Ensamblaje modular estandarizado de operones policistrónicos con clonación modular (MoClo) utilizando el kit de herramientas In-Cloning

Desarrollé métodos que permiten el ensamblaje modular de ADN desde pequeñas partes moleculares individuales hasta construcciones del tamaño de un cromosoma, y reprogramar células con estos cromosomas artificiales. Una innovación importante en el campo es el desarrollo de kits modulares de clonación que permiten el ensamblaje modular de constructos multigénicos a partir de una biblioteca de piezas moleculares estandarizadas. Los kits de herramientas modulares de clonación suelen estar diseñados para clonar unidades de transcripción monocistrónicas.

Este protocolo demuestra una forma generalizable de ensamblar unidades de transcripción policistrónica con el kit de herramientas de clonación. Esta estrategia de clonar una unidad de transcripción policistrónica permite que las secuencias codificantes se utilicen de forma flexible tanto en una unidad de transcripción individual como en arreglos policistrónicos. Para empezar, selecciona las piezas de Nivel 0 que se ensamblarán en una unidad de transcripción.

Estos deben incluir al menos un RBS, una secuencia de codificación y un terminador. Elige la posición en la que se ensamblará la unidad de transcripción en operón. En función de la posición elegida, selecciona el plásmido aceptor correspondiente y simula el ensamblaje Golden Gate en SnapGene.

En la reacción Golden Gate, se utiliza la enzima SAP1 para liberar el sitio de unión del ribosoma, la secuencia codificante y el terminador de sus respectivos plásmidos y abrir el plásmido aceptor. Ensamblar el sitio de unión del ribosoma, la secuencia codificante y el terminador en el plásmido del aceptor de corte. A continuación, para la reacción Golden Gate, usa una pipeta para añadir 50 femtomolos de cada inserto deseado y 50 femtomolos del plásmido aceptor.

Un microlitro de cada uno de 10x T4 ADN ligasa buffer, T4 ligasa y SAP1 en un tubo de reacción. Luego añade agua sin nucleasas para llevar el volumen final a 10 microlitros. Coloca el tubo en un termociclador.

Haz 25 ciclos a 37 grados Celsius durante tres minutos, 16 grados Celsius durante cuatro minutos y 50 grados Celsius durante 20 minutos. Luego inactiva las enzimas a 80 grados Celsius durante 20 minutos. Opcionalmente, se pipetean 0,5 microlitros de SAP1 a la reacción GG e incuba a 37 grados Celsius durante una hora.

Pipetear cinco microlitros de la reacción se mezclan en 50 microlitros de células químicamente competentes de E. coli. Realiza una transformación por choque térmico sumergiendo el tubo en un baño de agua a 42 grados Celsius durante 30 segundos, y luego coloca el tubo sobre hielo durante dos minutos. A continuación, incuba las células en un mililitro de medio durante una hora para ayudar a la recuperación.

La placa de 100 microlitros de la transformación se expande sobre una placa sinfín LB que contiene 100 microgramos por mililitro de ampicilina. Incuba la placa durante la noche a 37 grados Celsius. Al día siguiente, elige dos colonias blancas usando un lazo de inoculación o una punta de pipeta.

Inocúla cada uno en cinco mililitros de medio LB que contenga 100 microgramos por mililitro de ampicilina. Incubar durante la noche a 37 grados Celsius en una incubadora agitada a 250 revoluciones por minuto. Realiza una extracción de cuadros según las instrucciones del fabricante.

Digiera un microgramo de ADN plasmático extraído añadiendo un microlitro de 10x buffer digestivo y un microlitro de BBS1. Añade agua libre de nucleasas para obtener el volumen total de 10 microlitros e incubar. Ahora carga el plásmido digerido sobre un gel al 1% de agarosa y haz electroforesis a 100 voltios durante 35 minutos.

Luego toma la imagen del gel y confirma el conjunto correcto del plásmido. Para ensamblar una construcción de Nivel M, elige las unidades de transcripción de Nivel 1 que se van a ensamblar. Simula el ensamblaje Golden Gate liberando la primera y segunda unidad de transcripción y el enlace final usando la enzima BBS1.

Simultáneamente, se abre el plásmido aceptor y luego se ensamblan las tres partes en el plásmido aceptor para formar la unidad de transcripción policistrónica. El control negativo para el conjunto de plásmidos de Nivel 1, que carecía de una parte terminadora, no produjo colonias, mientras que la reacción completa produjo 292 colonias blancas y ninguna roja. El ensamblaje del constructo multigénico sin el segundo casete a 37 grados Celsius solo produjo dos colonias blancas, mientras que el ensamblaje completo produjo nueve colonias grandes y 435 colonias pequeñas.

A 30 grados Celsius, el control negativo para el ensamblaje multigénico produjo cuatro colonias blancas, mientras que la reacción completa produjo más de 1.500 colonias. El digesto BSA1 del plásmido aceptor PMA60 da la banda única esperada en 5.500 pares de bases. La digestión BSA1 de plásmidos de 24 colonias reveló que 23 de 24 mostraban el patrón de restricción correcto de dos bandas en aproximadamente 4.300 pares de bases y 1.700 pares de bases.

La imagen de fluorescencia mostró una fuerte fluorescencia verde y cian en colonias de placas que contenían el inductor de OC6, mientras que las placas sin inductor mostraron fluorescencia mínima o nula.