Name: Ensamblaje modular estandarizado de operones policistrónicos con clonación modular (MoClo) utilizando el kit de herramientas In-Cloning (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Aprende a ensamblar operones policistrónicos mediante clonación modular MoClo utilizando el kit In-Cloning. Este protocolo permite construir unidades de transcripción multigénicas con flexibilidad en ingeniería genética.

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<ol><li>James, J. S., Dai, J., Chew, W. L., Cai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+design+and+engineering+of+synthetic+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">The design and engineering of synthetic genomes.</a> Nat Rev Genet. 1, 1-22 (2024).</li>
<li>Weber, E., Engler, C., Gruetzner, R., Werner, S., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+cloning+system+for+standardized+assembly+of+multigene+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A modular cloning system for standardized assembly of multigene constructs.</a> PLoS One. 6 (2), e16765(2011).</li>
<li>Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+one+pot%2C+one+step%2C+precision+cloning+method+with+high+throughput+capability%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability.</a> PLoS One. 3 (11), e3647(2008).</li>
<li>Pingoud, A., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+type+II+restriction+endonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Structure and function of type II restriction endonucleases.</a> Nucleic Acids Res. 29 (18), 3705-3727 (2001).</li>
<li>Engler, C., Gruetzner, R., Kandzia, R., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Golden+Gate+shuffling%3A+A+one-pot+DNA+shuffling+method+based+on+type+IIs+restriction+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Golden Gate shuffling: A one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes.</a> PLoS One. 4 (5), e5553(2009).</li>
<li>de Vries, S. T., Kley, L., Schindler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+Golden+Gate+plasmid+set+enabling+scarless+MoClo-compatible+transcription+unit+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Golden+Gate+Cloning%3A+Methods+Protoc%22%5BJournal%5D)">Use of a Golden Gate plasmid set enabling scarless MoClo-compatible transcription unit assembly.</a> Golden Gate Cloning: Methods Protoc. 2850, 105-132 (2024).</li>
<li>de Vries, S. T., Köbel, T. S., Sanal, A., Schindler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-%26+Out-Cloning%3A+Plasmid+toolboxes+for+scarless+transcription+unit+and+modular+Golden+Gate+acceptor+plasmid+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">In-& Out-Cloning: Plasmid toolboxes for scarless transcription unit and modular Golden Gate acceptor plasmid assembly.</a> Synth Biol. 9 (1), ysae016(2024).</li>
<li>Schindler, D., Milbredt, S., Sperlea, T., Waldminghaus, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+assembly+of+DNA+sequence+libraries+for+chromosomal+insertion+in+bacteria+based+on+a+set+of+modified+MoClo+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Design and assembly of DNA sequence libraries for chromosomal insertion in bacteria based on a set of modified MoClo vectors.</a> ACS Synth Biol. 5 (12), 1362-1368 (2016).</li>
<li>Zumkeller, C., Schindler, D., Felder, J., Waldminghaus, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+assembly+of+synthetic+secondary+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Bacterial+Chromatin%3A+Methods+Protoc%22%5BJournal%5D)">Modular assembly of synthetic secondary chromosomes.</a> Bacterial Chromatin: Methods Protoc. 2819, 157-187 (2024).</li>
<li>Hoffmann, S. A. YeastFab cloning of toxic genes and protein expression optimization in yeast. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHoffmann%2C+SA+%22Golden+Gate+Cloning%3A+Methods+and+Protocols%22">Golden Gate Cloning: Methods and Protocols</a>. , Springer, New York. (2025).</li>
<li>Sun, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-evaluation+of+E.+coli%27s+operon+structures+via+a+whole-cell+model+suggests+alternative+cellular+benefits+for+low-+versus+high-expressing+operons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Syst%22%5BJournal%5D)">Cross-evaluation of E. coli's operon structures via a whole-cell model suggests alternative cellular benefits for low- versus high-expressing operons.</a> Cell Syst. 15 (3), 227-245.e7 (2024).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifaceted+stoichiometry+control+of+bacterial+operons+revealed+by+deep+proteome+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Multifaceted stoichiometry control of bacterial operons revealed by deep proteome quantification.</a> Front Genet. 10, 1-12 (2019).</li>
<li>Müntjes, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+polycistronic+expression+in+the+model+microorganism+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Establishing polycistronic expression in the model microorganism Ustilago maydis.</a> Front Microbiol. 11, 1-10 (2020).</li>
