Extracción de ADN micobacteriano mediante batido de perlas en tampón personalizado seguido de un flujo de trabajo NGS

Nuestra investigación diagnóstica se centra en mejorar la detección de la resistencia a los medicamentos en la tuberculosis en entornos de recursos limitados, con un enfoque en la velocidad y el pragmatismo. En el diagnóstico de la tuberculosis, hay ensayos genotípicos más completos, e incluso una serie de nuevos ensayos fenotípicos rápidos, y hay presiones constantes para acercar estas pruebas al punto de atención. Pero todavía existen una serie de barreras pragmáticas.

Los desafíos de recursos, desde los reactivos hasta la infraestructura y la logística, siguen siendo barreras importantes. Con algo más allá de la sofisticación técnica de un ensayo Cepheid Xpert, la estandarización del protocolo es difícil en diferentes entornos. Entonces, la extracción de ADN MTB, como se detalla en este trabajo aquí, es un excelente ejemplo de eso.

Existe una necesidad crítica de expandir el diagnóstico de tuberculosis basado en secuenciación, pero muchos laboratorios aún carecen de una forma confiable de extraer ADN de alta calidad. Nuestro objetivo es compartir un método que sea simple, práctico y adecuado para entornos de punto de atención de bajos recursos. Aquí presentamos un protocolo simple de bajo costo diseñado para su uso en entornos de recursos limitados.

Ha sido validado para aplicaciones NGS y es compatible con sistemas automatizados de manejo de líquidos. Para comenzar, combine la solución de cloruro de sodio Tampón de clorhidrato de Tris, Triton X 100 y EDTA para hacer el tampón Tritón. Mezclar revolviendo y agregar agua ultrapura hasta alcanzar un volumen final de 100 mililitros.

Filtro esterilizar el tampón antes de usarlo. A continuación, prepare 100 mililitros de tampón Tris-EDTA bajo en EDTA combinando un mililitro de Tris-HCl de un molar y 20 microlitros de EDTA de 0,5 molares. Mezclar y llenar con agua ultrapura hasta alcanzar un volumen final de 100 mililitros.

Luego esteriliza el tampón con filtro. Para preparar los tubos de lisis, use una hoja de bisturí para cortar con cuidado la parte inferior de un tubo con tapa de rosca de 1,5 mililitros justo debajo del punto de inflexión. Corta la punta de una punta de pipeta P1000 y haz una cuña en forma de V cerca del extremo.

Coloque la parte inferior cortada del tubo con tapón de rosca en la punta de la pipeta en forma de V para formar una cuchara. Llene un recipiente estéril con perlas de silicato de circonio de 0,1 milímetros. Con la cuchara preparada, transfiera aproximadamente 200 miligramos de cuentas a tubos con tapón de rosca de 1,5 mililitros.

Para la preparación del cultivo de células bacterianas, transfiera cinco mililitros de cultivo de Mycobacterium tuberculosis a un tubo de centrífuga cónico de 15 mililitros. Centrífuga a máxima velocidad durante 10 minutos. Ahora use una pipeta serológica de 10 mililitros para eliminar con cuidado todo menos aproximadamente 500 microlitros del sobrenadante sin alterar el sedimento.

Utilice una pipeta P1000 para eliminar el sobrenadante restante. Vuelva a suspender el gránulo en 350 microlitros de tampón tritón personalizado, luego mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Caliente la muestra en un baño de calor seco durante 30 minutos a 95 grados centígrados.

Para preparar el esputo, transfiera de uno a cinco mililitros de muestra de esputo a un tubo centrífugo estéril de 50 mililitros. Para realizar la licuefacción de ditiotreitol, agregue cuatro volúmenes de ditiothreitol de 10 milimolares a la muestra de esputo, luego haga un vórtice completo durante 30 segundos. Centrifugar la muestra a máxima velocidad durante 10 minutos.

Luego use una pipeta serológica de 10 mililitros para desechar todos menos 500 microlitros del sobrenadante. Retire el resto del sobrenadante con una pipeta P1000 sin alterar el gránulo. Vuelva a suspender el gránulo en 350 microlitros de tampón de tritón personalizado.

Para realizar la licuefacción de hidróxido de sodio NALC, agregue cuatro volúmenes de la solución de hidróxido de sodio NALC a la muestra de esputo. Agite la mezcla durante 30 segundos. Luego incube el tubo durante siete minutos a temperatura ambiente.

Ahora agregue PBS hasta la marca de 50 mililitros. Agite el contenido del tubo para mezclar bien, luego centrifugue el tubo a máxima velocidad durante 10 minutos. Después de la centrifugación, con una pipeta serológica de 50 mililitros, deseche el sobrenadante como se demostró anteriormente.

Luego vuelva a suspender el gránulo en 350 microlitros de tampón de tritón personalizado. Primero, transfiera 350 microlitros de muestra inactivada a un tubo con tapón de rosca de 1,5 mililitros etiquetado que contenga 250 microlitros de perlas de silicato de circonio de 0,1 milímetros. Batir el lisado a 6,5 metros por segundo durante 45 segundos con dos minutos de descanso entre ciclos.

Centrifugar la muestra a máxima velocidad durante dos minutos, luego transferir 150 microlitros del sobrenadante a un nuevo tubo etiquetado. A continuación, limpie el vórtice de las perlas magnéticas que se han equiparado a temperatura ambiente durante 30 minutos, para volver a suspenderlas. Transfiera 180 microlitros de perlas magnéticas a la muestra de ADN.

Pipetea hacia arriba y hacia abajo 10 veces para mezclar. Después de una incubación de dos minutos a temperatura ambiente, coloque el tubo en una rejilla magnética y espere dos minutos para que la solución se aclare. Luego use una pipeta de 200 microlitros para desechar el sobrenadante.

Con el tubo aún en la gradilla magnética, agregue 500 microlitros de etanol al 70% recién preparado a lo largo de la pared opuesta y espere 30 segundos. Al final del último lavado, retire el etanol residual con una pipeta de 10 microlitros y seque al aire durante dos minutos. Tan pronto como las cuentas se vuelvan opacas, retire el tubo de la rejilla magnética.

Resuspender en 20 microlitros de tampón Tris bajo en EDTA. Mezcle mediante pipeteo o vórtice para asegurarse de que todas las perlas estén en solución antes de una incubación de cinco minutos a temperatura ambiente. A continuación, coloque el tubo en una rejilla magnética durante dos minutos hasta que esté transparente.

Luego, transfiera menos de 20 microlitros del ADN eluido a un nuevo tubo marcado para evitar el arrastre de perlas. Para cuantificar el ADN micobacteriano mediante una PCR cuantitativa dirigida a 99 nucleótidos del atpE micobacteriano, ensamble una mezcla maestra QPCR en hielo. Ajuste la mezcla maestra en función de la cantidad de muestras y estándares, incluido un 10 % de excedente para tener en cuenta la pérdida de pipeteo.

Ejecute el termociclador con 95 grados Celsius durante 60 segundos, seguido de 35 ciclos de 95 grados Celsius durante 10 segundos y 60 grados Celsius durante 30 segundos con una velocidad de rampa de 2,11 grados Celsius por segundo. Ejecute todas las muestras, estándares y controles por triplicado. Aquí, los cultivos de Mycobacterium tuberculosis arrojaron las concentraciones de ADN más altas entre todas las condiciones probadas.

Las muestras de esputo enriquecidas mostraron rendimientos de ADN progresivamente más bajos y una mayor variación con la disminución de la entrada bacteriana, especialmente en el grupo de 10.000 bacterias.