preparación de muestras debe realizarse de acuerdo con los protocolos de bioseguridad de su instalación. Recomendamos encarecidamente manipular materiales infecciosos dentro de un gabinete de bioseguridad (BSC) de Clase II para minimizar el riesgo de exposición a aerosoles.
<ol>
	<li>Cultivo de células bacterianas<ol>
		<li>Centrífuga ~ 5 mL de cultivo de M. tuberculosis (ya sea MGIT o cultivo de líquido turbio) en un tubo de centrífuga cónico de 15 mL a velocidad máxima (≥ 3,000 x g) durante 10 min.</li>
		<li>Con una pipeta serológica de 10 mL, retire con cuidado todo menos ~ 500 μL del sobrenadante sin alterar el pellet. Retire el sobrenadante restante con una pipeta P1000 sin alterar el pellet.</li>
		<li>Vuelva a suspender el pellet en 350 μL de tampón Triton personalizado pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Si es necesario (es decir, para extraer muestras para procesarlas fuera de un BSL-3), inactive la muestra de acuerdo con los procedimientos operativos estándar.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparación del esputo<ol>
		<li>Transfiera 1-5 mL de muestra de esputo (espontánea o inducida) a un tubo centrífugo estéril de 50 mL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Liuefacción de DTT<ol>
		<li>Agregue cuatro volúmenes de 100 mM de ditiotreitol a la muestra de esputo (el volumen puede variar). Si utiliza un reactivo comercial, siga las instrucciones de dilución del fabricante.</li>
		<li>Vórtice a fondo durante 30 s. Incubar a temperatura ambiente (20-25 °C) durante 7 min. Vórtice de nuevo durante 30 s.</li>
		<li>Repita los pasos 3.3.1. y 3.3.2. 1x, para muestras muy viscosas, realice hasta 5 ciclos de incubación-vórtice.</li>
		<li>Centrifugar a velocidad máxima (≥ 3.000 x g) durante 10 min. Con una pipeta serológica de 10 mL, deseche cuidadosamente todo menos ~ 500 μL del sobrenadante. Retire el sobrenadante restante con una pipeta P1000 sin alterar el pellet.</li>
		<li>Vuelva a suspender el pellet en 350 μL de tampón Triton personalizado.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Liuefacción de NALC-NaOH<ol>
		<li>Para preparar la solución de NALC-NaOH, siga las instrucciones del fabricante para la preparación y dilución.</li>
		<li>Añadir cuatro volúmenes de solución de NALC-NaOH a la muestra de esputo (espontánea o inducida, el volumen puede variar).</li>
		<li>Vórtice durante 30 s. Incubar a temperatura ambiente (20-25 °C) durante 7 min. Repita los pasos 3.4.1 y 3.4.2. 1 vez. Para muestras muy viscosas, realice hasta 5 ciclos de incubación-vórtice.</li>
		<li>Agregue PBS a la marca de 50 ml. Vórtice brevemente para mezclar. Centrifugar a velocidad máxima (≥ 3.000 x g) durante 10 min.</li>
		<li>Con una pipeta serológica de 50 mL, deseche cuidadosamente todo menos ~ 500 μL del sobrenadante. Retire el sobrenadante restante con una pipeta P1000 sin alterar el pellet.</li>
		<li>Vuelva a suspender el pellet en 350 μL de tampón Triton personalizado. Si es necesario (es decir, para extraer muestras para procesarlas fuera de un BSL-3), inactive la muestra de acuerdo con los procedimientos operativos estándar.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Extracción de ADN
<ol>
	<li>Transfiera la suspensión bacteriana inactivada (350 μL del paso 3) a un nuevo tubo con tapón de rosca de 1,5 mL bien etiquetado que contenga ~250 μL de perlas de silicato de circonio de 0,1 mm.</li>