<li>Behrendt, G., Frohwitter, J., Vlachonikolou, M., Klamt, S., Bettenbrock, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zymo-Parts%3A+A+Golden+Gate+modular+cloning+toolbox+for+heterologous+gene+expression+in+Zymomonas+mobilis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Zymo-Parts: A Golden Gate modular cloning toolbox for heterologous gene expression in Zymomonas mobilis.</a> ACS Synth Biol. 11 (11), 3855-3864 (2022).</li>
<li>Green, R., Rogers, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+transformation+of+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Chemical transformation of E. coli.</a> Methods Enzymol. 529, 329-336 (2013).</li>
<li>Köbel, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+easy-to-use+plasmid+toolset+for+efficient+generation+and+benchmarking+of+synthetic+small+RNAs+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">An easy-to-use plasmid toolset for efficient generation and benchmarking of synthetic small RNAs in bacteria.</a> ACS Synth Biol. 11 (9), 2989-3003 (2022).</li>
<li>Meyer, A. J., Segall-Shapiro, T. H., Glassey, E., Zhang, J., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+%26%2334%3BMarionette%26%2334%3B+strains+with+12+highly+optimized+small-molecule+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli &#34;Marionette&#34; strains with 12 highly optimized small-molecule sensors.</a> Nat Chem Biol. 15 (2), 196-204 (2019).</li>
<li>Salis, H. M., Mirsky, E. A., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+design+of+synthetic+ribosome+binding+sites+to+control+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Automated design of synthetic ribosome binding sites to control protein expression.</a> Nat Biotechnol. 27 (10), 946-950 (2009).</li>
<li>Chen, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+582+natural+and+synthetic+terminators+and+quantification+of+their+design+constraints%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterization of 582 natural and synthetic terminators and quantification of their design constraints.</a> Nat Methods. 10 (7), 659-664 (2013).</li>
<li>Togna, A. P., Shuler, M. L., Wilson, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+plasmid+copy+number+and+runaway+plasmid+replication+on+overproduction+and+excretion+of+beta-lactamase+from+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Prog%22%5BJournal%5D)">Effects of plasmid copy number and runaway plasmid replication on overproduction and excretion of beta-lactamase from Escherichia coli.</a> Biotechnol Prog. 9 (1), 31-39 (1993).</li>
<li>Messerschmidt, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+characterization+of+the+synthetic+secondary+chromosome+synVicII+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Optimization and characterization of the synthetic secondary chromosome synVicII in Escherichia coli.</a> Front Bioeng Biotechnol. 4, 1-9 (2016).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Ampicilina</td><td>Merck Life Science</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>Agar bacteriano</td><td>Fisher Scientific & nbsp;</td><td>P0011B</td><td></td></tr><tr><td>BbsI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3539</td><td></td></tr><tr><td>BsaI-HF V2</td><td>New England Biolabs</td><td>R3733</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DH5&alpha; Células competentes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf y Eppendorf; Mastercycler&nbsp; Cicladores Térmicos Nexus</td><td>Eppendorf</td><td>6333000014</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro de microvolumen EzDrop 1000</td><td>Biotecnología Blue-Ray</td><td>BRED-1000</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Minipreparación para Plásmidos GeneJET</td><td>Termo Científica</td><td>K0503</td><td></td></tr><tr><td>In- & Salida - Kit de herramientas de clonación</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Búfer de ligasa</td><td>New England Biolabs</td><td>B0216</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific & nbsp;</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>New Brunswick Innova&reg; &nbsp; 42/42R - Agitador Incubadora Apilable</td><td>Eppendorf</td><td>M1335-0080</td><td></td></tr><tr><td>PhenoBooth+</td><td>Instrumentos cantantes</td><td>PHB-007</td><td></td></tr><tr><td>SaPi</td><td>New England Biolabs</td><td>R0569</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomicina</td><td>Merck Life Science</td><td>S4014</td><td></td></tr><tr><td>Material de laboratorio estándar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ligasa de ADN T4</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>Thermomix MM</td><td>B. Braun Biotech Internacional</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triptona</td><td>Fisher Scientific & nbsp;</td><td>LP0042B</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>Fisher Scientific & nbsp;</td><td>LP0021B</td><td></td></tr></tbody></table>