	<li>Bead batió el lisado a 6,5 m/s durante 45 s con 2 min de descanso entre carreras. Repita para un total de tres ciclos de batido de cuentas.</li>
	<li>Centrifugar a velocidad máxima (≥ 12.000 x g) durante 2 min y transferir 150 μL del sobrenadante a un nuevo tubo bien marcado. Tenga cuidado de no transferir cuentas o desechos de celdas.</li>
	<li>Deje que las perlas magnéticas de limpieza se equilibren a temperatura ambiente durante 30 minutos y se agiten a fondo para garantizar una resuspensión completa antes de su uso.</li>
	<li>Agregue 180 μL (1,2 veces el volumen) de perlas magnéticas de limpieza y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces. Incubar a temperatura ambiente durante 2 min.</li>
	<li>Coloque en una rejilla magnética y espere a que la solución se aclare durante ~ 2 minutos. Con una pipeta P200, deseche con cuidado el sobrenadante sin alterar las perlas magnéticas.</li>
	<li>Con el tubo todavía en la rejilla magnética, agregue 500 μL de etanol al 70 % (v/v) recién preparado, dispensando a lo largo de la pared del tubo opuesta a las perlas magnéticas. Espere 30 s.</li>
	<li>Repita los pasos 4.5. - 4.7. para un total de dos lavados. Al final del último lavado, elimine el etanol residual con una pipeta P10. Seque las cuentas brevemente durante ~ 2 min.</li>
	<li>Inmediatamente después de que el pellet de perla se vuelva opaco, retire el tubo de la rejilla magnética y vuelva a suspender en 20 μL de Tampón Tris de bajo EDTA. No permita que las cuentas se sequen y agrieten.</li>
	<li>Mezcle mediante pipeteo o vórtice para asegurarse de que todas las perlas estén en solución. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min.</li>
	<li>Coloque en una rejilla magnética y espere a que la solución se aclare durante ~ 2 minutos. Transfiera el ADN eluido a un nuevo tubo bien marcado para su análisis posterior. Aspire &lt;20 μL de ADN extraído para evitar el arrastre de perlas magnéticas.</li>
</ol>
5. Enumeración qPCR de ADN micobacteriano
<ol>
	<li>Para cuantificar el ADN micobacteriano mediante una PCR cuantitativa dirigida a 99 nucleótidos del atpE micobacteriano (Rv1305), ensamble una mezcla de reacción de 10 μL por muestra en hielo que contenga 5 μL de mezcla maestra de sonda universal (2x), 0,4 μL de cebador directo (5'-AATTCCTGGTGTAGCGGTGGGG-3', 10 μM) y cebador inverso (5'-GTTTACGGCGTGGACTACCA-3', 10 μM), 0,2 μL de sonda TaqMan (5'-VIC-AGGAGGAACACCGGGGGCGA-MGB-3', 10 μM), 2 μL de molde de ADN y 2 μL de agua libre de nucleasas (Tabla 3).</li>
	<li>Ejecute la reacción utilizando las siguientes condiciones de ciclo térmico: desnaturalización inicial a 95 °C durante 60 s, seguida de 35 ciclos de 95 °C durante 10 s y 60 °C durante 30 s (con una captura aquí, utilizando una velocidad de rampa de 2,11 °C/s; Tabla 4). NOTA: En este caso, la qPCR se realizó utilizando un ensayo TaqMan con sonda marcada con VIC en un sistema de PCR en tiempo real QuantStudio 3,</li>
	<li>Ejecute todas las muestras, estándares y controles por triplicado técnico. Genere curvas estándar utilizando diluciones en serie de ADN purificado de M . tuberculosis . Realice análisis de cuantificación relativa utilizando software de análisis.</li>
	<li>Exporte los valores de cuantificación relativos resultantes a formato CSV y visualícelos con R Studio (versión 2024.09.1+394) para generar diagramas de caja que comparen los rendimientos de ADN entre los métodos de extracción.</li>
</ol>

<ol><li>Jouet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+amplicon+sequencing+for+culture-free+prediction+of+susceptibility+or+resistance+to+13+anti-tuberculous+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+J%22%5BJournal%5D)">Deep amplicon sequencing for culture-free prediction of susceptibility or resistance to 13 anti-tuberculous drugs.</a> Eur Respir J. 57 (3), 2002338(2021).</li>
<li>George, S., et al. DNA Thermo-Protection Facilitates Whole Genome Sequencing of Mycobacteria Direct from Clinical Samples by the Nanopore Platform. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGeorge%2C+S+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2020).</li>
<li>Doyle, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+whole-genome+sequencing+of+sputum+accurately+identifies+drug-resistant+mycobacterium+tuberculosis+faster+than+MGIT+culture+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Direct whole-genome sequencing of sputum accurately identifies drug-resistant mycobacterium tuberculosis faster than MGIT culture sequencing.</a> J Clin Microbiol. 56 (8), e00666-e00718 (2018).</li>
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<li>Votintseva, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Same-day+diagnostic+and+surveillance+data+for+tuberculosis+via+whole-genome+sequencing+of+direct+respiratory+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Same-day diagnostic and surveillance data for tuberculosis via whole-genome sequencing of direct respiratory samples.</a> J Clin Microbiol. 55 (5), 1285-1298 (2017).</li>
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<li>Votintseva, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterial+DNA+extraction+for+whole-genome+sequencing+from+early+positive+liquid+%28MGIT%29+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mycobacterial DNA extraction for whole-genome sequencing from early positive liquid (MGIT) cultures.</a> J Clin Microbiol. 53 (4), 1137-1143 (2015).</li>
<li>Kolia-Diafouka, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+Lysis-Extraction+Method+Combined+With+IS6110-Amplification+for+Detection+of+Mycobacterium+tuberculosis+in+Paucibacillary+Sputum+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Optimized Lysis-Extraction Method Combined With IS6110-Amplification for Detection of Mycobacterium tuberculosis in Paucibacillary Sputum Specimens.</a> Front Microbiol. 9, 2224(2018).</li>
<li>Bonnet, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comprehensive+Evaluation+of+GeneLEAD+VIII+DNA+Platform+Combined+to+Deeplex+Myc-TB+Assay+to+Detect+in+8+Days+Drug+Resistance+to+13+Antituberculous+Drugs+and+Transmission+of+Mycobacterium+tuberculosis+Complex+Directly+From+Clinical+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A Comprehensive Evaluation of GeneLEAD VIII DNA Platform Combined to Deeplex Myc-TB Assay to Detect in 8 Days Drug Resistance to 13 Antituberculous Drugs and Transmission of Mycobacterium tuberculosis Complex Directly From Clinical Samples.</a> Front Cell Infect Microbiol. 11, 707244(2021).</li>
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<li>Schwab, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field+evaluation+of+nanopore+targeted+next-generation+sequencing+to+predict+drug-resistant+tuberculosis+from+native+sputum+in+South+Africa+and+Zambia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Field evaluation of nanopore targeted next-generation sequencing to predict drug-resistant tuberculosis from native sputum in South Africa and Zambia.</a> J Clin Microbiol. 63 (3), e0139024(2025).</li>
<li>Colman, R. E., Seifert, M., De la Rossa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+culture-free+targeted+next-generation+sequencing+for+diagnosing+drug-resistant+tuberculosis%3A+a+multicentre+clinical+study+of+two+end-to-end+commercial+workflows%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Evaluating culture-free targeted next-generation sequencing for diagnosing drug-resistant tuberculosis: a multicentre clinical study of two end-to-end commercial workflows.</a> Lancet Infect Dis. 25 (3), 325-334 (2025).</li>
<li>Oberacker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-On-Magnetic-Beads+%28BOMB%29%3A+Open+platform+for+high-throughput+nucleic+acid+extraction+and+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Bio-On-Magnetic-Beads (BOMB): Open platform for high-throughput nucleic acid extraction and manipulation.</a> PLoS Biol. 17 (1), e3000107(2019).</li>
<li>Limberis, J. D., Metcalfe, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turbolysis%3A+A+low-cost%2C+small+footprint+alternative+to+commercial+bead+beaters+for+cell+lysis%5BTitle%5D)+AND+%22HardwareX%22%5BJournal%5D)">Turbolysis: A low-cost, small footprint alternative to commercial bead beaters for cell lysis.</a> HardwareX. 19, e00576(2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Perlas de silicato de circonio de 0,1 mm</td><td>Productos Biospec</td><td>11079101z</td><td>Perlas utilizadas para el paso de batido de perlas para lisar células micobacterianas</td></tr><tr><td>Perlas AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>Referencia A63880</td><td>Perlas magnéticas para la limpieza del ADN después de la lisis</td></tr><tr><td>EDTA (0,5 M, pH 8,0)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9260G</td><td>Componentes de tampón Triton/Low EDTA personalizados</td></tr><tr><td>Fastprep 24</td><td>MPbio, Estados Unidos</td><td>116004500</td><td>Equipo para el batido de talones a 6,5 m/s</td></tr><tr><td>Imprimación hacia adelante</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Síntesis personalizada</td><td>Secuencia de cebadores: AATTCCTGGTGTAGCGGTGG</td></tr><tr><td>H2O (agua, grado de biología molecular)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP2819-1</td><td>Componentes de tampón Triton/Low EDTA personalizados</td></tr><tr><td>Sonda universal Luna</td><td>Laboratorios biológicos de Nueva Inglaterra</td><td>M3004</td><td>Reactivo qPCR para el recuento de ADN micobacteriano</td></tr><tr><td>MycoPrep Kit</td><td>BD</td><td>SKU/REF 240863</td><td>Digestión de muestras BD MycoPrep para el procesamiento de esputo NALC-NaOH</td></tr><tr><td>NaCl (cloruro de sodio, solución 5M)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9759</td><td>Componentes de tampón Triton/Low EDTA personalizados</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Millipore Sigma</td><td>P2272</td><td>Procesamiento de esputo</td></tr><tr><td>Imprimación inversa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Síntesis personalizada</td><td>Secuencia de cebadores: GTTTACGGCGTGGACTACCA</td></tr><tr><td>Sonda TaqMan</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Síntesis personalizada</td><td>Secuencia de sonda: AGGAGGAACACCGGTGGCGA</td></tr><tr><td>Tris-HCl (1 M, pH 8,0)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9855G</td><td>Componentes de tampón Triton/Low EDTA personalizados</td></tr><tr><td>Tritón X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28314</td><td>Componentes de tampón Triton/Low EDTA personalizados</td></tr></tbody></table>