ensamblaje modular estandarizado de operones policistrónicos con clonación modular (moclo) utilizando el kit de herramientas in-cloning

Standardized Modular Assembly of Polycistronic Operons with Modular Cloning (MoClo) using the In-Cloning toolkit

Ensamblaje modular estandarizado de operones policistrónicos con clonación modular (MoClo) utilizando el kit de herramientas In-Cloning

Modular Cloning (MoClo) toolkits enable the rapid assembly of multigene constructs. They are based on Golden Gate cloning, which uses Type IIS restriction ...

standardized-modular-assembly-polycistronic-operons-with-modular

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Investigación

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Bioengineering

Bioingeniería

Este video describe BiFC-PALM, una combinación de microscopía de localización fotoactivada y complementación de fluorescencia bimolecular, para evaluar las interacciones proteína-proteína. BiFC implica la fusión de dos fragmentos de proteínas fluorescentes con dos proteínas de interés que interactúan. Cuando las dos proteínas interactúan, los fragmentos se acercan, lo que permite que las dos partes se unan y reconstituyan una proteína fluorescente funcional. La fluorescencia de un solo...

Microscopía de localización fotoactivada acoplada a la complementación de fluorescencia bimolecular

Complejos de proteínas catalizan las funciones celulares clave. Caracterización detallada funcional y estructural de muchos complejos esenciales requiere la producción recombinante. MultiBac es un sistema de células de baculovirus / insecto particularmente adaptado para la expresión de proteínas eucarióticas y sus complejos. MultiBac se implementó como una plataforma de acceso libre, y los procedimientos operativos estándar desarrollados para maximizar su utilidad.

El Protein Complex Plataforma de Producción MultiBac en el EMBL

La síntesis de plásmidos personalizados requiere trabajo y tiempo. Este protocolo describe el uso de la clonación de ensamblaje de Gibson para reducir el trabajo y la duración del procedimiento de clonación de ADN personalizado. El protocolo descrito también produce construcciones de proteínas marcadas confiables para la expresión en mamíferos a un costo similar al de la clonación tradicional de ADN de cortar y pegar.

Generación de plásmidos vectores que expresan proteínas de la bandera de etiquetado bajo la regulación del promotor factor de elongación humano-1α Usando Asamblea Gibson

Las interacciones proteína-proteína se visualizan en células con resolución espacial nanométrica mediante la combinación de complementación de fluorescencia bimolecular (BiFC) con microscopía de localización fotoactivada (PALM). Aquí se describe el uso de BiFC-PALM para obtener imágenes de las interacciones Ras-Raf en células U2OS para visualizar la agrupación y difusión a nanoescala de complejos Ras-Raf individuales.

Fotoactivado Localización Microscopía con bimolecular fluorescencia Complementación (BiFC-PALM)

Describimos un sistema de ovocitos y capuchones animales de Xenopus para la clonación de expresión de genes capaces de inducir una respuesta en ectodermo competente, y discutimos técnicas para el análisis posterior de dichos genes. Este sistema es útil en la identificación funcional de una amplia gama de productos génicos.

Clonación funcional utilizando una<em&gt; Xenopus</em&gt; Sistema de Expresión de ovocitos

Aquí, se presenta un flujo de trabajo automatizado para modular montaje de "dispositivo" de ADN usando un método de montaje modular de clonación ADN sobre robots de manipulación de líquidos. El protocolo utiliza una herramienta de software intuitivo para la generación de listas de líquido controlador para combinatoria ADN dispositivo biblioteca generación, demostramos con dos plataformas de manejo de líquidos.

Automatizado de montaje robotizada manipulación líquido de dispositivos modulares de la DNA

Aquí, presentamos un protocolo que describe cómo i) ensamblar un vector autorreplicante usando el kit de herramientas de clonación modular CyanoGate, ii) introducir el vector en un host cianobacteriano por conjugación, y iii) caracterizar las cepas de cianobacterias transgénicas usando un lector de placas o citometría de flujo.

Modificación genética de las cianobacterias por conjugación utilizando el kit de herramientas de clonación modular CyanoGate

El objetivo de este protocolo es proporcionar una guía detallada paso a paso para el montaje de construcciones multigénicos utilizando el sistema de clonación modular basado en la clonación Golden Gate. También ofrece recomendaciones sobre pasos críticos para garantizar un montaje óptimo basado en nuestras experiencias.

Montaje rápido de construcciones multigénicas mediante clonación modular Golden Gate

El estudio describe un protocolo para crear grandes cantidades (μg-mg) de ADN para campañas de detección de proteínas a partir de fragmentos de genes sintéticos sin clonar ni usar células vivas. La plantilla mínima se digiere y circula enzimáticamente y luego se amplifica mediante amplificación de círculo de rodadura isotérmica. Las reacciones de expresión libre de células podrían realizarse con el producto no purificado.

Métodos rápidos y enzimáticos para la amplificación de plantillas mínimas y lineales para la creación de prototipos de proteínas utilizando sistemas libres de células

Se empleó un módulo de clonación molecular adaptable de Gibson Assembly en un formato de experiencia de investigación de pregrado (CURE) basado en cursos para estudiantes de cursos de laboratorio de biología molecular. La evaluación de los resultados de aprendizaje de los estudiantes mostró una mejor comprensión y confianza en la clonación molecular después de completar el CURE, y se clonaron nuevos plásmidos para la investigación de biosíntesis de productos naturales.

Mejorar los resultados de los estudiantes con una experiencia de investigación de pregrado basada en cursos de clonación molecular adaptable

Aprende a ensamblar operones policistrónicos mediante clonación modular MoClo utilizando el kit In-Cloning. Este protocolo permite construir unidades de transcripción multigénicas con flexibilidad en ingeniería genética.

Ensamblaje modular estandarizado de operones policistrónicos con clonación modular (MoClo) utilizando el kit de herramientas In-Cloning (Video) | JoVE Journal

Ensamblaje modular estandarizado de operones policistrónicos con clonación modular (MoClo) utilizando el kit de herramientas In-Cloning

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