extracción de adn micobacteriano mediante batido de perlas en tampón personalizado seguido de un flujo de trabajo ngs

Mycobacterial DNA Extraction using Bead Beating in Custom Buffer Followed by NGS Workflow

Probamos el protocolo de extracción de ADN en muestras cultivadas de M. tuberculosis y esputo enriquecido con M. tuberculosis (n = 3 para cada condición). Utilizando cultivo de M. tuberculosis H37Rv mc² 7901, estandarizamos la entrada a 8,4 x 106 células por 50 μL, equivalente a 1 mL de un cultivo MGIT a 200 GU. Para los experimentos de esputo, añadimos 1 mL de esputo agrupado de individuos con afecciones respiratorias no tuberculosas (obtenido comercialmente) con dos concentraciones...

Extracción de ADN micobacteriano mediante batido de perlas en tampón personalizado seguido de un flujo de trabajo NGS

Tuberculosis is a deadly disease, and the emergence of antibiotic drug resistance in the causative agent bacterium, Mycobacterium tuberculosis, worsens ...

mycobacterial-dna-extraction-using-bead-beating-custom-buffer

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Se presentan la comparación y optimización de dos métodos de enriquecimiento de ADN organelar de plantas: centrifugación diferencial tradicional y fraccionamiento del gDNA total basado en el estado de metilación. Evaluamos la cantidad y calidad de ADN resultante, demostramos el rendimiento en secuenciación de próxima generación de lectura corta y discutimos el potencial de uso en la secuenciación de una molécula de larga lectura.

Optimización y Análisis Comparativo de Métodos de Enriquecimiento de ADN de Organelos Vegetales Adecuados para Secuenciación de Próxima Generación

Nanopore technology para secuenciación de biomoléculas tiene amplias aplicaciones en Ciencias de la vida, incluyendo la identificación de patógenos, supervisión de la seguridad del alimento, análisis genomic, metagenomic monitoreo ambiental y caracterización de bacterias resistencia a los antibióticos. En este artículo, el procedimiento de secuenciación de ADN de suelo de metagenómica para identificación de especies utilizando la tecnología de secuenciación nanopore es demostrado.

Secuencia de la DNA Nanopore para análisis de metagenómica suelo

Aquí, describimos un protocolo para obtener datos de la secuencia del amplicón del suelo, rizosfera y raíz endosphere microbiomes. Esta información puede utilizarse para investigar la composición y diversidad de las comunidades microbianas asociadas de planta y es conveniente para el uso con una amplia gama de especies de plantas.

Explorar el microbioma de la raíz: extracción de datos de la comunidad bacteriana del suelo, rizosfera y raíz Endosphere

Secuencias de largo leer facilitan enormemente el montaje de genomas complejos y la caracterización de la variación estructural. Se describe un método para generar secuencias muy largas por plataformas de secuenciación basada en nanopore. El enfoque adopta una extracción de ADN optimizada seguida por las preparaciones de la biblioteca modificada para generar cientos de kilobases Lee con una cobertura moderada de células humanas.

Muy largo leer la secuencia para el análisis de la DNA de Genomic entero

Aquí se describe un procedimiento operativo estándar simplificado para la elaboración de perfiles de microbiomas mediante la secuenciación y el análisis metagenómicos de 16S rRNA utilizando herramientas disponibles gratuitamente. Este protocolo ayudará a los investigadores que son nuevos en el campo del microbioma, así como aquellos que requieren actualizaciones sobre los métodos para lograr el perfilado bacteriano a una resolución más alta.

Análisis de microbiota utilizando PCR de dos pasos y secuenciación genética de rRNA 16S de próxima generación

Aquí se describe un protocolo de extracción de ADN que utiliza perlas magnéticas para producir extracciones de ADN de alta calidad de mosquitos. Estas extracciones son adecuadas para un enfoque de secuenciación de próxima generación aguas abajo.

Un protocolo de extracción de ADN de mosquitos a base de perlas magnéticas para la secuenciación de próxima generación

La expresión génica está regulada por interacciones de promotores génicos con elementos reguladores distales. Aquí, describimos cómo la baja entrada de Capture Hi-C (liCHi-C) permite la identificación de estas interacciones en tipos de células raras, que antes no se podían medir.

Un flujo de trabajo integrado para estudiar la arquitectura del genoma espacio-temporal centrada en el promotor en poblaciones celulares escasas

Presentamos un método optimizado para la extracción de ADN a partir de esputo descontaminado utilizando un método de extracción basado en matriz combinado con una purificación magnética de perlas para la secuenciación de próxima generación dirigida posterior de Mycobacterium tuberculosis.

Extracción de ADN basada en matrices para la secuenciación dirigida de próxima generación en muestras de esputo descontaminadas

Este protocolo describe el método CTAB para extraer ADN de alta calidad de micobacterias, superando los desafíos que plantean sus duras paredes celulares ricas en ácido micólico. El proceso implica digestión enzimática, lisis celular con CTAB y purificación del ADN mediante extracción orgánica y precipitación de etanol. Este método produce ADN adecuado para estudios moleculares y es fiable para la investigación micobacteriana.

Extracción de ácido desoxirribonucleico de genoma completo de especies de Mycobacterium mediante la técnica de bromuro de cetiltrimetilatonio

Aquí, presentamos un protocolo para permitir la secuenciación del genoma completo de infecciones bacterianas de transmisión sexual a partir de muestras clínicas mediante el enriquecimiento de objetivos. Este novedoso método basado en paneles sindrómicos supera los desafíos del abundante ADN humano y las bajas cargas bacterianas, facilitando la vigilancia genómica de Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum y Mycoplasma genitalium.

Generación de genomas bacterianos completos a partir de muestras clínicas mediante un flujo de trabajo de enriquecimiento de objetivos

El estudio actual describe un flujo de trabajo para la secuenciación nanoporosa de plásmidos cuando la secuencia cromosómica ya se conoce o no tiene interés. Un paso inicial de enriquecimiento de ADN plasmidal asegura una profundidad óptima de secuencia plasmidal y maximiza el número de muestras que pueden secuenciarse por celda de flujo.

Secuenciación y ensamblaje de plásmidos de lectura larga utilizando flujos de trabajo basados en secuenciación nanopore

Aprenda a extraer ADN de Mycobacterium tuberculosis mediante batido de perlas y purificación con cuentas magnéticas. Este método rápido y estandarizado es compatible con secuenciación de próxima generación en entornos con recursos limitados.

Extracción de ADN micobacteriano mediante batido de perlas en tampón personalizado seguido de un flujo de trabajo NGS

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